一种PH释放型免疫传感器的制备方法及应用.pdf

本发明涉及一种pH释放型免疫传感器的制备方法及应用，属于新型生物传感检测技术。具体是把氧化还原探针硫堇封装在介孔二氧化硅-Au的介孔内，得到检测抗体标记物—介孔二氧化硅-Au，制备一种检测肿瘤标志物的夹心型电化学免疫传感器。为检测肿瘤标志物开辟了新的检测方法。

1.  一种pH释放型免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）依次用1.0、0.3、0.05 μm的三氧化二铝抛光粉对磁电极进行抛光处理，用超纯水清洗干净，然后将电极置于5 mmol/L铁氰化钾溶液中，在-0.2~0.6 V电位下扫描，使峰电位差小于110 mV；
（2）取6 μL、0.5~3 mg/mL的氨基化四氧化三铁溶液滴加到电极表面，室温下晾干；
（3）滴加3 μL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC溶液与N-羟基琥珀酰亚胺NHS溶液的混合液到电极表面，再继续滴加6 μL、5~10 μg/mL的肿瘤标志物捕获抗体，4℃下晾干，超纯水冲洗；
所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC溶液与N-羟基琥珀酰亚胺NHS溶液的浓度均为0.1 mol/L，其体积比为1~4 : 1；
（4）用3 μL、质量分数为0.5~1%的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，4℃下晾干，超纯水冲洗；
（5）将6 μL的一系列不同浓度的肿瘤标志物溶液滴加到电极表面，用于和抗体的特异性识别，室温下孵化1 h，超纯水冲洗；
（6）继续滴加4~6 μL检测抗体孵化物—介孔二氧化硅-Au-Ab₂溶液至电极表面，置于4℃冰箱中孵化1 h，清洗后，晾干，制得一种pH释放型免疫传感器。

2.  如权利要求1所述的一种pH释放型免疫传感器的制备方法，所述检测抗体孵化物—介孔二氧化硅-Au-Ab₂溶液的制备，其特征在于，包括以下步骤：
（1）介孔二氧化硅的制备
将0.3~0.7 g的CTAB溶于200 mL的超纯水中，加入1~2 mL、2.0 mol/L的NaOH，于80℃回流反应20 min，随后加入1.5~3.0 mL的四乙氧基硅烷，继续反应2 h生成白色沉淀，为了去除溶液中残留的CTAB，得到的沉淀重新分散在1.5 mL、质量分数为37%的HCl和75~100 mL的甲醇的混合液中，80℃下回流10~12 h，将混合物离心，经水和甲醇洗涤数次，35~45℃下真空干燥，制得介孔二氧化硅，粒径大小为100 nm左右，孔径大小为5 nm左右；
（2）缩醛链接器修饰的介孔二氧化硅MSN-Aetal的制备
将0.1~0.3 g的介孔二氧化硅分散于20 mL乙醇中，加入0.2~1 mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷，80℃回流反应12 h，混合物经离心、洗涤、45℃下真空干燥，得到氨基化的介孔二氧化硅；
将0.1~0.3 g氨基化的介孔二氧化硅加到10 mL的二甲基亚砜溶液中，随后加入50~100 mg丁二酸酐和50~100 mg三乙胺，40℃下反应48 h，得到的固体经乙醇洗涤，真空干燥得到羧基化的介孔二氧化硅；
分别将20~80 mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和10~30 mg的N-羟基琥珀酰亚胺NHS溶于3 mL超纯水中，加入50~100 mg羧基化的介孔二氧化硅，80~130 mg的3,9-双(3-氨丙基)-2,4,8,10-四氧杂螺[5.5]十一烷，室温下搅拌8 h，沉淀经洗涤干燥得到缩醛链接器修饰的介孔二氧化硅MSN-Aetal；
（3）羧基功能化金Au-COOH的制备
