一种检测化妆品中苔黑醛化合物的方法.pdf

本发明公开了一种检测化妆品中苔黑醛化合物的方法，包括以下步骤：向待测试样中加入醋酸铵水溶液，再加入5%三氯乙酸-乙腈溶液后超声提取，提取液离心，取上清液过微孔滤膜后进行高效液相色谱法测定。采用紫外检测器检测，检测波长为280nm。本发明的高效液相色谱法测定化妆品中苔黑醛化合物和氯化苔黑醛的方法快速、前处理简便、检出限低、回收率高。

1.   一种检测化妆品中苔黑醛化合物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将待测样本加入醋酸铵水溶液中，涡旋后再加入三氯乙酸水溶液与乙腈组成的混合提取液，再经涡旋、超声提取，得到提取液；
（2）将提取液离心，取上清用微孔膜过滤得到提取物溶液；
（3）以乙腈与水作为流动相，利用高效液相色谱分析法对所述提取物溶液进行检测；进行高效液相色谱分析时采用紫外检测器检测。

2.   根据权利要求1所述检测化妆品中苔黑醛化合物的方法，其特征在于：所述苔黑醛化合物为苔黑醛或者氯化苔黑醛。

3.   根据权利要求1所述检测化妆品中苔黑醛化合物的方法，其特征在于：步骤（1）中，醋酸铵水溶液的浓度为0.02 mol/L；对应每克待测样本醋酸铵水溶液的用量为0.75mL。

4.   根据权利要求1所述检测化妆品中苔黑醛化合物的方法，其特征在于：步骤（1）中，第一次涡旋的时间为30s；第二次涡旋的时间为60s；超声提取时间为15min。

5.   根据权利要求1所述检测化妆品中苔黑醛化合物的方法，其特征在于：步骤（1）的三氯乙酸水溶液中三氯乙酸的质量分数为5%。

6.   根据权利要求1所述检测化妆品中苔黑醛化合物的方法，其特征在于：步骤（1）的三氯乙酸水溶液与乙腈组成的混合提取液中，三氯乙酸水溶液、乙腈的体积比为75∶25。

7.   根据权利要求1所述检测化妆品中苔黑醛化合物的方法，其特征在于：步骤(2)中，离心时的转速为10000 rpm，时间为10 min；微孔膜的孔径为0.22μm。

8.   根据权利要求1所述检测化妆品中苔黑醛化合物的方法，其特征在于：步骤(3)中采用紫外检测器检测时，检测波长为280 nm。

9.   根据权利要求1所述检测化妆品中苔黑醛化合物的方法，其特征在于：步骤(3)中高效液相色谱分析提取物溶液时采用梯度洗脱，梯度程序为：0～8 min，25～90 %  乙腈；8～11 min，90 % 乙腈；11～14 min，25 % 乙腈。

