基于环介导等温扩增技术的鸡传染性支气管炎病毒快速检测试剂盒及其使用方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102286633 A (43)申请公布日 2011.12.21 CN 102286633 A *CN102286633A* (21)申请号 201010017295.5 (22)申请日 2010.01.08 C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) G01N 21/64(2006.01) (71)申请人 江苏省家禽科学研究所 地址 225003 江苏省扬州市桑园路 46 号 申请人 周生 唐梦君 (72)发明人 周生 唐梦君 戴亚斌 刘梅 章双杰 程旭 韦玉勇 (74)专利代理机构 北京连和连知识产权代理有 限公司 11278 代理。

2、人 李海燕 (54) 发明名称 基于环介导等温扩增技术的鸡传染性支气管 炎病毒快速检测试剂盒及其使用方法 (57) 摘要 基于环介导等温扩增技术的鸡传染性支气管 炎病毒快速检测试剂盒及其使用方法。由 (1) 反 应液 ； (2) 酶溶液 ； (3) 引物溶液 ； (4) 阳性对照 液组成， 其中引物溶液包括三对特异性引物即内 引物、 外引物和环引物 ； 在反应中预先加入钙黄 绿素锰络合物， 锰与 dNTP 析出的焦磷酸跟离子结 合， 释放出钙黄绿素， 可通过肉眼观察鉴定， 阳性 结果为黄绿色， 阴性结果为浅黄色。 本发明解决了 现有技术中检测鸡传染性支气管炎病毒所需周期 长、 灵敏度低、 现场。

3、应用困难等问题。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 6 页 CN 102286644 A1/2 页 2 1. 一种基于环介导等温扩增技术的鸡传染性支气管炎病毒快速检测试剂盒， 其特征在 于， 由(1)反应液 ； (2)酶溶液 ； (3)引物溶液 ； (4)阳性对照液组成， 以上四种液体分别置于 容器中。 2. 根据权利要求 1 所述的快速检测试剂盒， 其特征在于， 所述引物溶液包括二对特异 性引物即内引物、 外引物， 由浓度为 10M-20M 的内引物、 浓度为 2M-4M 的外引物组 成 ； 引物序列如下 ： 内引。

4、物 1 ： GCTAGATGAACCAGAGGTCCTTCTTTTCCGTTGCTTGGGCTAC 内引物 2 ： GTCACCTCCCCCCACATACCTTTTCGACCTTGTGCGAGAACGT AG 外引物 1 ： GTTGCTGGTATCACTGCTTGT 外引物 2 ： CAGGGGTTGTTTGGCACTAC 3. 根据权利要求 2 所述的快速检测试剂盒， 其特征在于， 所述引物溶液还包括浓度为 5M-10M 的环引物， 序列如下 ： 环引物 1 ： CGCCCGTAGGACGCT 环引物 2 ： GGCTTTTGAGCCTAGCGTTG 4. 根据权利要求 1 所述的快速检测。

5、试剂盒， 其特征在于， 所述反应液由浓度为 100mM-200mM 的 Tris-HCl(pH 8.8)、浓 度 为 50mM-75mM 的 KCl、浓 度 为 50mM-75mM 的 (NH4)2SO4、 浓度为 4M-5M 的甜菜碱、 浓度为 6mM-8mM 的 dNTP、 浓度为 30mM-40mM 的 MgSO4、 浓度为 0.01mM-1mM 的钙黄绿素锰络合物组成。 5. 根据权利要求 1 所述的快速检测试剂盒， 其特征在于， 所述酶溶液由浓度为 4U/L 的 Bst DNA 聚合酶、 1.3U/L 的 AMV 逆转录酶、 10U/L 的 RNA 酶抑制剂组成。 6. 根据权利要求。