将20 mL、1%的HAuCl₄和0.5 mmol巯基琥珀酸分散于85 mL的去氧甲醇中，在搅拌下，将25 mL、0.2 mol/L的NaBH₄溶液滴加到上述溶液中，得到的深棕色沉淀经乙醇洗涤后，真空干燥，制得羧基功能化金Au-COOH；
（4）检测抗体标记物—介孔二氧化硅-Au的制备
将10~20 mg的缩醛链接器修饰的介孔二氧化硅MSN-Aetal加入到0.5~3mmol/L、1 mL的硫堇水溶液中，室温下搅拌12 h，加入4~10 mg的羧基功能化金Au-COOH、10 mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和5 mg的N-羟基琥珀酰亚胺NHS，继续搅拌8 h，混合物经离心洗涤直到上清液为无色后，将沉淀重新分散在1 mL的超纯水中，成功的将硫堇封装在介孔二氧化硅-Au中，制得检测抗体标记物介孔二氧化硅-Au；
（5）检测抗体孵化物—介孔二氧化硅-Au-Ab₂溶液的制备
将1 mL的检测抗体标记物介孔二氧化硅-Au与1 mL、10 μg/mL的检测抗体溶液混合后，在4℃的条件下孵化12 h，离心后，将沉淀重新分散在1 mL、pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液中，保存在4℃的冰箱中备用。

3.  如权利要求1所述的制备方法制备的免疫传感器，用于肿瘤标志物的检测，其特征在于，包括以下分析步骤：
（1）将权利要求1所制备的免疫传感器浸泡在0.5 mL、pH=3.7的醋酸盐缓冲溶液12 h；
（2）采用三电极体系，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极作为辅助电极，导电玻璃作为工作电极，采用微分脉冲伏安法对上述浸泡液进行扫描测试，将电压设置为-0.4~0.6 V，记录电流的变化，绘制工作曲线；
（3）将待测样品溶液代替肿瘤标志物抗原标准溶液进行测试。

4.  如权利要求1所述的一种pH释放型免疫传感器的制备方法，所述肿瘤标志物选自下列之一：CD146、AFP、CA153、CA125。

一种pH释放型免疫传感器的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种pH释放型免疫传感器的制备方法及应用。具体是将氧化还原探针硫堇封装在介孔二氧化硅-Au中，利用硫堇的氧化还原特性来对肿瘤标志物进行检测，制备一种检测肿瘤标志物的释放型免疫传感器，属于新型功能材料与生物传感检测技术领域。
背景技术
目前电化学免疫传感器已经广泛应用于肿瘤标志物的检测，释放型免疫传感器是一种比较新颖的检测肿瘤标志物的方法，因此受到更加广泛的关注。
近年来，介孔硅材料由于其具有较大的比表面积，较高的孔容和可调节的孔径，受到了吸附、传感等领域的广泛关注。因此，利用其具有良好的吸附性能来对硫堇进行吸附，并用羧基功能化金Au-COOH对其孔道进行封闭，使得硫堇稳定在介孔二氧化硅的孔道内，介孔二氧化硅-Au作为传感器制作中的检测抗体标记物，制得检测肿瘤标志物的免疫传感器，利用pH控制孔道的开和关，来达到检测的目的。
发明内容
 本发明的目的之一是制备一种pH释放型免疫传感器。
 本发明的目的之二是将该pH释放型免疫传感器应用于肿瘤标志物的检测。
本发明的技术方案
1．一种pH释放型免疫传感器的制备方法
（1）依次用1.0、0.3、0.05 μm的三氧化二铝抛光粉对磁电极进行抛光处理，用超纯水清洗干净，然后将电极置于5 mmol/L铁氰化钾溶液中，在-0.2~0.6 V电位下扫描，使峰电位差小于110 mV；
（2）取6 μL、0.5~3 mg/mL的氨基化四氧化三铁溶液滴加到电极表面，室温下晾干；
（3）滴加3 μL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC溶液与N-羟基琥珀酰亚胺NHS溶液的混合液到电极表面，再继续滴加6 μL、5~10 μg/mL的肿瘤标志物捕获抗体，4℃下晾干，超纯水冲洗；
