类风湿关节炎图谱模型的构建方法及其图谱模型.pdf

《类风湿关节炎图谱模型的构建方法及其图谱模型.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《类风湿关节炎图谱模型的构建方法及其图谱模型.pdf（11页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。

1、(10)申请公布号 CN 102262098 A (43)申请公布日 2011.11.30 CN 102262098 A *CN102262098A* (21)申请号 201110107562.2 (22)申请日 2011.04.27 G01N 24/08(2006.01) G01N 1/28(2006.01) (71)申请人 戴勇 地址 518100 广东省深圳市人民医院 申请人 欧阳昕 (72)发明人 戴勇 欧阳昕 (74)专利代理机构 广州华进联合专利商标代理 有限公司 44224 代理人 何平 (54) 发明名称 类风湿关节炎图谱模型的构建方法及其图谱 模型 (57) 摘要 本发明涉及。

2、一种类风湿关节炎图谱模型的构 建方法及其图谱模型。构建方法包括以下步骤 ： 获取试验组和参照组已经脱离人体的静脉血液 3ml， 静置 25 至 30 分钟 ； 离心 8 至 10 分钟 ； 分别 从3/4液面高度处吸取上清液600l， 低温保存 ； 分别从 3/4 液面高度处吸取 200l 上清液， 加入 D2O为99.5的重水200l混合， 得到混合液 ； 获 取混合液的一维氢谱的谱图 ； 进行傅立叶变换、 相位调整、 基线校正、 定标及积分处理， 得到上清 液的类风湿关节炎谱图 ； 对试验组和参照组中的 各个上清液的类风湿关节炎谱图建立主成分分析 模型和偏最小二乘法模型， 进行多元统计分析。

3、 ； 根据多元统计分析的分析结果， 建立类风湿关节 炎图谱模型。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 2 页 CN 102262111 A1/1 页 2 1. 一种类风湿关节炎图谱模型的构建方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： A1、 分别获取试验组和参照组已经脱离人体的静脉血液 3ml， 静置 25 至 30 分钟 ； A2、 分别以 3000 至 4000 转 / 分钟离心 8 至 10 分钟 ； A3、 分别从 3/4 液面高度处吸取上清液 600ul， 置于零下 60至零下 80环境中保存 ； 。

4、A4、 在室温冻融后， 分别从 3/4 液面高度处吸取 200ul 所述上清液， 加入 D2O 为 99.5 的重水 200ul 混合， 得到混合液 ； 其中， 在吸取所述上清液时， 一直保持 3/4 液面高度 ； A5、 分别将所述混合液置于5mm核磁管， 通过Varian NMR 600MHz核磁共振谱仪获取所 述混合液的一维氢谱的谱图 ； A6、 采用 TopSpin 软件分别对所述一维氢谱的谱图进行傅立叶变换、 相位调整、 基线校 正、 定标及积分处理， 得到所述上清液的类风湿关节炎谱图 ； 其中， 在进行傅立叶变换时乘 以增宽因子为 1Hz 的指数窗函数， 以内标乳酸在 1.33pp。

5、m 的双峰进行定标处理， 并且， 在进 行积分时， 去除水峰积分值后将其余积分值进行加合和归一化处理 ； A7、 采用 SIMCA-P+软件对试验组和参照组中的各个上清液的类风湿关节炎谱图建立主 成分分析模型和偏最小二乘法模型， 进行多元统计分析 ； 其中， 所述多元统计分析包括主成 分分析、 偏最小二乘法 - 判别分析及其正交信号校正处理 ； A8、 根据多元统计分析的分析结果， 建立所述类风湿关节炎图谱模型。 2. 根据权利要求 1 所述的构建方法， 其特征在于， 步骤 A7 中， 所述多元统计分析采用 平均中心化换算和自适换算的数据标度换算方式， 并且， 在所述多元统计分析之后还执行 以。