一种检测化妆品中苔黑醛化合物的方法
技术领域
本发明属于化妆品分析领域，具体涉及一种检测化妆品中苔黑醛化合物的方法。
背景技术
地衣（lichens）是寄生在树干上的一种真菌（fungi）和藻类（algae）高度结合的共生复合有机体，含有大量的缩酚酸、缩酚酮和脂类化合物，经水解、醇解或脱羧等作用，可产生具有独特香气的小分子单芳基化合物，是一种十分重要的天然香料。在国际天然香料市场上，地衣香料可分为橡苔（oak moss）提取物和树苔（tree moss）提取物两类，是多款知名经典香水配方中必不可少的香味来源。
欧盟委员会在化妆品规程( Council Directive 76 /768 /EEC ) 第7 次修正案中提出了26 种致敏原（包括24种化合物和2种天然提取物）在化妆品中的最高限量，要求在驻留类化妆品中其含量不得高于0. 001%，非驻留类化妆品中含量不得高于0. 01%。苔黑醛（化学名称2,6-二羟基-4-甲基苯甲醛，CAS 526-37-4）和氯化苔黑醛（化学名称3-氯-2,6-二羟基-4-甲基苯甲醛，CAS 57074-21-2）两种苔黑醛化合物是限制使用的2种天然提取物（树苔天然萃取物和橡苔天然提取物）中的两种核心香味成分，已有多篇文献报道其具有致敏性。根据欧盟消费者安全科学委员会的数据，已有多起致敏案例发生，约有1% ~ 3%的人群会对这类成分产生过敏症状，导致皮肤发炎、出疹或干裂。2014年7月欧盟宣布，由于可能引发过敏，从2015年起正式禁用苔黑醛化合物。
为了保护化妆品消费安全，有效监控化妆品中致敏芳香剂苔黑醛或者氯化苔黑醛的使用，采用有效手段检测化妆品中苔黑醛或者氯化苔黑醛的成分是关键。现有技术多采用利用气相色谱-质谱（GC-MS）分析化妆品中苔黑醛或者氯化苔黑醛，但需要先衍生、操作繁琐，难以满足实际工作中快速分析的需要。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测化妆品中苔黑醛化合物的方法，该方法样品前处理简便快捷、检测限低，回收率高；能有效地检测出化妆品中的苔黑醛或者氯化苔黑醛，为化妆品产品质量控制和产品安全监测提供必要的技术支持，从而保护化妆品的消费安全。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种检测化妆品中苔黑醛化合物的方法，包括如下步骤：
（1）将待测样本加入醋酸铵水溶液中，涡旋后再加入三氯乙酸水溶液与乙腈组成的混合提取液，再经涡旋、超声提取，得到提取液；
（2）将提取液离心，取上清用微孔膜过滤得到提取物溶液；
（3）以乙腈与水作为流动相，利用高效液相色谱分析法对所述提取物溶液进行检测；进行高效液相色谱分析时采用紫外检测器检测。
上述技术方案中，步骤（1）中，醋酸铵水溶液的浓度为0.02 mol/L；对应每克待测样本醋酸铵水溶液的用量为0.75mL。
上述技术方案中，步骤（1）中，第一次涡旋的时间为30 s；第二次涡旋的时间为60 s；超声提取时间为15 min。
上述技术方案中，步骤（1）中，三氯乙酸水溶液中三氯乙酸的质量分数为5%；三氯乙酸水溶液与乙腈组成的混合提取液中，三氯乙酸水溶液、乙腈的体积比为75∶25。
上述技术方案中，步骤(2)中，离心时的转速为10000 rpm，时间为10 min；微孔膜的孔径为0.22μm。
上述技术方案中，采用紫外检测器检测时，检测波长为280 nm。
上述技术方案中，步骤(3)中高效液相色谱分析提取物溶液时采用梯度洗脱，梯度程序为：0～8 min，25～90 %  乙腈；8～11 min，90 % 乙腈；11～14 min，25 % 乙腈。
本发明中，苔黑醛化合物为苔黑醛或者氯化苔黑醛，根据高效液相色谱可以检测化妆品中是否含有苔黑醛化合物，也可以得到化妆品中苔黑醛化合物的含量。以苔黑醛为例，具体方法是，采用苔黑醛标准品由高效液相色谱分析获得不同苔黑醛浓度下高效液相色谱检测到的苔黑醛对应峰的峰面积，制备标准曲线；然后对待测样本的提取物溶液进行高效液相色谱检测，获得其对应峰的峰面积，再与标准曲线对比获得待测样本中苔黑醛的浓度，再经过计算得出化妆品中苔黑醛的含量；其中，苔黑醛标准品可以将苔黑醛稀释成不同浓度梯度的乙腈-水溶液制成。将苔黑醛换为氯化苔黑醛，亦可得出化妆品中氯化苔黑醛的含量。
通过高效液相色谱分析法得到待测样液中苔黑醛或氯化苔黑醛的质量浓度，然后按照以下公式计算化妆品中苔黑醛或氯化苔黑醛含量：