所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC溶液与N-羟基琥珀酰亚胺NHS溶液的浓度均为0.1 mol/L，其体积比为1~4 : 1；
（4）用3 μL、质量分数为0.5~1%的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，4℃下晾干，超纯水冲洗；
（5）将6 μL的一系列不同浓度的肿瘤标志物溶液滴加到电极表面，用于和抗体的特异性识别，室温下孵化1 h，超纯水冲洗；
（6）继续滴加4~6 μL检测抗体孵化物—介孔二氧化硅-Au-Ab₂溶液至电极表面，置于4℃冰箱中孵化1 h，清洗后，晾干，制得一种pH释放型免疫传感器；
2．检测抗体孵化物—介孔二氧化硅-Au-Ab₂溶液的制备
（1）介孔二氧化硅的制备
将0.3~0.7 g的CTAB溶于200 mL的超纯水中，加入1~2 mL、2.0 mol/L的NaOH，于80℃回流反应20 min，随后加入1.5~3.0 mL的四乙氧基硅烷，继续反应2 h生成白色沉淀，为了去除溶液中残留的CTAB，得到的沉淀重新分散在1.5 mL、质量分数为37%的HCl和75~100 mL的甲醇的混合液中，80℃下回流10~12 h，将混合物离心，经水和甲醇洗涤数次，35~45℃下真空干燥，制得介孔二氧化硅，粒径大小为100 nm左右，孔径大小为5 nm左右；
（2）缩醛链接器修饰的介孔二氧化硅MSN-Aetal的制备
将0.1~0.3 g的介孔二氧化硅分散于20 mL乙醇中，加入0.2~1 mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷，80℃回流反应12 h，混合物经离心、洗涤、45℃下真空干燥，得到氨基化的介孔二氧化硅；
将0.1~0.3 g氨基化的介孔二氧化硅加到10 mL的二甲基亚砜溶液中，随后加入50~100 mg丁二酸酐和50~100 mg三乙胺，40℃下反应48 h，得到的固体经乙醇洗涤，真空干燥得到羧基化的介孔二氧化硅；
分别将20~80 mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和10~30 mg的N-羟基琥珀酰亚胺NHS溶于3 mL超纯水中，加入50~100 mg羧基化的介孔二氧化硅，80~130 mg的3,9-双(3-氨丙基)-2,4,8,10-四氧杂螺[5.5]十一烷，室温下搅拌8 h，沉淀经洗涤干燥得到缩醛链接器修饰的介孔二氧化硅MSN-Aetal；
（3）羧基功能化金Au-COOH的制备
将20 mL、1%的HAuCl₄和0.5 mmol巯基琥珀酸分散于85 mL的去氧甲醇中，在搅拌下，将25 mL、0.2 mol/L的NaBH₄溶液滴加到上述溶液中，得到的深棕色沉淀经乙醇洗涤后，真空干燥，制得羧基功能化金Au-COOH；
（4）检测抗体标记物—介孔二氧化硅-Au的制备
将10~20 mg的缩醛链接器修饰的介孔二氧化硅MSN-Aetal加入到0.5~3mmol/L、1 mL的硫堇水溶液中，室温下搅拌12 h，加入4~10 mg的羧基功能化金Au-COOH、10 mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和5 mg的N-羟基琥珀酰亚胺NHS，继续搅拌8 h，混合物经离心洗涤直到上清液为无色后，将沉淀重新分散在1 mL的超纯水中，成功的将硫堇封装在介孔二氧化硅-Au中，制得检测抗体标记物介孔二氧化硅-Au；
（5）检测抗体孵化物—介孔二氧化硅-Au-Ab₂溶液的制备
将1 mL的检测抗体标记物介孔二氧化硅-Au与1 mL、10 μg/mL的检测抗体溶液混合后，在4℃的条件下孵化12 h，离心后，将沉淀重新分散在1 mL、pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液中，保存在4℃的冰箱中备用。