6、下步骤 A71 ： 采用 10 折或 20 折交叉验证法检验各模型的质量， 作为所述分析结果的一部 分。 3. 根据权利要求 2 所述的构建方法， 其特征在于， 步骤 A71 之后还执行以下步骤 A72 ： 采用交叉验证后得到的模型可解释变量以及模型可预测度， 评判各模型的有效性， 作为所 述分析结果的一部分。 4. 根据权利要求 3 所述的构建方法， 其特征在于， 步骤 A72 之后还执行以下步骤 A73 ： 通过排列实验随机 120 次至 200 次改变分类变量的排列顺序得到相应的随机模型可预测 度， 进一步检验各模型的有效性， 作为所述分析结果的一部分。 5. 根据权利要求 4 所述的构。

7、建方法， 其特征在于， 步骤 A5 中， 所述通过 Varian NMR 600MHz 核磁共振谱仪获取所述混合液的一维氢谱的谱图， 包括选用标准预饱和压水的 NOESY1DPR 序列， 弛豫延迟时间为 2.4 至 2.5 秒， 混合时间为 100 毫秒， 累加次数 128 次。 6. 根据权利要求 5 所述的构建方法， 其特征在于， 所述弛豫延迟时间及所述混合时间 内， 都进行饱和照射。 7. 根据权利要求 6 所述的构建方法， 其特征在于， 所述室温为 20 至 25， 采集时间为 0.9541s， 谱宽为 8384.9Hz。 8. 根 据 权 利 要 求 7 所 述 的 构 建 方 法，。

8、 其 特 征 在 于， 步 骤 A6 中， 积 分 区 间 为 9.0-0.39ppm， 积分间距为 0.004 至 0.005ppm。 9. 根据权利要求 8 所述的构建方法， 其特征在于， 所述重水预冷到 9 至 12 摄氏度后再 与所述上清液混合。 10. 一种类风湿关节炎的图谱模型， 其特征在于， 其采用如权利要求 1 至 9 任一所述的 构建方法构建获得。 权 利 要 求 书 CN 102262098 A CN 102262111 A1/7 页 3 类风湿关节炎图谱模型的构建方法及其图谱模型 【技术领域】 0001 本发明涉及一种获取作为中间结果的类风湿关节炎信息， 尤其涉及一种类风。

9、湿关 节炎图谱模型的构建方法， 以及采用该构建方法所构建的类风湿关节炎的图谱模型。 【背景技术】 0002 类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis， RA)是一种常见全身炎症性自身免疫性疾 病， 具有病程长， 并发症多的特点。虽然临床上呈缓解期及活动期交替出现， 但最终均导致 骨关节的损害至患者活动能力丧失。 通过早期的干预及治疗， 才能有效控制病情， 延缓其发 展。然而经多年的研究， 其分子发病机制始终不是十分清楚。这就给疾病的早期诊断和治 疗带来巨大的挑战。目前， 临床上对 RA 的诊断多依靠临床症状及各种各样的自身抗体的检 测， 但对于大量不典型的患者效果并不佳。 000。

10、3 近年随着基因组学及蛋白组学技术的不断发展， 应用指纹图谱对 RA 进行诊断及 病情的评估已被证明比单一的标志物更有优势。而随着后基因组学时代的来临， 代谢组学 已成为系统生物学研究发展的下一个重点方向， 而代谢指纹图谱更是为疾病的诊断提供一 个新的思路。 由于各种先进硬件设施的发展和新技术的出现以及数据分析软件的进步使得 全面代谢组学研究逐渐成为发现生物标志物的另一种有效手段。 而由差异代谢物构建的指 纹图谱在临床多种疾病的诊断及预后评估中蕴涵巨大的应用价值。 0004 但是， 如何结合代谢组学方法对类风湿关节炎进行综合分析， 目前尚未有具体的 研究结果和技术信息。 0005 因此， 现有。

11、技术需要改进。 【发明内容】 0006 有鉴于此， 有必要提出一种类风湿关节炎图谱模型的构建方法及其图谱模型。 0007 本发明的一个技术方案是， 一种类风湿关节炎图谱模型的构建方法， 其包括以下 步骤 ： A1、 分别获取试验组和参照组已经脱离人体的静脉血液 3ml， 静置 25 至 30 分钟 ； A2、 分别以 3000 至 4000 转 / 分钟离心 8 至 10 分钟 ； A3、 分别从 3/4 液面高度处吸取上清液 600ul， 置于零下60至零下80环境中保存 ； A4、 在室温冻融后， 分别从3/4液面高度处吸 取 200ul 所述上清液， 加入 D2O 为 99.5的重水 2。