6、 1 所述的快速检测试剂盒， 其特征在于， 所述阳性对照液由阳性模板 DNA 经体外转录成 RNA 制备， 浓度为 10ng/L-50ng/L。 7. 鸡传染性支气管炎病毒快速检测试剂盒的使用方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： 1RNA 模板的制备 ； 2 在反应管中加入 5L 的反应液、 2L 的酶溶液、 2L 的引物溶液、 RNA 模板 2L-5L， ddH2O 定容至 25L， 60温育 30min-60min ； 3 结果观察 ： 阳性对照管发出黄绿色荧光， 样品管与阳性对照同色为阳性， 否则为阴 性。 8. 根据权利要求 7 所述的鸡传染性支气管炎病毒快速检测试剂盒的使用方法， 。

7、其特征 在于， 所述 1 步骤可按以下方式提取 ： A、 取检测组织 0.5g， 在液氮中研磨 3-5min 呈粉末， 将粉末置于 1.5mL 离心管中， 加入 1mLTrizol 后， 剧烈振荡， 室温放置 5-10min。 B、 加入 200L 氯仿， 剧烈振荡， 室温放置 3-5min， 12,000g 离心 15min。 C、 吸取上清， 加入异丙醇 500L， 混匀， 室温放置 10min。 D、 12,000g 离心 10min， 去上清， 可见沉淀， 用 75乙醇洗涤， 缓慢混匀后静置 2min。 E、 7,500g 离心 5min， 完全去除乙醇， 在超净台内用风吹 5min 。

8、后加入 8LddH2O 溶解， 权 利 要 求 书 CN 102286633 A CN 102286644 A2/2 页 3 即为待检 RNA， -20冰箱中保存备用。 9. 根据权利要求 7 所述的鸡传染性支气管炎病毒快速检测试剂盒的使用方法， 其特征 在于， 所述 1 步骤可按以下方式提取 ： 取咽喉、 泄殖腔棉拭子浸泡于 300L 生理盐水中 10min， 12,000g 离心 15min， 取上清 200L， 采用 (1) 中从组织样品中提取 RNA 的方法提取 RNA。 权 利 要 求 书 CN 102286633 A CN 102286644 A1/6 页 4 基于环介导等温扩增技。

9、术的鸡传染性支气管炎病毒快速检 测试剂盒及其使用方法 技术领域 0001 本发明涉及生物检测领域， 具体涉及基于环介导等温扩增技术检测鸡传染性支气 管炎病毒快速检测试剂盒， 背景技术 0002 禽传染性支气管炎 (Avian Infectious Bronchitis， IB) 是由冠状病毒科冠状病 毒属的禽传染性支气管炎病毒 (Avian InfectiousBronchitis Virus， IBV) 引起的鸡的一 种急性、 高度接触性传染病， 其特征为病鸡出现呼吸道症状、 产蛋数量和品质下降以及肾脏 病变等。该病呈世界广泛流行， 是严重危害世界养禽业的重大传染病之一。 0003 目前， 。

10、鸡传染性支气管炎病毒的检测方法包括传统的血凝和血凝抑制、 ELISA、 中 和试验和 RT-PCR 方法。传统的检测方法耗时长、 操作繁琐。PCR 法具有特异性强、 灵敏度高 和速度快等优点， 但因 RT-PCR 容易交叉污染、 操作繁琐、 需要的热循环设备价格昂贵等缺 点而很难得到推广。而实时荧光定量 PCR 虽然较好地解决了交叉污染的问题， 并简化了操 作过程， 但却需要更复杂的定量仪器， 因此不适于现场快速检测。而且实时定量 PCR 荧光探 针的成本较高， 加大了推广应用的难度。 0004 环介导等温扩增 (Loop-mediated isothermal amplication， LA。

11、MP) 是 Notomi 等 在 2000 年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法， 其原理是针对目的基因的 6 个区域设计 4 条特异性引物， 利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)在等温65左右， 几十分 钟， 即可实 现核酸的高效扩增。 4条引物对靶序列的6个特异序列区域的识别， 保证了LAMP 扩增的高度特异性。LAMP 不需要模板的热变性， 长时间温度循环， 在等温条件下扩增， 不会 因温度改变而造成时间的浪费。有无肉眼可见的焦磷酸镁的白色沉淀， 成为判断核酸是否 扩增的最简单的方法。增加环引物的 LAMP 方法， 使反应时间缩短一半， 可以在不到 30min 。