3．肿瘤标志物的检测方法
（1）将权利要求1所制备的免疫传感器浸泡在0.5 mL、pH=3.7的醋酸盐缓冲溶液12 h；
（2）采用三电极体系，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极作为辅助电极，导电玻璃作为工作电极，采用微分脉冲伏安法对上述浸泡液进行扫描测试，将电压设置为-0.4~0.6 V，记录电流的变化，绘制工作曲线；
（3）将待测样品溶液代替肿瘤标志物抗原标准溶液进行测试。
上述肿瘤标志物选自下列之一：CD146、AFP、CA153、CA125。
本发明的有益成果
（1）基底采用的是具有磁性的氨基化四氧化三铁，可以很稳定的吸附在磁电极上，并且其具有良好的生物相容性和稳定性。
（2）介孔二氧化硅具有大的比表面积、良好的吸附能力和生物相容性，有利于将大量的硫堇封装在介孔二氧化硅-Au中，防止了硫堇的泄露，利用调节pH来对孔道的开关进行控制，提高了传感器的灵敏度。
（3）本发明制备的电化学免疫传感器用于肿瘤标志物的检测，响应时间短，检测限低，线性范围宽，可以实现简单、快速、高灵敏和特异性检测。
具体实施方式
实施例1一种pH释放型免疫传感器的制备方法
（1）依次用1.0、0.3、0.05 μm的三氧化二铝抛光粉对磁电极进行抛光处理，用超纯水清洗干净，然后将电极置于5 mmol/L铁氰化钾溶液中，在-0.2~0.6 V电位下扫描，使峰电位差小于110 mV；
（2）取6 μL、0.5 mg/mL的氨基化四氧化三铁溶液滴加到电极表面，室温下晾干；
（3）滴加3 μL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC溶液与N-羟基琥珀酰亚胺NHS溶液的混合液到电极表面，再继续滴加6 μL、5 μg/mL的肿瘤标志物捕获抗体，4℃下晾干，超纯水冲洗；
所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC溶液与N-羟基琥珀酰亚胺NHS溶液的浓度均为0.1 mol/L，其体积比为1 : 1；
（4）用3 μL、质量分数为0.5%的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，4℃下晾干，超纯水冲洗；
（5）将6 μL的一系列不同浓度的肿瘤标志物溶液滴加到电极表面，用于和抗体的特异性识别，室温下孵化1 h，超纯水冲洗；
（6）继续滴加4 μL检测抗体孵化物—介孔二氧化硅-Au-Ab₂溶液至电极表面，置于4℃冰箱中孵化1 h，清洗后，晾干，制得一种pH释放型免疫传感器；
实施例2一种pH释放型免疫传感器的制备方法
（1）依次用1.0、0.3、0.05 μm的三氧化二铝抛光粉对磁电极进行抛光处理，用超纯水清洗干净，然后将电极置于5 mmol/L铁氰化钾溶液中，在-0.2~0.6 V电位下扫描，使峰电位差小于110 mV；
（2）取6 μL、1 mg/mL的氨基化四氧化三铁溶液滴加到电极表面，室温下晾干；
（3）滴加3 μL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC溶液与N-羟基琥珀酰亚胺NHS溶液的混合液到电极表面，再继续滴加6 μL、8 μg/mL的肿瘤标志物捕获抗体，4℃下晾干，超纯水冲洗；
所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC溶液与N-羟基琥珀酰亚胺NHS溶液的浓度均为0.1 mol/L，其体积比为3 : 1；
（4）用3 μL、质量分数为0.8%的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，4℃下晾干，超纯水冲洗；
（5）将6 μL的一系列不同浓度的肿瘤标志物溶液滴加到电极表面，用于和抗体的特异性识别，室温下孵化1 h，超纯水冲洗；