12、00ul 混合， 得到混合液 ； 其中， 在吸取所 述上清液时， 一直保持 3/4 液面高度 ； A5、 分别将所述混合液置于 5mm 核磁管， 通过 Varian NMR600MHz 核磁共振谱仪获取所述混合液的一维氢谱的谱图 ； A6、 采用 TopSpin 软件分别对 所述一维氢谱的谱图进行傅立叶变换、 相位调整、 基线校正、 定标及积分处理， 得到所述上 清液的类风湿关节炎谱图 ； 其中， 在进行傅立叶变换时乘以增宽因子为 1Hz 的指数窗函数， 以内标乳酸在 1.33ppm 的双峰进行定标处理， 并且， 在进行积分时， 去除水峰积分值后将其 余积分值进行加合和归一化处理 ； A7、 。

13、采用 SIMCA-P+软件对试验组和参照组中的各个上清 液的类风湿关节炎谱图建立主成分分析模型和偏最小二乘法模型， 进行多元统计分析 ； 其 中， 所述多元统计分析包括主成分分析、 偏最小二乘法 - 判别分析及其正交信号校正处理 ； 说 明 书 CN 102262098 A CN 102262111 A2/7 页 4 A8、 根据多元统计分析的分析结果， 建立所述类风湿关节炎图谱模型。 0008 应用于上述方案， 所述的构建方法中， 步骤 A7 中， 所述多元统计分析采用平均中 心化换算和自适换算的数据标度换算方式， 并且， 在所述多元统计分析之后还执行以下步 骤 A71 ： 采用 10 折或。

14、 20 折交叉验证法检验各模型的质量， 作为所述分析结果的一部分。 0009 应用于上述方案， 所述的构建方法中， 步骤 A71 之后还执行以下步骤 A72 ： 采用交 叉验证后得到的模型可解释变量以及模型可预测度， 评判各模型的有效性， 作为所述分析 结果的一部分。 0010 应用于上述方案， 所述的构建方法中， 步骤 A72 之后还执行以下步骤 A73 ： 通过排 列实验随机 120 次至 200 次改变分类变量的排列顺序得到相应的随机模型可预测度， 进一 步检验各模型的有效性， 作为所述分析结果的一部分。 0011 应用于上述各方案， 所述的构建方法中， 步骤 A5 中， 所述通过 Va。

15、rian NMR600MHz 核磁共振谱仪获取所述混合液的一维氢谱的谱图， 包括选用标准预饱和压水的 NOESY1DPR 序列， 弛豫延迟时间为 2.4 至 2.5 秒， 混合时间为 100 毫秒， 累加次数 128 次。 0012 应用于上述各相关方案， 所述的构建方法中， 所述弛豫延迟时间及所述混合时间 内， 都进行饱和照射。 0013 应用于上述各相关方案， 所述的构建方法中， 所述室温为 20 至 25， 采集时间为 0.9541s， 谱宽为 8384.9Hz。 0014 应用于上述各方案， 所述的构建方法中， 步骤 A6 中， 积分区间为 9.0-0.39ppm， 积 分间距为 0.。

16、004 至 0.005ppm。 0015 应用于上述各方案， 所述的构建方法中， 所述重水预冷到 9 至 12 摄氏度后再与所 述上清液混合。 0016 本发明的又一个技术方案是， 一种类风湿关节炎的图谱模型， 其采用任一上述方 案的构建方法构建获得。 0017 上述方案， 提供了类风湿关节炎图谱模型， 为通过在代谢物水平整体地、 系统地研 究 RA 提供作为中间结果的信息， 具有高特异性及敏感性， 在 RA 的发病机制的探讨方面， 是 对基因及转录组的成果的有力补充， 但由于 RA 的信息还不全面， 因此还需要进一步的验证 才能实现对类风湿关节炎的诊断。 【附图说明】 0018 图 1 是本。