式中：
W——化妆品中苔黑醛或氯化苔黑醛质量分数，mg/kg；
c ——待测样品中苔黑醛或氯化苔黑醛的质量浓度，mg/L；
V ——样品定容体积，mL；
m ——样品用量，g。
采用上述技术方案，对化妆品中苔黑醛化合物的检出限为5 mg/kg，回收率为 77.4 ～ 96.3 %，相对标准偏差(RSD)为1.41 ～ 4.63 %。
本发明中，苔黑醛、氯化苔黑醛化学结构式相似，对于液相色谱、紫外光检测的条件也接近，对化妆品样本进行一次检测即可得知化妆品中是否含有苔黑醛化合物，也可以得到化妆品中苔黑醛化合物的含量；被检测化妆品基质没有品种、样式的限制，其可以是霜膏、乳液、水剂化妆品。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点:
1．本发明首次提供了一种采用液相色谱检测化妆品中苔黑醛化合物的方法，对化妆品产品质量控制和产品安全监测提供必要的技术支持，对保护化妆品的消费安全具有积极的意义。
2．本发明在样品前处理时采用醋酸铵水溶液可以使待测样品分散均匀，利于后续的有效提取，采用三氯乙酸水溶液-乙腈混合溶液作为提取液，能够有效提取化妆品中的苔黑醛化合物，排除其余组分的干扰，同时还可以沉淀样品中的蛋白质，提取液澄清，过膜后即可直接上机测试，且提取液和色谱分离中所用的起始流动相强度相当，方便快捷又避免了因溶剂强度不匹配造成的峰展宽；采用高效液相色谱进行分析时，分离时间短，样品中杂质对目标化合物基本无干扰，首次利用紫外检测器检测，检测波长为280 nm，可以高灵敏检测出苔黑醛化合物。
3. 本发明公开的方法对化妆品中苔黑醛化合物的检出限低至5 mg/kg，在多种基质中的加标回收率均超过77 %，相对标准偏差(RSD)为1.41～4.63 %；检测结果准确，样品前处理简便有效，分析时间短，灵敏度高，能够满足实际化妆品中苔黑醛化合物检测的要求。
附图说明
图1为实施例一提供的苔黑醛的浓度-液相色谱峰面积的相互关系图；
图2为实施例一提供的氯化苔黑醛的浓度-液相色谱峰面积的相互关系图；
图3为实施例一提供的苔黑醛化合物标准溶液液相色谱图；
图4为实施例二中霜膏供试样品的液相色谱图；
图5为实施例二中乳液供试样品的液相色谱图；
图6为实施例二中水剂供试样品的液相色谱图；
图7为实施例三中添加苔黑醛化合物的霜膏供试样品的液相色谱图；
图8为实施例三中添加苔黑醛化合物的乳液供试样品的液相色谱图；
图9为实施例三中添加苔黑醛化合物的水剂供试样品的液相色谱图。
具体实施方式
实施例一  建立苔黑醛化合物标准曲线
将50 mg苔黑醛（纯度 ≥ 85％）溶于乙腈配制成浓度为1000 μg/mL的标准储备液。分别移取标准储备溶液用乙腈-水（75/25，V/V）配制成浓度分别为0.1，0.2，0.5，1.0，5.0，10，50 mg/L共7个浓度的标准工作溶液，取10 μL进样按液相色谱条件进行测定，每个系列进样3次，取平均峰面积值。
液相色谱条件：
高效液相色谱仪，（安捷伦1290，美国安捷伦公司）；
色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18，100 × 2.1mm(内径)，1.8 μm(粒径)；
流动相：A：水；B：乙腈；
洗脱方式：梯度洗脱：0 ~ 8 min，25~ 90 %  乙腈，8 ~ 11 min，90 % 乙腈，11 ~ 14 min，25 % 乙腈；
流速：0.2 mL/min；
紫外检测条件：检测波长：280 nm；
柱温：35℃；
进样量：10 μL。
以色谱峰的峰面积为纵坐标，与其对应的苔黑醛浓度为横坐标作图，绘制标准工作曲线，求得回归方程分别为y = 65.4 x-3.85。
将50 mg氯化苔黑醛（纯度 ≥ 85％）溶于乙腈配制成浓度为1000 μg/mL的标准储备液。分别移取标准储备溶液用乙腈-水（75/25，V/V）配制成浓度分别为0.1，0.2，0.5，1.0，5.0，10，50 mg/L共7个浓度的标准工作溶液，取10 μL进样按液相色谱条件进行测定，每个系列进样3次，取平均峰面积值。
液相色谱条件：
高效液相色谱仪，（安捷伦1290，美国安捷伦公司）；
色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18，100 × 2.1mm(内径)，1.8 μm(粒径)；
流动相：A：水；B：乙腈；
