粒细胞髓过氧化物酶检测芯片.pdf

本发明涉及微流控细胞芯片的技术领域，公布了一种测定粒细胞表达髓过氧化物酶的芯片和测定试剂。细胞通过芯片结构和微流控流体使细胞分离并与特殊酶反应试剂作用，实现测定粒细胞内髓过氧化物酶活性。该配套试剂为一种化学混合溶液含有联苯胺浓度为100mmol／L，双氧水浓度为10％；芯片包括芯片底板、芯片框架和框架中细胞筛选支柱。夹在芯片盖与底座之间支柱的间距和位置，支柱厚度为1mm，间距为a=9nm；b=15nm；c=20nm。在芯片框架侧面分别连接微流控液体进入通道三个分别为流通进入通道、细胞进入通道和过氧化物酶试剂进入通道。流体流出通道。细胞收集通道，可收集小细胞、中细胞和大细胞。

1.  所述测定粒细胞髓过氧化物酶检测芯片，其特征在于配套试剂和芯片框架之间的粒细胞分离柱的高度和柱之间的间距。

2.  根据权利要求(1)所述的粒细胞髓过氧化检测芯片，其特征在于所述的芯片结构、框架(2)的分离支柱的结构和间距，含有三个微流控液体进样通道(及以上)，一个液体输出通道和三个细胞收集通道(及以上)。