17、发明一个实施例的 RA 和正常对照血清 600MHz 1H NMR 谱图 ； 0019 图 2 是本发明一个实施例的 RA 患者和正常对照的 PCA 得分图 ； 0020 图 3A 是本发明一个实施例的 PLS-DA 得分图 ； 0021 图 3B 是图 3A 的验证图 ； 0022 图 4 是本发明一个实施例的 RA 患者和正常对照组的 OPLS-DA 得分图。 【具体实施方式】 0023 下面结合附图， 对本发明的具体实施方式进行详细描述。 0024 本发明的一个实施例是， 一种类风湿关节炎图谱模型的构建方法， 其包括以下步 骤。 说 明 书 CN 102262098 A CN 10226。

18、2111 A3/7 页 5 0025 A1、 分别获取试验组和参照组已经脱离人体的静脉血液 3ml， 静置 25 至 30 分钟 ； 例如， 静置 25 至 28 分钟， 静置的时间必须足够长， 以便离体血液中的各种分子稳定、 分层。 例如， 试验组可以包括多个不同 RA 患者的已经脱离人体的静脉血液， 同样的， 参照组可以 包括多个不同健康志愿者的已经脱离人体的静脉血液。例如， 试验组包括 50 至 100 个乃至 更多的 RA 患者的离体血液， 又如， 参照组包括 20 至 50 个乃至更多的健康志愿者的离体血 液。一个例子是， 试验组包括 150 个离体血液样本， 参照组也包括 150 。

19、个离体血液样本 ； 这 样， 在步骤 A1 中就是分别获取 300 个样本的 3ml 离体血液。理想情况是， 样本数量越大越 好， 以获取更精确的实施效果。 0026 A2、 分别以 3000 至 4000 转 / 分钟离心 8 至 10 分钟 ； 例如， 转速为 3200 转 / 分钟 或 3800 转 / 分钟， 离心时间为 9 分钟。为获得良好的离心效果， 离心时间至少为 8 分钟为 佳。 0027 A3、 分别从 3/4 液面高度处吸取上清液 600ul， 置于零下 60至零下 80环境中 保存 ； 保存温度不宜高， 可为零下 65或零下 75。经反复试验， 大约在 1/2 液面高度至。

20、 3/4 液面高度处吸取上清液较佳， 并且在吸取过程中一直保持该相对高度， 优选 3/4 液面高 度。 液面高度是指， 对于一试管内的溶液， 所述溶液的高度即为所述液面高度， 例如， 某试管 内的溶液高度为 4 厘米， 则溶液的底部距离其液面为 4 厘米， 则 3/4 液面高度处即为 3 厘米 高度处。例如， 在吸取部分液体后， 溶液的底部距离其液面为 3.2 厘米， 则 3/4 液面高度处 即相对地下降到 2.4 厘米高度处。 0028 A4、 在室温冻融后， 分别从 3/4 液面高度处吸取 200ul 所述上清液， 加入 D2O 为 99.5的重水 200ul 混合， 得到混合液 ； 其中。

21、， 在吸取所述上清液时， 一直保持 3/4 液面高 度 ； 同样的， 考虑到取样的精确度， 不宜从过高或过低液面处吸取上清液， 经反复试验， 大约 在 1/2 液面高度至 3/4 液面高度处吸取上清液较佳， 本例中优选在 3/4 液面高度处吸取上 清液。优选的， 所述重水预冷到 9 至 12 摄氏度后再与所述上清液混合， 最好是， 重水的温度 与上清液的温度相同或相近， 例如， 上清液冻融至10摄氏度， 重水预冷至10摄氏度， 再将两 者在室温下混合， 以避免实验误差。 0029 A5、 分别将所述混合液置于5mm核磁管， 通过Varian NMR 600MHz核磁共振谱仪获 取所述混合液的一。

22、维氢谱的谱图 ； 例如， 所述通过 Varian NMR600MHz 核磁共振谱仪获取所 述混合液的一维氢谱的谱图， 包括选用标准预饱和压水的 NOESY1DPR 序列， 弛豫延迟时间 为 2.4 至 2.5 秒， 混合时间为 100 毫秒， 累加次数 128 次。应用于上例， 再优选的， 所述弛 豫延迟时间及所述混合时间内， 都进行饱和照射。应用于上例， 再优选的， 所述通过 Varian NMR600MHz 核磁共振谱仪获取所述混合液的一维氢谱的谱图， 在室温下进行， 采集时间为 0.9541s， 谱宽为 8384.9Hz， 其中， 所述室温为 20 至 25， 例如， 室温为 24。 0。