洗脱方式：梯度洗脱：0 ~ 8 min，25~ 90 %  乙腈，8 ~ 11 min，90 % 乙腈，11 ~ 14 min，25 % 乙腈；
流速：0.2 mL/min；
紫外检测条件：检测波长：280 nm；
柱温：35℃；
进样量：10 μL。
以色谱峰的峰面积为纵坐标，与其对应的氯化苔黑醛浓度为横坐标作图，绘制标准工作曲线，求得回归方程分别为y = 41.4 x-2.58。
如附图1、2所示，为紫外检测器检测到的峰面积与苔黑醛化合物浓度的关系曲线，可见，在0.1 ~ 50 mg/L浓度范围内，苔黑醛化合物的浓度值与响应峰面积值之间的相关系数分别为0.999 4和0.999 3，呈良好的线性关系。苔黑醛化合物的检出限均为5 mg/kg，能够满足化妆品成分测试的要求。
实施例二 化妆品中苔黑醛化合物的检测
(一) 试样处理
称取待测样本0.20 g（精确至0.001 g），置于10 mL塑料离心管中，加0.15 mL 0.02 mol/L的醋酸铵水溶液，涡旋30 s，再加5%三氯乙酸-乙腈混合提取液（70:30, V/V）1.85 mL，涡旋60 s后超声提取15 min，然后以10000 rpm转速离心10 min，取上清液通过0.22 μm微孔滤膜，得到提取物溶液，备用；上述待测样本分别为霜膏、乳液以及水剂。
(二) 液相色谱条件
高效液相色谱仪，（安捷伦1290，美国安捷伦公司）；
色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18，100 × 2.1mm(内径)，1.8 μm(粒径)；
流动相：A：水；B：乙腈；
洗脱方式：梯度洗脱：0 ~ 8 min，25~ 90 %  乙腈，8 ~ 11 min，90 % 乙腈，11 ~ 14 min，25 % 乙腈；
流速：0.2 mL/min；
紫外检测条件：检测波长：280 nm；
柱温：35℃；
进样量：10 μL。
 (三)试样测定
用自动进样器准确吸取10 μL提取物溶液注入高效液相色谱仪，按色谱条件进行测定，记录色谱峰的保留时间和峰面积。
苔黑醛化合物标准品色谱图参见附图3所示，从图中可以看出苔黑醛化合物苔黑醛、氯化苔黑醛标准品在280 nm下检测到的出峰时间是3.50 min和4.53 min。附图4～6分别为在280 nm波长下检测的霜膏、乳液以及水剂化妆品的色谱图，结果显示，所有化妆品基质中均未检测到苔黑醛化合物。
实施例三 添加浓度为25mg/kg苔黑醛和25mg/kg氯化苔黑醛的化妆品中苔黑醛化合物的检测
(一) 试样处理
以与实施例二中来源相同的霜膏、乳液以及水剂作为基质，制备含有浓度为25 mg/kg苔黑醛和25mg/kg氯化苔黑醛的霜膏、乳液以及水剂待测样本。
称取待测样本0.20 g（精确至0.001 g），置于10 mL塑料离心管中，加0.15 mL 0.02 mol/L的醋酸铵水溶液，涡旋30 s，再加5%三氯乙酸-乙腈混合提取液（70:30, V/V）1.85 mL，涡旋60 s后超声提取15 min，然后以10000 rpm转速离心10 min，取上清液通过0.22 μm微孔滤膜，得到提取物溶液，备用。
(二) 液相色谱条件
高效液相色谱仪，（安捷伦1290，美国安捷伦公司）；
色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18，100 × 2.1mm(内径)，1.8 μm(粒径)；
流动相：A：水；B：乙腈；
洗脱方式：梯度洗脱：0 ~ 8 min，25~ 90 %  乙腈，8 ~ 11 min，90 % 乙腈，11 ~ 14 min，25 % 乙腈；
流速：0.2 mL/min；
紫外检测条件：检测波长：280 nm；
柱温：35℃；
进样量：10 μL。
 (四)试样测定
用自动进样器准确吸取10 μL提取物溶液注入高效液相色谱仪，按色谱条件进行测定，记录色谱峰的保留时间和峰面积。
附图7～9分别为苔黑醛化合物在上述霜膏、乳液以及水剂样式化妆品中的出峰情况，与附图2比较，结果显示，添加苔黑醛化合物的化妆品样品基质，均可检测到苔黑醛（3.50 min处）和氯化苔黑醛（4.53min处）的色谱峰。
(五)结果计算
将待测样本液相色谱图中的峰面积带入实施例一得到的标准曲线得出待测样液中苔黑醛化合物的质量浓度，然后按照以下公式计算化妆品中苔黑醛化合物含量：

