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本发明公开了一种检测鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、禽流感病毒和鸡传染性法氏囊病病毒的血清抗体的可视化蛋白芯片，包括以下方法制备得到：将上述4种病毒全蛋白分别进行纯化，稀释；将阳性对照血清，阴性对照与4种病毒蛋白分别点样于芯片载体上；干燥，固定，封闭，洗涤，即得。本发明以纯化的全病毒蛋白作为捕获抗原检测鸡血清中的病毒特异抗体，简化了制备工艺，降低了生产的成本，有较好的特异性，无交叉，结果可信度高，具有快速、简便、灵敏度高、特异性好等优点。在血清稀释6400倍时仍可检出抗体，灵敏度是传统的AGP检测方法的400倍。对现地血清样品进行检测，本发明蛋白芯片的检出率明显高于传统的AGP方法。

1、  一种检测鸡新城疫(ND)病毒、鸡传染性支气管炎(IB)病毒、禽流感(AI)病毒和鸡传染性法氏囊病(IBD)病毒的血清抗体的可视化蛋白芯片，包括以下方法制备得到：
将鸡新城疫病毒蛋白、鸡传染性支气管炎病毒蛋白、禽流感病毒蛋白和鸡传染性法氏囊病病毒全蛋白分别进行纯化，稀释；将阳性对照血清，阴性对照与稀释后的鸡新城疫病毒蛋白、鸡传染性支气管炎病毒蛋白、禽流感病毒蛋白和鸡传染性法氏囊病病毒蛋白分别点样于芯片载体上；干燥，固定，用封闭剂封闭，洗涤，即得。

2、  按照权利要求1所述的可视化蛋白芯片，其特征在于：将纯化后的鸡新城疫病毒蛋白、鸡传染性支气管炎病毒蛋白、禽流感病毒蛋白和鸡传染性法氏囊病病毒蛋白分别稀释至2000μg/ml再分别将其点样于芯片载体上。

3、  按照权利要求1或2述的可视化蛋白芯片，其特征在于：将纯化后的鸡新城疫病毒蛋白、鸡传染性支气管炎病毒蛋白、禽流感病毒蛋白和鸡传染性法氏囊病病毒蛋白分别用含1％BSA的Printing缓冲液来稀释病毒蛋白。

4、  按照权利要求1述的可视化蛋白芯片，其特征在于：所述的点样方式是将每种样品在芯片载体上重复点6次点样，形成6×6的蛋白芯片阵列。

5、  按照权利要求1或4述的可视化蛋白芯片，其特征在于：所述的芯片载体是醛基化载玻片。

6、  按照权利要求1述的可视化蛋白芯片，其特征在于：所述的固定时间为24h以上；优选的，所述的固定时间为24-96小时；更优选的，所述的固定时间为24-48小时。

7、  按照权利要求6述的可视化蛋白芯片，其特征在于：所述的固定时间为24-96小时。

8、  按照权利要求7述的可视化蛋白芯片，其特征在于：所述的固定时间为24-48小时。

9、  按照权利要求1述的可视化蛋白芯片，其特征在于：所述的封闭剂选自1％BSA、0.1％明胶、5％脱脂乳或3％FBS。

10、  权利要求1、2、4-9任何一项所述的可视化蛋白芯片在制备检测鸡新城疫(ND)病毒、鸡传染性支气管炎(IB)病毒、禽流感(AI)病毒和鸡传染性法氏囊病(IBD)病毒的血清抗体的试剂中的应用。