（6）继续滴加5 μL检测抗体孵化物—介孔二氧化硅-Au-Ab₂溶液至电极表面，置于4℃冰箱中孵化1 h，清洗后，晾干，制得一种pH释放型免疫传感器；
实施例3 一种pH释放型免疫传感器的制备方法
（1）依次用1.0、0.3、0.05 μm的三氧化二铝抛光粉对磁电极进行抛光处理，用超纯水清洗干净，然后将电极置于5 mmol/L铁氰化钾溶液中，在-0.2~0.6 V电位下扫描，使峰电位差小于110 mV；
（2）取6 μL、3 mg/mL的氨基化四氧化三铁溶液滴加到电极表面，室温下晾干；
（3）滴加3 μL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC溶液与N-羟基琥珀酰亚胺NHS溶液的混合液到电极表面，再继续滴加6 μL、10 μg/mL的肿瘤标志物捕获抗体，4℃下晾干，超纯水冲洗；
所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC溶液与N-羟基琥珀酰亚胺NHS溶液的浓度均为0.1 mol/L，其体积比为4 : 1；
（4）用3 μL、质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，4℃下晾干，超纯水冲洗；
（5）将6 μL的一系列不同浓度的肿瘤标志物溶液滴加到电极表面，用于和抗体的特异性识别，室温下孵化1 h，超纯水冲洗；
（6）继续滴加6 μL检测抗体孵化物—介孔二氧化硅-Au-Ab₂溶液至电极表面，置于4℃冰箱中孵化1 h，清洗后，晾干，制得一种pH释放型免疫传感器；
实施例4 检测抗体孵化物—介孔二氧化硅-Au-Ab₂溶液的制备
（1）介孔二氧化硅的制备
将0.3 g的CTAB溶于200 mL的超纯水中，加入1 mL、2.0 mol/L的NaOH，于80℃回流反应20 min，随后加入1.5 mL的四乙氧基硅烷，继续反应2 h生成白色沉淀，，为了去除溶液中残留的CTAB，得到的沉淀重新分散在1.5 mL、质量分数为37%的HCl和75 mL的甲醇的混合液中，80℃下回流10 h，将混合物离心，经水和甲醇洗涤数次，35℃下真空干燥，制得介孔二氧化硅，粒径大小为100 nm左右，孔径大小为5 nm左右；
（2）缩醛链接器修饰的介孔二氧化硅MSN-Aetal的制备
将0.1 g的介孔二氧化硅分散于20 mL乙醇中，加入0.2 mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷，80℃回流反应12 h，混合物经离心、洗涤、45℃下真空干燥，得到氨基化的介孔二氧化硅；
将0.1 g氨基化的介孔二氧化硅加到10 mL的二甲基亚砜溶液中，随后加入50 mg丁二酸酐和50 mg三乙胺，40℃下反应48 h，得到的固体经乙醇洗涤，真空干燥得到羧基化的介孔二氧化硅；
分别将20 mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和10 mg的N-羟基琥珀酰亚胺NHS溶于3 mL超纯水中，加入50 mg羧基化的介孔二氧化硅，80 mg的3,9-双(3-氨丙基)-2,4,8,10-四氧杂螺[5.5]十一烷，室温下搅拌8 h，沉淀经洗涤干燥得到缩醛链接器修饰的介孔二氧化硅MSN-Aetal；
（3）羧基功能化金Au-COOH的制备
将20 mL、1%的HAuCl₄和0.5 mmol巯基琥珀酸分散于85 mL的去氧甲醇中，在搅拌下，将25 mL、0.2 mol/L的NaBH₄溶液滴加到上述溶液中，得到的深棕色沉淀经乙醇洗涤后，真空干燥，制得羧基功能化金Au-COOH；
（4）检测抗体标记物—介孔二氧化硅-Au的制备