23、030 A6、 采用 TopSpin 软件分别对所述一维氢谱的谱图进行傅立叶变换、 相位调整、 基 线校正、 定标及积分处理， 得到所述上清液的类风湿关节炎谱图 ； 其中， 在进行傅立叶变换 时乘以增宽因子为 1Hz 的指数窗函数， 以内标乳酸在 1.33ppm 的双峰进行定标处理， 并且， 在进行积分时， 去除水峰积分值后将其余积分值进行加合和归一化处理 ； 优选的， 积分区间 为 9.0-0.39ppm， 积分间距为 0.004 至 0.005ppm。 0031 A7、 采用 SIMCA-P+ 软件对试验组和参照组中的各个上清液的类风湿关节炎谱图 建立主成分分析模型和偏最小二乘法模型， 进。

24、行多元统计分析 ； 其中， 所述多元统计分析包 说 明 书 CN 102262098 A CN 102262111 A4/7 页 6 括主成分分析、 偏最小二乘法 - 判别分析及其正交信号校正处理 ； 例如， 所述多元统计分析 采用平均中心化换算和自适换算的数据标度换算方式， 并且， 在所述多元统计分析之后还 执行以下步骤 A71 ： 采用 10 折 20 折交叉验证法检验各模型的质量， 作为所述分析结果的一 部分。 应用于上例， 再优选的， 步骤A71之后还执行以下步骤A72 ： 采用交叉验证后得到的模 型可解释变量以及模型可预测度， 评判各模型的有效性， 作为所述分析结果的一部分。 应用 。

25、于上例， 再优选的， 步骤 A72 之后还执行以下步骤 A73 ： 通过排列实验随机 120 次至 200 次 改变分类变量的排列顺序得到相应的随机模型可预测度， 进一步检验各模型的有效性， 作 为所述分析结果的一部分。例如， 通过排列实验随机 180 次改变分类变量的排列顺序得到 相应的随机模型可预测度。 0032 A8、 根据多元统计分析的分析结果， 建立所述类风湿关节炎图谱模型。 0033 本发明的又一个实施例是， 一种类风湿关节炎的图谱模型， 其采用上述任一例或 其组合所对应的构建方法， 构建获得所述图谱模型。即采用上述任一例或其组合所述构建 方法， 构建获得所述类风湿关节炎的图谱模型。

26、。 0034 本发明的又一个实施例是， 分别获取60例试验组的离体血液样本， 以及75例参照 组的离体血液样本， 血液样本均于早晨空腹采集， 每一例采集用生化管采集 3ml 静脉血， 静 置 28min 后， 3100r/m 离心 9min， 从 3/4 液面高度处吸取上清液 600ul， 放入 -70冰箱保存 待用。 0035 核磁共振检测 ： 将各血清标本在室温解冻至 10， 所述室温为 20， 然后分别从 3/4 液面高度处吸取 200ul 混入预冷至 10的 200ul 重水用于锁场， 其中， 含 D2O 99.5。 将混合液放入 5mm 核磁管， 在 Varian NMR600MHz。

27、 谱仪上采集血清样品的一维氢谱。采用标 准预饱和压水的 NOESY1DPR 序列 RD-90 -t1-90 -tm-90 -ACQ， 并取如下参数谱宽 8384.9Hz、 弛豫延迟 ( 采样延迟， RD) 为 2.4s， 混合时间 (tm) 为 0.1s， 累加次数 128 次， 采 集时间 0.9541s、 在采样延迟 (RD) 及混合时间 (tm) 都对水进行饱和照射。 0036 数据预处理 ： 所有谱图在进行傅立叶变换时均乘以增宽因子为 1Hz 的指数窗函数 以提高信噪比。 以内标乳酸在1.33ppm的双峰定标。 对NMR谱9.0-0.39ppm进行积分， 积分 间距为 0.004ppm。