检测禽病血清抗体的可视化蛋白芯片及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种蛋白芯片，尤其涉及一种检测4种禽病血清抗体的可视化蛋白芯片，本发明还涉及可视化蛋白芯片的制备方法以及该可视化蛋白芯片在检测4种禽病血清抗体中的应用，属于蛋白芯片领域。
背景技术
在当今全球动物疫病发生日益频繁，规模越来越大的情况下，经典的血清学和PCR检测方法已经无法适应动物检疫快速、准确、高通量的要求。蛋白质芯片技术则可以满足生物样本同时多指标分析的需要，既保留了抗原-抗体反应的快速、灵敏和特异性，又具备芯片技术高通量、低成本、高平行、微型化和极高的灵敏度等特点，利于大规模推广应用(Mor G，Visintin I，Lai Y.Serum proteinmarkers for early detection of ovarian cancer.Proc Natl Acad Sci USA.2005，102(21)：7677-82；DU H，YANGW，XINGW.Parallel detection andquantification using nine immunoassays in a protein microarray for drug fromserum samples.Biomed Microdevices.2005，7(2)：143-146.)。生物芯片技术是随着人类基因组计划(HGP)的实施而产生的一种用于生命科学研究的新技术、新方法(Park WY.High throughput genotyping for genomic cohort study.J Prev MedPub Health.2007，40(2)：102-107；KuoWP，Whipple ME，Jenssen TK.Micro arraysand clinical dentistry.J Am Dent Assoc.2003，134(4)：456-462.)。随着基因芯片技术的不断成熟以及多次取得令人瞩目的成果，对蛋白芯片技术的研究应运而生(Khodakov DA，Zakharova NV，Gryadunov DA.An oligonucleotide microarray formultiplex real-time PCR identification of HIV-1，HBV，and HCV.Biotechniques.2008，44(2)：241-6,248；Spiess B，Seifarth W，Hummel M.DNA microarray-baseddetection and identification of fungal pathogens in clinical samples from neutropenicpatients.J Clin Microbiol.2007，45(11)：3743-3753.；Sang-Woo Kim，Min-Gon Kim，Hyo-Am Jung.An application of protein microarray in the screening of monoclonalantibodies against the oyster mushroom spherical virus.Analytical Biochemistry.2008，374(2)：313-317.)。此项技术是一种高通量、高灵敏度、自动化的蛋白质分析技术，在蛋白质组的功能研究、疾病诊断以及药物开发中显示出巨大的潜力。免疫胶体金技术是Faulk等在1971年创立的以钠米金为标记物，利用特异性抗原抗体反应，对抗原或抗体物质进行定位、定性乃至定量研究的标记技术。免疫胶体金技术以其灵敏度高、特异性好等特点迅速发展起来，目前已广泛渗透到生物学研究的各个领域，推动了现代诊断技术的快速发展。Danscher和Danscher在此基础上改进并发展了用银显影液增强光镜金颗粒可见性的免疫金染色法。
蛋白质芯片检测技术是近年来在生物科技领域发展起来的一项针对蛋白及多肽等高分子生物的检测技术。蛋白质芯片技术以蛋白质代替DNA作为检测目的物，比基因芯片更进一步的接近生命活动的物质层面，其高通量，微型化，高自动化等特点，不但使其成为生命信息科学研究中的重要工具，在人类疾病的诊断，预测及蛋白质组学等研究领域体现了越来越明显的比基因芯片更加直接的应用前景(Zhou X，Zhou J.Antibody-microarrays on hybrid polymeric thinfilm-coated slidesformultiple-protein immunoassays.Methods Mol Biol.2007，382：259-271.Wingren C，Borrebaeck CA.Antibody microarray analysis ofdirectly labelled complex proteomes.Curr Opin Biotechnol.2008，19(1)：55-61.)。免疫胶体金技术因具有灵敏度高、特异性好等特点，近年来迅速发展起来，利用胶体金能在对苯二酚存在的情况下催化银离子还原，使金属银在金颗粒表面聚集，而聚集的银又起催化作用，使更多的银被还原，达到可目视化效果。
鸡新城疫(ND)、鸡传染性支气管炎(IB)、禽流感(AI)和鸡传染性法氏囊病(IBD)是危害养鸡业的几种主要传染病(殷震，刘景华.动物病毒学(第二版)。北京：科学出版社，1997；YIN z，LIU JH.Animals Virology(Second edition).beijing：Science Press，1997.(in Chinese))。国内主要采用疫苗免疫接种的策略来控制四种禽病，养禽场需要对免疫抗体进行周期性监测，这样就需要一种简便、容易操作、直观可以判定的检测上述4种血清抗体禽病的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种可用于检测鸡新城疫(ND)、鸡传染性支气管炎(IB)、禽流感(AI)和鸡传染性法氏囊病(IBD)的血清抗体的可视化蛋白芯片，采用蛋白芯片可同时检测四种禽病血清样本，检测快速简便，检测结果可视化，灵敏度高，特异性强。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种检测鸡新城疫(ND)、鸡传染性支气管炎(IB)、禽流感(AI)和鸡传染性法氏囊病(IBD)的血清抗体的可视化蛋白芯片，包括以下方法制备得到：
