一种同时检测豆芽中6苄基腺嘌呤和4氯苯氧乙酸钠的方法.pdf

本发明涉及一种同时检测豆芽中6-苄基腺嘌呤和4-氯苯氧乙酸钠的方法，将待测豆芽破碎处理，破碎后置于器皿中加氢氧化钠水溶液和甲醇溶液，震荡摇匀后，进行光波萃取10s-3min，高速离心处理，取上清液经膜过滤得待测液，将待测液进入液相色谱串联质谱仪检测。本发明方法具有快速、高效、高灵敏度等特点，为市场豆芽质量安全监控提供了新的保障。

1.  一种同时检测豆芽中6-苄基腺嘌呤和4-氯苯氧乙酸钠的方法，其特征是，包括步骤如 下：
(1)样品前处理：将待测豆芽破碎处理，破碎后置于器皿中加氢氧化钠水溶液和甲醇， 震荡摇匀后，进行光波萃取10s-3min，高速离心处理，取上清液经膜过滤得待测液；
(2)将待测液进入液相色谱串联质谱仪检测
HPLC检测条件：
色谱柱：Eclipse Plus C18；
流动相：A相为0.1％的甲酸水，B相为乙腈；
流速：0.2mL/min；
柱温：30℃；
进样量：10μL；
梯度洗脱程序：0～4min，B相从25％升至65％，4～5min，B相从65％升至100％，5～7.2min， B相保持100％不变，7.2～7.3min，B相从100％降至25％，7.3～10min，B相保持25％不变；
MS/MS条件：
采用多反应监测模式；
离子源：电喷雾离子源；
6－苄基腺嘌呤采用正离子模式检测，4－氯苯氧乙酸钠采用负离子模式检测；
干燥气：N₂，干燥气温度：300℃，干燥气流速：10L/min；
雾化压力：30Psi；
毛细管电压：4000V；
6－苄基腺嘌呤和4－氯苯氧乙酸钠母离子及子离子参数见下表：


2.  根据权利要求1所述的一种同时检测豆芽中6-苄基腺嘌呤和4-氯苯氧乙酸钠的方法， 其特征是，步骤(1)所述的氢氧化钠水溶液的浓度为10mM，加入量为每克破碎豆芽0.5ml； 甲醇加入量为每克破碎豆芽0.5ml。

3.  根据权利要求1所述的一种同时检测豆芽中6-苄基腺嘌呤和4-氯苯氧乙酸钠的方法， 其特征是，所述的光波萃取为2min。

4.  根据权利要求1所述的一种同时检测豆芽中6-苄基腺嘌呤和4-氯苯氧乙酸钠的方法， 其特征是，所述的高速离心处理为先8000rpm离心10min；取上清液再12000rpm离心10min。