28、， 在进行归一化过程中， 去掉 5.225-4.66ppm 水峰积分值， 然后进行加合。 使用TopSpin软件(V3.0， Bruker Biospin， Germany)对谱图进行了傅立叶变换， 相位调整， 基线校正， 及定标等处理。 0037 分析 ： 使用 SIMCA-P+软件 (V11.0， Umetrics AB， Umea， Sweden) 对归一化后的数 据进行模式识别多变量分析。主成分分析使用平均中心化换算 (mean center scaling) 的 数据标度换算方式， 而偏最小二乘法 - 判别分析 (partial least squares discriminant 。

29、analysis， PLS-DA) 使用自适换算 (unit variance scaling) 的数据标度换算方式。并对 PLS-DA 对模型的质量用 10 折交叉验证法进行检验， 并用交叉验证后得到的 R2X 和 Q2( 分别 代表模型可解释的变量和模型的可预测度 ) 对模型有效性进行评判。在此之后， 通过排列 实验随机多次 (n 180) 改变分类变量 y 的排列顺序得到相应不同的随机 Q2值对模型有 效性做进一步的检验。为了消除其它非实验因素的影响， 本例还对 PLS-DA 进行了正交信号 校正处理 (orthogonal signal correction， OSC)， 进一步区分 。

30、RA 组与对照组， 尽可能最大 化地凸显模型内部不同组别之间的差异。从而根据多元统计分析的分析结果， 建立所述类 风湿关节炎图谱模型。 说 明 书 CN 102262098 A CN 102262111 A5/7 页 7 0038 本发明上述各实施例， 通过应用NMR技术结合模式识别分析方法对RA患者血清差 异代谢物进行分析， 应用 PCA、 PLS-DA、 及 OPLS-DA 构建诊断模型， 比较及评估模型的诊断价 值， 从而为通过在代谢物水平整体地、 系统地研究 RA 提供作为中间结果的信息。下面再继 续通过具体的实例说明本发明。 0039 标本的采集 ： 所有患者均来自深圳市人民医院， 。

31、其中 RA 患者 30 例， 男 9 例， 女 21 例， 年龄平均在 40.3312.85 岁， 随机选择 2009 年 5 至 2010 年 3 自风湿科住院病人， 临床 诊断标准参照临床用的美国风湿病学 1987 年的诊断标准。所有入选病例均预先排除其它 风湿系统疾病。同时， 选取健康对照组 35 例， 男 9 例， 女 26 例， 年龄平均在 36.4610.65 岁， 来自体检中心体检的健康志愿者。 0040 血液样本均于早晨空腹采集， 每一例采集用生化管采集 3ml 静脉血， 静置 30min 后， 3000r/m 离心 10min， 从 3/4 液面高度处吸取上清液 600ul，。

32、 放入 -70冰箱保存待用。 0041 核磁共振检测 ： 将各血清标本在室温解冻， 分别从 3/4 液面高度处吸取 200ul 混 入 200ul 重 水 (D2O 99.5 ) 用 于 锁 场。 将 混 合 液 放 入 5mm 核 磁 管， 在 Varian NMR600MHz 谱仪上采集血清样品的一维氢谱。采用标准预饱和压水的 NOESY1DPR 序列 RD-90-t1-90-tm-90-ACQ， 并取如下参数谱宽8384.9Hz、 弛豫延迟为2.5s， 混合时 间为 0.1s， 累加次数 128 次， 采集时间 0.9541s、 在采样延迟及混合时间都对水进行饱和照 射。 0042 数据。

33、预处理 ： 所有谱图在进行傅立叶变换时均乘以增宽因子为 1Hz 的指数窗函数 以提高信噪比。以内标乳酸在 1.33ppm 的双峰定标。对 NMR 谱 9.0-0.4ppm 进行积分， 积分 间距为 0.005ppm， 在进行归一化过程中， 去掉 5.225-4.66ppm 水峰积分值， 然后进行加合。 使用 TopSpin 软件对谱图进行了傅立叶变换， 相位调整， 基线校正， 及定标等处理。 0043 分析 ： 使用 SIMCA-P+软件对归一化后的数据进行模式识别多变量分析。主成分分 析使用平均中心化换算的数据标度换算方式， 而偏最小二乘法 - 判别分析使用自适换算的 数据标度换算方式。并对。