12、内完成， 大大提高了检测的效率， 环状引物与茎环结构结合的区域在F2和F1之间(或是B2 和 B1 之间 )， 以 F1 到 F2 的方向或是 B1 到 B2 的方向结合。这样， 茎环 DNA 或者与内引物杂 交， 或者与环状引物杂交来启动链置换 DNA 的合成， 从而加快了反应速度。环介导等温扩增 技术在病原核酸检测技术上具有很多优点， 但是目前还未见有应用环介导等温扩增技术检 测鸡传染性支管病毒的方法和检测试剂盒。 发明内容 0005 本发明的一个目的是解决现有技术中检测鸡传染性支气管炎病毒所需周期长、 灵敏度低、 现场应用困难等问题， 提供一种基于环介导等温扩增技术 (Loop-medi。

13、ated isothermal amplicatio of DNA， 简称LAMP)的鸡传染性支气管炎病毒快速检测试剂盒， 适 用于检测不同血清型的 IB 病毒， 可广泛应用于兽医检测领域。 0006 为了实现上述目的， 本发明采用以下的技术方案 ： 0007 本发明由 (1) 反应液 ； (2) 酶溶液 ； (3) 引物溶液 ； (4) 阳性对照液组成， 以上四种 说 明 书 CN 102286633 A CN 102286644 A2/6 页 5 液体分别置于容器中。 0008 优选的， 所述引物溶液包括二对特异性引物即内引物、 外引物， 由浓度为 10M-20M 的内引物、 浓度为 2M。

14、-4M 的外引物组成 ； 0009 引物序列如下 ： 0010 内引物 1 ： 0011 GCTAGATGAACCAGAGGTCCTTCTTTTCCGTTGCTTGGGCTAC 0012 内引物 2 ； 0013 GTCACCTCCCCCCACATACCTTTTCGACCTTGTGCGAGAACGTAG 0014 外引物 1 ： GTTGCTGGTATCACTGCTTGT 0015 外引物 2 ： CAGGGGTTGTTTGGCACTAC 0016 进一步优选的， 所述引物溶液还包括浓度为 5M-10M 的环引物， 序列如下 ： 0017 环引物 1 ： CGCCCGTAGGACGCT 001。

15、8 环引物 2 ： GGCTTTTGAGCCTAGCGTTG 0019 优 选 的， 所 述 反 应 液 由 浓 度 为 100mM-200mM 的 Tris-HCl(pH8.8)、 浓 度 为 50mM-75mM的KCl、 浓度为50mM-75mM的(NH4)2SO4、 浓度为4M-5M的甜菜碱、 浓度为6mM-8mM 的 dNTP、 浓度为 30mM-40mM 的 MgSO4、 浓度为 0.01mM-1mM 的钙黄绿素锰络合物组成。 0020 优选的， 所述酶溶液由浓度为 4U/L 的 Bst DNA 聚合酶、 1.3U/L 的 AMV 逆转录 酶、 10U/L 的 RNA 酶抑制剂组成。。

16、 0021 优选的， 所述阳性对照液由阳性模板 DNA 经体外转录成 RNA 制备， 浓度为 10ng/ L-50ng/L。 0022 鸡传染性支气管炎病毒快速检测试剂盒的使用方法， 包括以下步骤 ： 0023 1RNA 模板的制备 ； 0024 2 在反应管中加入 5L 的反应液、 2L 的酶溶液、 2L 的引物溶液、 RNA 模板 2L-5L， ddH2O 定容至 25L， 60温育 30min-60min ； 0025 3 结果观察 ： 阳性对照管发出黄绿色荧光， 样品管与阳性对照同色为阳性， 否则 为阴性。 0026 其中， 所述1步骤可按以下方式提取 ： A、 取检测组织0.5g， 。