一种同时检测豆芽中6-苄基腺嘌呤和4-氯苯氧乙酸钠的方法
技术领域
本发明涉及一种豆芽中生长调节剂的检测方法。
背景技术
我国豆芽以作坊式生产为主，为了追求高利润，在豆芽生产过程中肆意添加植物生长调 节剂催发豆芽生长的现象时有发生。其中4-氯苯氧乙酸(4-CPA)、6-苄基腺嘌呤(6-BA)，是问 题豆芽培育过程中较常用的“AB粉”、“无根豆芽素”等的主要成分。4-CPA属内吸性植物 生长调节剂，能调节植物株内激素的平衡，刺激子房膨大，补充植物体内生长素不足，促进 生长。6-BA与植物内源激素结构性质相似，在豆芽生长过程中可以促进芽的形成、抑制根的 生长。人体摄入过多6-BA会刺激皮肤黏膜，出现恶心、呕吐等现象。国家质检总局159号 公告已明确指出，6-BA和4-CPA不得作为添加剂生产和使用。在生产豆芽过程中非法添加 “AB粉”、“无根豆芽素”等植物生长调节剂的“毒豆芽”事件已逐渐受到人们的关注，成为目前 食品安全领域的一个重大问题。
当前豆芽中6-BA和4-CPA的检测方法具有前处理方法繁琐,灵敏度差,只能检测单一组 分等缺点,如国家标准委员会发布的标准《GB/T23381-2009》只对对豆芽中的6-BA进行检 测，而且方法检出限高，难以满足高灵敏的检测要求。国家各相关部门也在积极研发多组分 植物生长调节剂的检测方法，例如，浙江省地方标准《DB33/T 625.3-2007》，然而，该标准针 对6-BA和4-CPA使用了不同的前处理技术和仪器分析方法，这势必将增加检测任务，消耗更 多的资源。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术不足，而提供一种同时检测豆芽中6-苄基腺嘌呤和4-氯苯 氧乙酸钠的方法，该方法具有快速、高效、高灵敏度等特点，为市场豆芽质量安全监控提供 了新的保障。
本发明采取的技术方案为：
一种同时检测豆芽中6-苄基腺嘌呤和4-氯苯氧乙酸钠的方法，包括步骤如下：
(1)样品前处理：将待测豆芽破碎处理，破碎后置于器皿中加氢氧化钠水溶液和甲醇， 震荡摇匀后，进行光波萃取10s-3min，高速离心处理，取上清液经膜过滤得待测液；
(2)将待测液进入液相色谱串联质谱仪检测
HPLC检测条件：
色谱柱：Eclipse Plus C18；
流动相：A相为0.1％(v/v)的甲酸水，B相为乙腈；
流速：0.2mL/min；
柱温：30℃；
进样量：10μL；
梯度洗脱程序：0～4min，B相从25％升至65％，4～5min，B相从65％升至100％，5～7.2min， B相保持100％不变，7.2～7.3min，B相从100％降至25％，7.3～10min，B相保持25％不变；
MS/MS条件：
采用多反应监测模式；
离子源：电喷雾离子源(+ESI)；
6－苄基腺嘌呤采用正离子模式检测，4－氯苯氧乙酸钠采用负离子模式检测；
干燥气：N₂，干燥气温度：300℃，干燥气流速：10L/min；
雾化压力：30Psi；
毛细管电压：4000V；
6－苄基腺嘌呤和4－氯苯氧乙酸钠母离子及子离子参数见下表：

上述方法中步骤(1)所述的氢氧化钠水溶液的浓度为10mM，加入量为每克破碎豆芽 0.5ml；甲醇加入量为每克破碎豆芽0.5ml。
所述的光波萃取优选2min。
所述的高速离心处理为先8000rpm离心10min；取上清液再12000rpm离心10min。
为了比较光波提取法和超声提取法对6-苄基腺嘌呤和4-氯苯氧乙酸钠的提取效率，向空 白黄豆芽样品中添加40和100ng/g的标准溶液，用超声辅助和光波辅助分别提取3min，其他实 验条件相同，比较目标物的峰面积。实验结果得出，光波提取的效果略高于超声提取，因此 使用光波辅助提取的前处理方法。
为研究不同的萃取时间对6-苄基腺嘌呤和4-氯苯氧乙酸钠的提取效率的影响，将光波萃 取时间由10s不断增加至2.5min，比较目标物峰面积变化。结果表明，在10s-2.0min内萃取时 间与峰面积成正比增加，光波时间超过2min后，峰面积基本不变。因此该实验光波萃取时间 优选为2min。
为了达到对6-苄基腺嘌呤和4-氯苯氧乙酸钠的最佳色谱分离效果，对常用流动相体系和 色谱柱进行了考察。实验对乙腈-水体系及甲醇水体系，实验结果表明使用乙腈-0.1％甲酸水 体系作为流动相时，色谱峰形对称，灵敏度高。对不同型号的色谱柱进行考察，发现使用Eclipse  Plus C18色谱柱的分离效果好且有良好的色谱峰形。
本发明基于光波辅助提取和高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)开发了一种同时前 处理和检测6-苄基腺嘌呤和4-氯苯氧乙酸钠的新方法，实现了豆芽中植物生长调节剂的多组 分检测。该方法具有快速、高效、高灵敏度等特点，为市场豆芽质量安全监控提供了新的保 障。
附图说明
图1为6－苄基腺嘌呤和4－氯苯氧乙酸钠MRM色谱图；
图2为不同的萃取时间对提取效率的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明。
实施例中使用的主要仪器有：Agilent-1200型快速分离高效液相色谱(Agilent公司)，6410 型三重串联四级杆质谱(Agilent公司)。乙腈(色谱纯，Tedia公司)。所有的实验试剂均在4℃ 下保存。
实施例1
(1)前处理过程
取待测豆芽样品放入组织破碎机中进行破碎处理，取破碎好的样品10g，置于50mL具 螺旋盖离心管中；加5mL 10mM氢氧化钠水溶液和5mL甲醇溶液，震荡摇匀后，进行光波 萃取2min(注意充分光照)，后8000rpm离心10min；取上清液1mL，置于1.5mL离心管中， 12000rpm离心10min,取上清液用0.45μm滤膜过滤，放入自动进样瓶中待测。
(2)将待测液进入液相色谱串联质谱仪检测
HPLC条件
色谱柱：Eclipse Plus C18(2.1mm×150mm，3.1μm，Agilent公司)。流动相：A相为0.1％ 的甲酸水，B相为乙腈。梯度洗脱程序：0～4min，B相从25％升至65％，4～5min，B相从65％ 升至100％，5～7.2min，B相保持100％不变，7.2～7.3min，B相从100％降至25％，7.3～10min，B 相保持25％不变。流速：0.2mL/min。柱温：30℃，进样量：10μL。
MS/MS条件
离子源：电喷雾离子源(+ESI)，6－苄基腺嘌呤采用正离子模式检测,4－氯苯氧乙酸钠 采用负离子模式检测。干燥气：N₂，干燥气温度：300℃，干燥气流速：10L/min，雾化压力： 30Psi，毛细管电压：4000V。采用多反应监测模式，6－苄基腺嘌呤和4－氯苯氧乙酸钠母离 子及子离子参数见表1，MRM谱图见图1。
表1 6－苄基腺嘌呤和4－氯苯氧乙酸钠