34、 PLS-DA 对模型的质量用 20 折交叉验证法进行检验， 并用交叉验 证后得到的R2X和Q2对模型有效性进行评判。 在此之后， 通过排列实验随机多次(n200) 改变分类变量 y 的排列顺序得到相应不同的随机 Q2值对模型有效性做进一步的检验。为 了消除其它非实验因素的影响， 本例还对 PLS-DA 进行了正交信号校正处理， 进一步区分 RA 组与对照组， 尽可能最大化地凸显模型内部不同组别之间的差异。 0044 本例所涉及的 RA 患者及健康对照者血清 NOESY1DPR 谱图如图 1 所示， 包括化学位 移从0.4-4.7和5.2-9.0， 其中， 与0.4-4.7相比， 在虚线框中的。

35、5.2-9.0是放大了 4 倍的谱图。 0045 如图 1 所示， 其中主要的差异代谢物来源一些脂质的代谢片段 (L6、 L7、 L8、 L9、 L10) 其 中 高 密 度 脂 蛋 白 (HDL， L1)、 胆 固 醇 (Cholesterol， L1) 和 磷 酸 胆 碱 (Phosphocholine ： PC) 水平有所降低， 而低密度脂蛋白 (LDL ： L2、 L4) 和极低密度脂蛋白 (VLDL ： L3、 L5) 水平升高。而氨基酸包括缬氨酸 (Valine ： Val)、 丙氨酸 (Alaine ： Ala)、 苯 丙氨酸 (Phenylalanine ： )、 组氨酸 (H。

36、istidine， His) 异亮氨酸 (Isoleucine， Ileu)、 酪氨 酸 (Tyrosine ： Tyr) 和谷氨酸 (Glutamate ： Glu) 水平均有所下降。其它信号减弱的代谢 物还包括柠檬酸 (Citrate ： Ci)、 丙酮酸 (Pyruvate ： Py)、 肌酸 (Creatine ： Cr) 和谷氨酸盐 (Glutamate， Gln) 和糖 (-Glucose ： -Glc、 -Glucose ： -Glc)。而氮乙酰基糖蛋白信 说 明 书 CN 102262098 A CN 102262111 A6/7 页 8 号 (N-acetyl glycopr。

37、otein signals ： NAG) 及乳酸信号 (Lactate ： Lac) 呈显著增强。 0046 多元统计分析 ： PCA分析结果以主成分(principal component， PC)PC1和PC2构建 得分图 (scores plot)， 其中 PC1 与 PC2 分别代表总变量的 76.6和 10.9， 如图 2 所示， 得分图上的每个点代表一个血清标本， RA 组和正常对照组有一定意义的被非显著性区分， 其中， R2X 86.7， Q2 0.835。图 3A 是 PLS-DA 预测模型的得分图， 其中， R2X 64.2， R2Y 0.716， Q2 0.652， 而图 。

38、3B 是图 3A 经过 200 次排序验证的验证图。如图 4 所示是 OPLS-DA 得分图， 其中， R2X 64.2， Q2 0.625， 进一步揭示了组间可能存在的差异， 从 OPLS-DA 的构建的模型预测敏感性和特异性分别是 29/30 96.7和 32/35 91.4。上 述各图中， 符号代表 RA 患者， 而符号代表正常对照者。 0047 由于代谢组学是通过生物信息技术和模式识别分析方法来检测体液或组织中代 谢物并观察其变化过程， 本发明各实施例通过分析 RA 患者的血清代谢谱， 发现 RA 患者糖 类， 脂类， 氨基酸及能量代谢途径均受影响。本研究发现 RA 患者血清糖、 丙酮。