将10 mg的缩醛链接器修饰的介孔二氧化硅MSN-Aetal加入到0.5 mmol/L、1 mL的硫堇水溶液中，室温下搅拌12 h，加入4 mg的羧基功能化金Au-COOH、10 mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和5 mg的N-羟基琥珀酰亚胺NHS，继续搅拌8 h，混合物经离心洗涤直到上清液为无色后，将沉淀重新分散在1 mL的超纯水中，成功的将硫堇封装在介孔二氧化硅-Au中，制得检测抗体标记物介孔二氧化硅-Au；
（5）检测抗体孵化物—介孔二氧化硅-Au-Ab₂溶液的制备
将1 mL的检测抗体标记物介孔二氧化硅-Au与1 mL、10 μg/mL的检测抗体溶液混合后，在4℃的条件下孵化12 h，离心后，将沉淀重新分散在1 mL、pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液中，保存在4℃的冰箱中备用。
实施例5检测抗体孵化物—介孔二氧化硅-Au-Ab₂溶液的制备
（1）介孔二氧化硅的制备
将0.5 g的CTAB溶于200 mL的超纯水中，加入1.5 mL、2.0 mol/L的NaOH，于80℃回流反应20 min，随后加入2.0 mL的四乙氧基硅烷，继续反应2 h生成白色沉淀，，为了去除溶液中残留的CTAB，得到的沉淀重新分散在1.5 mL、质量分数为37%的HCl和85 mL的甲醇的混合液中，80℃下回流11 h，将混合物离心，经水和甲醇洗涤数次，40℃下真空干燥，制得介孔二氧化硅，粒径大小为100 nm左右，孔径大小为5 nm左右；
（2）缩醛链接器修饰的介孔二氧化硅MSN-Aetal的制备
将0.2 g的介孔二氧化硅分散于20 mL乙醇中，加入0.7 mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷，80℃回流反应12 h，混合物经离心、洗涤、45℃下真空干燥，得到氨基化的介孔二氧化硅；
将0.2 g氨基化的介孔二氧化硅加到10 mL的二甲基亚砜溶液中，随后加入80 mg丁二酸酐和80 mg三乙胺，40℃下反应48 h，得到的固体经乙醇洗涤，真空干燥得到羧基化的介孔二氧化硅；
分别将50 mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和20 mg的N-羟基琥珀酰亚胺NHS溶于3 mL超纯水中，加入80 mg羧基化的介孔二氧化硅，100 mg的3,9-双(3-氨丙基)-2,4,8,10-四氧杂螺[5.5]十一烷，室温下搅拌8 h，沉淀经洗涤干燥得到缩醛链接器修饰的介孔二氧化硅MSN-Aetal；
（3）羧基功能化金Au-COOH的制备
将20 mL、1%的HAuCl₄和0.5 mmol巯基琥珀酸分散于85 mL的去氧甲醇中，在搅拌下，将25 mL、0.2 mol/L的NaBH₄溶液滴加到上述溶液中，得到的深棕色沉淀经乙醇洗涤后，真空干燥，制得羧基功能化金Au-COOH；
（4）检测抗体标记物—介孔二氧化硅-Au的制备
将15 mg的缩醛链接器修饰的介孔二氧化硅MSN-Aetal加入到1mmol/L、1 mL的硫堇水溶液中，室温下搅拌12 h，加入8 mg的羧基功能化金Au-COOH、10 mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和5 mg的N-羟基琥珀酰亚胺NHS，继续搅拌8 h，混合物经离心洗涤直到上清液为无色后，将沉淀重新分散在1 mL的超纯水中，成功的将硫堇封装在介孔二氧化硅-Au中，制得检测抗体标记物介孔二氧化硅-Au；
（5）检测抗体孵化物—介孔二氧化硅-Au-Ab₂溶液的制备
将1 mL的检测抗体标记物介孔二氧化硅-Au与1 mL、10 μg/mL的检测抗体溶液混合后，在4℃的条件下孵化12 h，离心后，将沉淀重新分散在1 mL、pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液中，保存在4℃的冰箱中备用。
实施例6检测抗体孵化物—介孔二氧化硅-Au-Ab₂溶液的制备
（1）介孔二氧化硅的制备