17、在液氮中研磨3-5min 呈粉末， 将粉末置于 1.5mL 离心管中， 加入 1mLTrizol 后， 剧烈振荡， 室温放置 5-10min。 0027 B、 加入 200L 氯仿， 剧烈振荡， 室温放置 3-5min， 12,000g 离心 15min。 0028 C、 吸取上清， 加入异丙醇 500L， 混匀， 室温放置 10min。 0029 D、 12,000g 离心 10min， 去上清， 可见沉淀， 用 75乙醇洗涤， 缓慢混匀后静置 2min。 0030 E、 7,500g 离心 5min， 完全去除乙醇， 在超净台内用风吹 5min 后加入 8LddH2O 溶 解， 即为待检 。

18、RNA， -20冰箱中保存备用。 0031 再者， 所述1步骤可按以下方式提取 ： 取咽喉、 泄殖腔棉拭子浸泡于300L生理 盐水中 10min， 12,000g 离心 15min， 取上清 200L， 采用 (1) 中从组织样品中提取 RNA 的方 法提取 RNA。 0032 本发明建立了基于环介导等温扩增技术的鸡传染性支气管炎病毒快速检测试剂 盒， 本试剂盒根据鸡传染性支气管炎病毒 5端非编码保守区的八个部位设计了一套内引 说 明 书 CN 102286633 A CN 102286644 A3/6 页 6 物、 一套外引物、 一套环引物， 环 引物的引入加快了反应速度， 缩短检测反应时间。

19、。本发明 采用环介导等温扩增技术， 特异性强， 比 PCR 检测方法有更高的灵敏度， 但不需要昂贵的 PCR 仪， 只需普通的水浴锅即可， 且结果不必用凝胶电泳方法来观察， 使用染料来观察， 快 速、 准确性高、 灵敏度好、 现场应用方便。 0033 本发明的有益效果是 (1) 不需要特殊试剂与设备 ； (2) 能检测多种血清型的 IB 病 毒， 根据鸡传染性支气管炎病毒 5端非编码保守区设计引物 ； (3) 高特异性 ： 应用 8 个区 域， 三对引物， 根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否 ； (4) 快速、 高效扩增 ： 检测时间 30min 左右 (5) 鉴定简便 ： 结果不必用凝胶。

20、电泳方法来观察， 在反应中预先加入钙黄绿素锰 络合物， 锰与 dNTP 析出的焦磷酸跟离子结合， 释放出钙黄绿素， 可通过肉眼观察鉴定， 阳性 结果为黄绿色， 阴性结果为浅黄色。 0034 下面提供具体实例进一步阐述本发明的技术方案和有益效果， 但本发明的技术应 用不限于实例。 具体实施方式 0035 实施例一 0036 一、 按下列配方制作鸡传染性支气管炎病毒的环介导等温扩增检测试剂盒 ： 0037 (1) 分别配制以下溶液 ： 1M 的 Tris-HCl(pH 8.8)、 1M 的 KCl、 1M 的 (NH4)2SO4、 100mM 的 dNTP、 1M 的 MgSO4、 1M 的 Mn。

21、Cl2 溶液， 按照一定比例混合， 加入固体甜菜碱、 钙黄绿 素， 使甜菜碱的终浓度 为 4M-5M， 钙黄绿素的终浓度为 0.01mM-1mM， 用 ddH2O 定容配置成 5 反应液。 0038 (2) 将 8U/L 的 Bst DNA 聚合酶、 5U/L 的 AMV 逆转录酶、 40U/L 的 RNA 酶抑制 剂按照 2 1 1 的比例混合， 配制成酶溶液。 0039 (3) 按以下序列经 DNA 合成仪合成寡核苷酸脱氧核酸引物 ： 引物有三对 ： 0040 内引物 1 ： 0041 GCTAGATGAACCAGAGGTCCTTCTTTTCCGTTGCTTGGGCTAC 0042 内引物。