式中：
W（苔黑醛或氯化苔黑醛）——化妆品中苔黑醛或氯化苔黑醛质量分数，mg/kg；
c ——从标准曲线上查得的待测样液中苔黑醛或氯化苔黑醛的质量浓度，mg/L；
V ——样品定容体积，为2 mL；
m ——样品用量，为0.2g。
经计算，添加浓度为25 mg/kg苔黑醛和25mg/kg氯化苔黑醛的霜膏、乳液以及水剂待测样本的实际测得值分别为：苔黑醛，22.575 mg/kg，22.075 mg/kg和22.300 mg/kg；氯化苔黑醛，24.275 mg/kg，22.575 mg/kg和24.075 mg/kg。
实施例四 化妆品中苔黑醛化合物的检出限、回收率与精密度
按照加标样品10倍信噪比的计算方法，本方法对苔黑醛化合物的检出限为5 mg/kg。
准确度指测定值（平均值）与真实值的接近程度，表示分析结果的正确性。采用标准添加法，在化妆品中添加3个不同水平浓度的苔黑醛化合物进行回收率试验。每个加标水平重复测定6次，同时作空白实验，以回收率大于75 %为标准；精密度指用方法重复测定同一均质样品所得的测定值彼此接近程度，表示分析结果的重复性，常用相对标准偏差（RSD）表示。回收率和精密度参见表1。
              表1 苔黑醛化合物回收率和精密度试验结果（n = 6）

表1结果表明：在基质加标试验中，在三种化妆品产品基质中的加标回收率良好；从相对标准偏差实验数据可看出，针对三种不同基质的实验平行性良好。
综上，本发明提供的检测化妆品中苔黑醛化合物含量的方法中，样品前处理简便快捷，能有效提取出化妆品中的苔黑醛化合物，检出限低至5 mg/kg，回收率均在75 %以上，相对偏差小；适用于不同类型化妆品中苔黑醛化合物含量的准确测定，从而为化妆品产品质量控制和产品安全监测提供必要的技术支持，进而保护化妆品的消费安全。