粒细胞髓过氧化物酶检测芯片
技术领域
本发明涉及利用芯片测定粒细胞髓过氧化物酶的芯片。体现在本发明设计了分离粒细胞芯片，同时含有细胞酶反应结构，能够分别测定粒细胞内髓过氧化物酶活性。 
技术背景
细胞芯片是以细胞作为研究对象的一种生物芯片技术，它是为适应基因、分子时代对于探索生命科学需求而产生的新兴技术。细胞芯片即保持传统研究细胞方法的优点，又满足了高通量、大样本及快速获取细胞信息等特点。可用于研究特定基因及表达蛋白质与疾病之间的相互关系，对于疾病珍断、药物治疗靶点筛选、细胞定位、抗体药物筛选等方面有广泛的应用价值。 
粒细胞可以表达髓过氧化物酶，表达髓过氧化物酶与粒细胞的氧化代谢有关。测定髓过氧化物酶的方法有底物显色法、抗髓过氧化物酶抗体免疫标记法和髓过氧化物酶染色法，而这些方法只能够测定整体总量或者对于细胞的髓过氧化物酶进行定位，不能够同时分别测定粒细胞内表达髓过氧化物酶的活性。由于血液中存在10余种细胞，而骨髓中存在60余种类型细胞，能够测定不同类型细胞髓过氧化物酶具有临床意义。 
2002年7月17日公开，授予楼屹的《快速检测肾脏损害的尿蛋白芯片》专利号CN1359004A，公布了一种快速检测肾脏损害的尿蛋白芯片的测定方法，它由载体盒面板、载体盒背板和蛋白质试纸条组成，所述的面板下端为进样口、中部为观察口以及进样口和观察口之间的控样线，所述载体盒背 板内有扇形排列的四个载体槽，载体槽内分别放置检测白蛋白(ALB)、转铁蛋白(TF)、视黄醇结合蛋白(RBP)和尿NAG的尿蛋白试纸条，利用芯片技术集成化、高通量、并行的原理，将这些蛋白试纸条以平行或扇形方式任意组合，集成在一起，形成尿蛋白芯片，他能够一次性同时检测尿液中这四种蛋白。由于判定结果敏感度有限，本法测定结果只能够达到半定量。 
在2013年4月24日公开的黄晓波等发明专利《一种细胞微阵列芯片及其制备方法》，公开专利号CN103060175A，本专利公开了一种细胞微阵列芯片及其制备方法属于细胞芯片技术领域。其特征是由海藻酸凝胶制备的海藻酸凝胶细胞微阵列芯片，操作简便，可用于细胞组织化培养、化合物或药物的高通量筛选、新基因的发现、以及蛋白质组学研究等。制备方法是：(1)在玻璃板上涂敷一层海藻酸钠溶液，快速浸入氯化钙溶液中，浸泡5～30分钟形成凝胶模板。(2)制备一个上面排布有多个圆柱体的点阵模板，将圆柱体顶端浸泡在壳聚糖或聚赖氨酸溶液中5～30分钟后取出。(3)将圆柱体顶端压印在海藻酸凝胶模板上，通过静电络合反应形成络合物点阵模板。(4)将络合物点阵模板浸泡在细胞浓度为1×10⁵～1×10⁷/L的培养液中培养4～16小时，形成海藻酸凝胶细胞微阵列芯片。 
本发明的目的在于提供了一种粒细胞髓过氧化物酶检测微流控芯片及其测定试剂，可有效的克服以前芯片能够测定细胞生物性过程中不能够有效测定特定细胞类型表达生物信息的缺点。 
发明内容
本发明解决的技术问题是克服了在利用芯片技术测定粒细胞髓过氧化物酶过程中由于体液中，细胞类型复杂难以准确测定粒细胞表达髓过氧化物 酶活性。发明提出解决上述技术问题采用的技术方案是：本发明的配套试剂包括A：微流控溶液，100mmol/L pH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)。B：细胞悬液。C：髓过氧化物酶测定缓冲液包括：0.05mmol/L联苯胺溶液：10％双氧水溶液：100mmol/L pH7.4PBS，三者间比例为1：1：5。 
本发明试剂能够有利于与粒细胞髓过氧化物酶作用。上述试剂类型限定为三种，另外限定试剂输入的比例，测定过程中，A、B、C三种测定溶液输入微流控芯片需要保持一定比例，其比例为A：B：C＝5：1：0.1的比例进行输入。整体试剂输入速度为500ul/min。 
正常人血液中白细胞的数量在4.0一10.0×10⁹/L，当感染或白血病时可以达到20.0-100.0×10⁹个/L以上，而在胸腔积液、腹腔积液中粒细胞的数量明显减少，一般在1.0-4.0×10⁴个/L。在白细胞中存在嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞。在尿液中细胞更加复杂，包括粒细胞、鳞状上皮细胞、立方上皮细胞等多种细胞。 
粒细胞髓过氧化物酶检测芯片部分包括芯片上盖、框架、底座和细胞分离支柱。芯片框架为塑料材料制成框架结构，芯片底板为玻璃、高分子聚合材料、纤维素膜及石英玻片。 
在底板上附框架和框架支架，材料为高分子聚合材料成分，框架(2)高度为1mm，附着框架支架高度也为1mm。上述的两框架的厚度相同，但是底座与上盖之间存在由支架组成的细胞分离通道，其之间的间距分别为：a＝9nm；b＝15nm；c＝20nm，和细胞收集通道(15)、(16)、(17)，分离柱排列与底边形成一定角度，有利于流体力学作用细胞进行分类，输出通道内部空间可为圆形、椭圆形和方形，口径可不同。 
在芯片上盖和底座之间的支架框架(2)和框架(3)，利用粘合剂将芯 片粘合在上述两框架之间粘合，同时保障芯片支架的结构，包括7个分离支柱，排列与底座之间形成10-35度斜角，各个支柱之间保持特定距离。 
芯片支架(3)连接三个微流体输入通道分别为流体输入通道、细胞悬液输入通道、髓过氧化物酶试剂通道；流体输出通道和三个细胞收集通道，在分离柱排列通向收集细胞流出侧面，芯片内收集液储存空间为倒梯形、倒三角型空间，有利于细胞进行流出。 
本芯片法测定粒细胞髓过氧化物酶的方法，实现单个细胞测定粒细胞中表达髓过氧化物酶活性，填补测定粒细胞酶活性的空白，其敏感度可以测定10IU/cell以上。整个测定过程在1小时内完成，方法简便、快速、稳定。 
 附图说明
本说明书包括五幅附图 
图l芯片整体结构主视图 
图2芯片表盖透视示意图 
图3芯片支架透视示意图 
图4芯片框架外托透视示意图 
图5芯片底座透视示意图 
具体实施方式
参见附图1-5，本发明的粒细胞髓过氧化物酶检测芯片主要由(1)、(2)、(3)和(18)构成，配有三个微流控液体输入通道(4)、(5)和(6)，三个细胞收集通道(15)、(16)和(17)，一个微流控流体输出通道(7)。芯 片可采用有机材料，玻璃及石英材料等。下面以具体实实例进一步解释发明，但不限制本发明范围，本发明提供的一种粒细胞髓过氧化物酶检测芯片和配套试剂。 
芯片部分包括芯片上盖(1)、芯片框架(2、3)，在框架上分别连接三个微流控流通输入通道，三个细胞收集通道和一个流体输出通道、底板(18)三部分。其中所述粒细胞髓过氧化物酶检测芯片的框架为塑料框架(2、3)，所述的流体输入和输出通道为圆管形、方形通道。细胞收集通道为圆管形、方形管通道。流体输入通道三个，而输出为一个通道，总输入流通口径与输出口径总面积比例为1：1-10。框架中分离柱含有七个，各个支柱之间为圆形、椭圆形、方形，实用空间数量为六个，每个柱之间具有一定距离，a＝9nm；b＝15nm；c＝20nm，柱的高度为1mm。柱之间排列呈现10-35度斜角。细胞收集空间可以为倒梯形、倒三角形。 
本发明具体制备方法如下： 
1芯片的制备 
采用透光高分子有机材料，如聚苯乙烯等制备基片(1)，在其上采用微加工制备不规则形、方形或长方形的反应槽，按照设计要求设计输入、输出微流控通道的大小、形状，同时规划分离柱排列角度具有10-35度斜角。 
2细胞芯片制备 
将体液细胞制备一定含量的细胞悬液，例如血液与PBS的比例为1：1000-2000，按照输入速度为500μl/min的速度进入细胞芯片。在输入过程中，流体：细胞悬液：髓过氧化物酶试剂的比例为5：1：0.1的比例进行输入。细胞收集 
实例，2009年5月27日授予穆海东的名称为《一种男性多肿瘤标志物检测蛋白芯片的制备》公告号：CN201247246Y。2006年10月4日授予李泽 松等的名称为《肝纤维化相关血清标志物检测蛋白芯片》公开号：CN1841068A。详细的披露了一些抗原测定蛋白芯片的制备过程。 
1其步骤主要是： 
(1)准备硝基纤维素膜； 
(2)设计芯片，确定点阵排列方式和点样位置； 
(3)点样针从384孔板吸出抗体喷点于硝基纤维素膜上； 
(4)装配硝基纤维素膜，并且进行封闭、干燥、包装、保存。 
2测定具体制备步骤 
(1)检测指标抗原的确定 
肿瘤标志物CEA是由六段相似很高的肽段组合而成，选择其中A1+B1段基因工程表达；PSA、NSE、SCC-ag和CYFRA21-1均为长基因表达，FAP和CA19-9为肿瘤细胞分泌抗原。制备单克隆抗体。 
(2)点样制备具检测指标涂层的膜芯片 
用Gesim点样仪喷点，点样整从384孔板吸出抗体喷点于纤维素膜上，点阵形式为10×5矩形阵列，当点直径为0.1mm，点横向间距为0.6mm，抗体阵列的大小为6mm×mm；点样后贴膜，封闭，最后将芯片干燥、包装后于4℃保存。