22、 2 ： 0043 GTCACCTCCCCCCACATACCTTTTCGACCTTGTGCGAGAACGTAG 0044 外引物 1 ： GTTGCTGGTATCACTGCTTGT 0045 外引物 2 ： CAGGGGTTGTTTGGCACTAC 0046 环引物 1 ： CGCCCGTAGGACGCT 0047 环引物 2 ： GGCTTTTGAGCCTAGCGTTG 0048 上述引物溶于 ddH2O 中， 配制成浓度为 100M 的母液， 再按比例混合稀释配制引 物溶液。 0049 (4) 将 IB 病毒 5端非编码保守区克隆在具有 T7 RNA 聚合酶启动子序列的载体 上， 对重组质。

23、粒进行线性化后， 在体外采用 T7 RNA 聚合酶进行转录获得 RNA 模板， 用 DEPC 水稀释至适当的浓度， 配制成阳性对照液。 0050 (5) 鸡传染性支气管炎病毒 LAMP 扩增试剂的配制方法如下 ： 取 5L 的 5 反应 液、 2L 的酶溶液、 2L 的引物溶液、 RNA 模板 2L-5L， ddH2O 定容至 25L。 0051 二、 样品 RNA 的制备 说 明 书 CN 102286633 A CN 102286644 A4/6 页 7 0052 (1) 从组织样品中提取 RNA 0053 A、 取检测组织0.5g， 在液氮中研磨3-5min呈粉末， 将粉末置于1.5mL。

24、离心管中， 加 入 1mLTrizol 后， 剧烈振荡， 室温放置 5-10min。 0054 B、 加入 200L 氯仿， 剧烈振荡， 室温放置 3-5min， 12,000g 离心 15min。 0055 C、 吸取上清， 加入异丙醇 500L， 混匀， 室温放置 10min。 0056 D、 12,000g 离心 10min， 去上清， 可见沉淀， 用 75乙醇洗涤， 缓慢混匀后静置 2min。 0057 E、 7,500g 离心 5min， 完全去除乙醇， 在超净台内用风吹 5min 后加入 8LddH2O 溶 解， 即为待检 RNA， -20冰箱中保存备用。 0058 (2) 再者，。

25、 RNA 也可从家禽咽喉、 泄殖腔棉拭子样品中提取 ： 0059 取咽喉、 泄殖腔棉拭子浸泡于300L生理盐水中10min， 12,000g离心15min， 取上 清 200L， 采用 (1) 中从组织样品中提取 RNA 的方法提取 RNA。 0060 三、 鸡传染性支气管炎病毒的环介导等温扩增 ： 0061 在装有 23L 的 LAMP 反应液的反应管中加入 2L 待检 RNA 模版， 于 65温育 30min， 80灭活 10min 中止反应。 0062 四、 结果观察 ： 0063 阳性对照管发出黄绿色荧光， 样品管与阳性对照同色为阳性， 否 则为阴性。 0064 实施例二 0065 一。

26、、 按下列配方制作鸡传染性支气管炎病毒的环介导等温扩增检测试剂盒 ： 0066 (1) 分别配制以下溶液 ： 1M 的 Tris-HCl(pH 8.8)、 1M 的 KCl、 1M 的 (NH4)2SO4、 100mM 的 dNTP、 1M 的 MgSO4、 1M 的 MnCl2 溶液， 按照一定比例混合， 加入固体甜菜碱、 钙黄绿 素， 使甜菜碱的终浓度为4M-5M， 钙黄绿素的终浓度为0.01mM-1mM， 用ddH2O定容配置成5 反应液。 0067 (2) 将 8U/L 的 Bst DNA 聚合酶、 5U/L 的 AMV 逆转录酶、 40U/L 的 RNA 酶抑制 剂按照 2 1 1 。

27、的比例混合， 配制成酶溶液。 0068 (3) 按以下序列经 DNA 合成仪合成寡核苷酸脱氧核酸引物 ： 引物有二对 ： 0069 内引物 1 ： 0070 GCTAGATGAACCAGAGGTCCTTCTTTTCCGTTGCTTGGGCTAC 0071 内引物 2 ： 0072 GTCACCTCCCCCCACATACCTTTTCGACCTTGTGCGAGAACGTAG 0073 外引物 1 ： GTTGCTGGTATCACTGCTTGT 0074 外引物 2 ： CAGGGGTTGTTTGGCACTAC 0075 上述引物溶于 ddH2O 中， 配制成浓度为 100M 的母液， 再按比例混合。