39、酸减少及乳酸 增多提示无氧酵解加强。而柠檬酸的减少示有氧代谢受到抑制。血清中糖蛋白的增多， 与 RA 本身的免疫反应及炎症关节液释放入血有关。NAG 作为人体内广泛存在的一种溶酶体水 解酶， 与粘多糖及糖蛋白代谢有关， 并参与结缔组织基质的降解与胶原的分解。此外 RA 患 者血清 NAG 增多及多种氨基酸的减少提示蛋白分解代谢增强。这种代谢途径的改变解释 了 RA 患者全身炎症状态导致对能量的需求增加及供给的相对不足。实验发现 RA 患者血清 HDL、 PC 和胆固醇的降低及 LDL 和 VLDL 的升高时是对之前研究的进一步验证， 脂质代谢的 紊乱很可能是促使 RA 患者动脉粥样硬化的重要原。

40、因， 但是， 需要说明的是， 单一代谢物乃 至于多个代谢物的改变并不能作为 RA 特异的标志物， 只有收集整体代谢物改变的信息、 并 经过医学验证才能准确区分 RA 的疾病状态。 0048 根据特征的代谢图谱应用模式识别分析法， 对 RA 患者血清构建诊断模型。非监督 的 PCA 是一种将原始特征压缩至最小可能性成分数的维数缩减分析方法， 即用较少的综合 性变量代替原来众多的相关变量。上例的 PCA 得分图中， 健康对照相对集中而 RA 患者相对 离散， 说明RA的血清代谢组有望被应用于后续疾病状态的研究。 进一步应用监督的PLS-DA 分析， 因其比 PCA 具有更好的降维效果， 在得分图上。

41、疾病组与对照组得到了显著的区别。此 模型具有更好的可解释性， 其中， R2X 64.2， R2Y 7.16， 可预测性 Q2 0.652， 充分 说明了基于 NMR 的血清代谢组学技术在 RA 诊断的潜力和发展可能。 0049 总之， 代谢组学结合模式识别分析法发现 RA 患者血清存在特异的代谢物表型， 而 基于这些特征的代谢物构建的图谱模型有望在后续的研究中区分疾病组与对照组， 在验证 实验中该模型表现出一定意义上的敏感性及特异性。 随着高通量及高分辨率的检测技术的 不断发展， 基于 NMR 的血清代谢组学技术在 RA 临床应用中蕴涵巨大潜力， 并且为探索疾病 发病机制、 观察疾病的发展及预。

42、后和个体化治疗方案的拟定提供新的思路。但是， 根据现 有技术中的医学知识和本发明申请公开的内容， 从所获得的信息本身不能够直接得出该 RA 疾病的诊断结果。 但是随着后续研究工作的开展， 采用上述各例及其组合的构建方法， 其所 构建的 RA 的图谱模型， 将作为中间结果的有效信息， 为下一步的分析工作提供良好的信息 支持和辅助数据。 0050 综上所述， 本发明的应用是以NMR为基础的代谢组学技术对RA患者血清标本进行 分析， 发现 RA 患者血清的代谢轮廓与正常人存在一定差异， 而在采用模式识别分析方法对 说 明 书 CN 102262098 A CN 102262111 A7/7 页 9 。

43、海量数据进行分析时， 不仅成功区分疾病组与对照组， 而且构建 RA 具有较高特异性及敏感 性的图谱模型。这都说明了代谢组学有望成为临床 RA 研究的有力助手， 而且在 RA 的发病 机制的探讨方面， 可以作为对基因及转录组的成果的有力补充。 0051 需要补充的是， 本发明的直接目的不是获得诊断结果或健康状况， 而只是对已经 脱离人体的体液， 即血清， 进行处理或检测以获取作为中间结果的信息的方法， 或处理该信 息的方法， 根据目前的医学知识和本发明所公开的内容， 从所获得的信息本身不能够直接 得出疾病的诊断结果。 0052 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式， 其描述较为具体和详细，。

44、 但并 不能因此而理解为对本发明专利范围的限制 ； 并且， 上面列出的各个技术特征， 其相互组合 所能够形成各个实施方案， 应被视为属于本发明说明书记载的范围。对于本领域的普通技 术人员来说， 在不脱离本发明构思的前提下， 还可以做出若干变形和改进， 这些都属于本发 明的保护范围。因此， 本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。 说 明 书 CN 102262098 A CN 102262111 A1/2 页 10 图 1 图 2 图 3A 说 明 书 附 图 CN 102262098 A CN 102262111 A2/2 页 11 图 3B 图 4 说 明 书 附 图 CN 102262098 A 。