将0.7 g的CTAB溶于200 mL的超纯水中，加入2 mL、2.0 mol/L的NaOH，于80℃回流反应20 min，随后加入3.0 mL的四乙氧基硅烷，继续反应2 h生成白色沉淀，，为了去除溶液中残留的CTAB，得到的沉淀重新分散在1.5 mL、质量分数为37%的HCl和100 mL的甲醇的混合液中，80℃下回流12 h，将混合物离心，经水和甲醇洗涤数次，45℃下真空干燥，制得介孔二氧化硅，粒径大小为100 nm左右，孔径大小为5 nm左右；
（2）缩醛链接器修饰的介孔二氧化硅MSN-Aetal的制备
将0.3 g的介孔二氧化硅分散于20 mL乙醇中，加入1 mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷，80℃回流反应12 h，混合物经离心、洗涤、45℃下真空干燥，得到氨基化的介孔二氧化硅；
将0.3 g氨基化的介孔二氧化硅加到10 mL的二甲基亚砜溶液中，随后加入100 mg丁二酸酐和100 mg三乙胺，40℃下反应48 h，得到的固体经乙醇洗涤，真空干燥得到羧基化的介孔二氧化硅；
分别将80 mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和30 mg的N-羟基琥珀酰亚胺NHS溶于3 mL超纯水中，加入100 mg羧基化的介孔二氧化硅，130 mg的3,9-双(3-氨丙基)-2,4,8,10-四氧杂螺[5.5]十一烷，室温下搅拌8 h，沉淀经洗涤干燥得到缩醛链接器修饰的介孔二氧化硅MSN-Aetal；
（3）羧基功能化金Au-COOH的制备
将20 mL、1%的HAuCl₄和0.5 mmol巯基琥珀酸分散于85 mL的去氧甲醇中，在搅拌下，将25 mL、0.2 mol/L的NaBH₄溶液滴加到上述溶液中，得到的深棕色沉淀经乙醇洗涤后，真空干燥，制得羧基功能化金Au-COOH；
（4）检测抗体标记物—介孔二氧化硅-Au的制备
将20 mg的缩醛链接器修饰的介孔二氧化硅MSN-Aetal加入到3 mmol/L、1 mL的硫堇水溶液中，室温下搅拌12 h，加入10 mg的羧基功能化金Au-COOH、10 mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和5 mg的N-羟基琥珀酰亚胺NHS，继续搅拌8 h，混合物经离心洗涤直到上清液为无色后，将沉淀重新分散在1 mL的超纯水中，成功的将硫堇封装在介孔二氧化硅-Au中，制得检测抗体标记物介孔二氧化硅-Au；
（5）检测抗体孵化物—介孔二氧化硅-Au-Ab₂溶液的制备
将1 mL的检测抗体标记物介孔二氧化硅-Au与1 mL、10 μg/mL的检测抗体溶液混合后，在4℃的条件下孵化12 h，离心后，将沉淀重新分散在1 mL、pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液中，保存在4℃的冰箱中备用。
实施例7 肿瘤标志物CD146的检测
（1）将权利要求1所制备的免疫传感器浸泡在0.5 mL、pH=3.7的醋酸盐缓冲溶液12 h；
（2）采用三电极体系，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极作为辅助电极，导电玻璃作为工作电极，采用微分脉冲伏安法对上述浸泡液进行扫描测试，将电压设置为-0.4~0.6V，记录电流的变化，绘制工作曲线；
（3）将待测样品溶液代替肿瘤标志物抗原标准溶液进行测试；
（4）该电化学免疫传感器对肿瘤标志物CD146检测线性范围为0.001~10 ng/mL，检测限为0.21 pg/mL。
实施例8按照实施例7的方法对AFP、CA153、CA125进行检测，测得线性范围分别为0.001~10 ng/mL、0.001~15 ng/mL和0.002~10 ng/mL；检测限分别为0.17 pg/mL、0.31 pg/mL和0.54 pg/mL。