28、稀释配制引 物溶液。 0076 (4) 将 IB 病毒 5端非编码保守区克隆在具有 T7RNA 聚合酶启动子序列的载体 上， 对重组质粒进行线性化后， 在体外采用 T7RNA 聚合酶进行转录获得 RNA 模板， 用 DEPC 水 稀释至适当的浓度， 配制成阳性对照液。 0077 (5) 鸡传染性支气管炎病毒 LAMP 扩增试剂的配制方法如下 ： 取 5L 的 5 反应 液、 2L 的酶溶液、 2L 的引物溶液、 RNA 模板 2L-5L， ddH2O 定容至 25L。 说 明 书 CN 102286633 A CN 102286644 A5/6 页 8 0078 二、 样品 RNA 的制备 0。

29、079 (1) 从组织样品中提取 RNA 0080 A、 取检测组织0.5g， 在液氮中研磨3-5min呈粉末， 将粉末置于1.5mL离心管中， 加 入 1mLTrizol 后， 剧烈振荡， 室温放置 5-10min。 0081 B、 加入 200L 氯仿， 剧烈振荡， 室温放置 3-5min， 12,000g 离心 15min。 0082 C、 吸取上清， 加入异丙醇 500L， 混匀， 室温放置 10min。 0083 D、 12,000g 离心 10min， 去上清， 可见沉淀， 用 75乙醇洗涤， 缓慢混匀后静置 2min。 0084 E、 7,500g 离心 5min， 完全去除乙醇。

30、， 在超净台内用风吹 5min 后加入 8LddH2O 溶 解， 即为待检 RNA， -20冰箱中保存备用。 0085 (2) 再者， RNA 也可从家禽咽喉、 泄殖腔棉拭子样品中提取 ： 0086 取咽喉、 泄殖腔棉拭子浸泡于300L生理盐水中10min， 12,000g离心15min， 取上 清 200L， 采用 (1) 中从组织样品中提取 RNA 的方法提取 RNA。 0087 三、 鸡传染性支气管炎病毒的环介导等温扩增 ： 0088 在装有 23L 的 LAMP 反应液的反应管中加入 2L 待检 RNA 模版， 于 65温育 30min， 80灭活 10min 中止反应。 0089 四。

31、、 结果观察 ： 0090 阳性对照管发出黄绿色荧光， 样品管与阳性对照同色为阳性， 否则为阴性。 0091 序列表 0092 江苏省家禽科学研究所 0093 基于环介导等温扩增技术的鸡传染性支气管炎病毒快速检测试剂盒及其使 用方法 0094 6 0095 PatentIn version 3.2 0096 1 0097 43 0098 DNA 0099 人工序列 0100 1 0101 内引物 FIP ： GCTAGATGAACCAGAGGTCCTTCTTTTCCGTTGCTTGGGCTAC 0102 2 0103 45 0104 DNA 0105 人工序列 0106 2 0107 内引物 。

32、BIP ： GTCACCTCCCCCCACATACCTTTTCGACCTTGTGCGAGAACGTAG 0108 3 0109 21 0110 DNA 说 明 书 CN 102286633 A CN 102286644 A6/6 页 9 0111 人工序列 0112 3 0113 外引物 F3 ： GTTGCTGGTATCACTGCTTGT 0114 4 0115 20 0116 DNA 0117 人工序列 0118 4 0119 外引物 B3 ： CAGGGGTTGTTTGGCACTAC 0120 5 0121 15 0122 DNA 0123 人工序列 0124 5 0125 环引物 LF ： CGCCCGTAGGACGCT 0126 6 0127 20 0128 DNA 0129 人工序列 0130 6 0131 环引物 LB ： GGCTTTTGAGCCTAGCGTTG 说 明 书 CN 102286633 A 。