实施例2
测试步骤同实施例1，不同之处为改变光波萃取时间由10s不断增加至2.5min，目标物 峰面积变化如图2。
实施例3
测试步骤同实施例1，不同之处为碎裂电压在10V～150V改变，母离子的质荷比和不同 碰撞能量(0V～40V)，
实验方法如下：首先，在选择离子检测的模式下，输入样品母离子质荷比，优化碎裂电 压(10V～120V)，保证母离子的最大传输效率，即尽可能多到达碰撞池，具体实验结果见图 1、图2；然后，在子离子扫描模式下，输入母离子的质荷比和不同碰撞能量(0V～40V)，考 察不同碰撞能量对母离子和子离子峰强度的影响，选择母离子几乎消失，子离子强度最大时 的碰撞能量。
线性关系及检出限测试
取6-苄基腺嘌呤和4-氯苯氧乙酸钠标准储备液，精确配制一系列不同质量浓度的混合标 准溶液，于优化后的条件下分别进样测定，重复6次，以各物质定量离子峰面积的平均值(Y) 对被测组分的质量浓度(X，mg/mL)进行线性回归，得到回归方程、相关系数和线性范围； 以信噪比(S/N)＞3对应的浓度为检出限，(S/N)＞10对应的浓度作为定量限，得到6-苄 基腺嘌呤和4-氯苯氧乙酸钠的检出限和定量限。结果证明(表2)，本方法对6-苄基腺嘌呤的 检出限显著低于GB/T23381-2009，而对4-氯苯氧乙酸钠更明显低于DB33/T 625.3-2007。
表2.目标物的线性方程、线性范围、相关系数、定量限及检出限

a.GB/T23381-2009食品中6-苄基腺嘌呤的测定高效液相色谱法
b.DB33/T 625.3-2007无公害豆芽第3部分：6-苄基腺嘌呤残留量和4-氯苯氧乙酸钠残留量的 测定。
加标回收率：
在绿豆芽和黄豆芽各一份样品中加入6-苄基腺嘌呤和4-氯苯氧乙酸钠的标准溶液(3个 添加水平，20、100和500ng/g和8、40和200ng/g)，计算其回收率及精密度，重复测定3 次，结果如表3所示。
表3.6-苄基腺嘌呤和4-氯苯氧乙酸钠的空白添加回收率和精密度试验结果(n＝3)


a.回收率为基质相对回收率
实际样品的检测
利用本方法对4个不同地区的豆芽(绿豆芽和黄豆芽各2种)进行检测，均未检出6-苄 基腺嘌呤和4-氯苯氧乙酸钠。
本发明建立了高效液相色谱-三重串联四极杆质谱检测豆芽中6-苄基腺嘌呤和4-氯苯氧 乙酸钠的方法，该方法前处理过程简单快速，操作安全，且方法灵敏度高，结果可靠满足检 测要求，可实现豆芽中的6-苄基腺嘌呤和4-氯苯氧乙酸钠快速检测。