将鸡新城疫病毒蛋白、鸡传染性支气管炎病毒蛋白、禽流感病毒蛋白和鸡传染性法氏囊病病毒蛋白分别进行纯化，稀释；将阳性对照血清，阴性对照、稀释后的鸡新城疫病毒蛋白、鸡传染性支气管炎病毒蛋白、禽流感病毒蛋白和鸡传染性法氏囊病病毒蛋白分别点样于芯片载体上；干燥，固定，用封闭剂封闭，洗涤，即得。
上述制备方法中为了达到更好效果，将纯化后的鸡新城疫病毒蛋白、鸡传染性支气管炎病毒蛋白、禽流感病毒蛋白和鸡传染性法氏囊病病毒蛋白分别稀释至2000μg/ml再分别将其点样于芯片载体上；本发明进一步优化了点样缓冲液的成分，即：用含1％BSA的Printing Buffer作为点样缓冲液来稀释蛋白；加入亲水性的BSA可以使蛋白存在于一定的亲水环境，解决了固定在芯片表面的蛋白由于干燥带来的蛋白变性问题，便于长期保存和推广使用。
所述的点样方式优选是将每种样品在芯片上重复点6次点样，形成6×6的蛋白芯片阵列；
所述的芯片载体优选是醛基化载玻片；
本发明人发现蛋白在芯片上的固定时间小于24h，会有一些蛋白尚未固定完全，造成在封闭前的漂洗和杂交反应中容易脱落的现象，以致信号值偏低或者拖尾；所以，固定时间控制在24h以上为宜，本发明人通过进一步的试验发现，当固定时间在24-96h，信号值趋于稳定，变化很小，兼顾效率和效果的平衡，本发明确定固定时间24-48小时为最优的选择。
本发明分别考察了1％BSA、0.1％明胶、5％脱脂乳和3％FBS作为封闭剂的封闭效果，从实验结果可以看出，不同封闭剂的封闭效果之间的差异显著，采用1％BSA溶液作为封闭剂，有较低的背景和较高灰度值，封闭效果要明显优于其它三种封闭剂。所以，本发明优选采用1％BSA作为封闭剂。
本发明所制备的蛋白芯片可用于同步检测鸡新城疫病毒(ND)、鸡传染性支气管炎病毒(IB)、禽流感(AI)病毒和鸡传染性法氏囊病(IBD)病毒的血清抗体，其具体的应用方法包括：将待检测的血清样品稀释后与所制备的蛋白芯片杂交，洗涤，再与金标二抗杂交，洗涤，加入显色液，观察显色结果；当阳性对照呈黑色、阴性对照无色时试验成立，样品显黑色判定为阳性。
本发明首次以纯化的全病毒蛋白作为捕获抗原来检测鸡血清中的病毒特异抗体，简化了制备工艺，降低了生产的成本，是对蛋白芯片技术在动物疾病检测技术上的一个科学尝试。运用该芯片对已知标准血清进行单独和混合检测，结果表明本发明蛋白芯片有较好的特异性，无交叉，结果可信度高。在血清稀释6400倍时仍可检出抗体，灵敏度是传统的AGP检测方法的400倍。对现地血清样品进行检测，采用本发明蛋白芯片进行检测的检出率明显高于传统的AGP方法。
本发明蛋白芯片具有快速、简便、灵敏、特异性好等特点，可同时检测四种病毒样本，无需配套荧光扫描仪来阅读和分析杂交信号，3小时内即可检测抗体，可初步评价抗体水平，非常适用于基层实验室和养殖户。
附图说明
图1本发明蛋白芯片点样方阵示例图。
图2固定时间对信号值的影响结果。
图3四种封闭缓冲液的封闭效果比较。
图4四种封闭缓冲液的灰度值柱状图。
图5不同抗原浓度下的灰度值。
图6本发明蛋白芯片与已知血清杂交后获得的扫描图；A：与AI阳性血清杂交B：与ND阳性血清杂交C：与IB阳性血清杂交D：与IBD阳性血清杂交E：与AI和IBD阳性混合血清杂交；F：与ND和IB阳性混合血清杂交G：与SPF血清杂交；H：与MD阳性血清杂交I：与ILT阳性血清杂交；J：与CIA阳性血清杂交K：与PD阳性血清杂交。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实验材料
1 种毒与血清
病毒株：A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)(Xu X，Subbarao，Cox NJ.Geneticcharacterization of the pathogenic influenza A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)virus：similarity of its hemagglutinin gene to those of H5N1 viruses from the 1997outbreaks in Hong Kong.Virology.1999，261(1)：15-19.)及H5N1阳性血清由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家禽流感参考实验室保存。IBV LX4株(Nie L，Zhang QX，Han ZX，Shao YH，Rong JG，Liu SW，Kong XG.Genetic variations ofmembrane gene of infectious bronchitis virus strains isolated in China between 1995and 2004.Bing Du Xue Bao.2007，23(4)：298-304.)和IBDV(Gao Y，Liu W，Gao H，Qi X，Lin H，Wang X，Shen R.Effective inhibition of infectious bursal disease virusreplication in vitro by DNA vector-based RNA interference Antiviral Res.2007)、NDV(F48E9)(刘胜旺，孔宪刚，童光志，马云燕，卢景良.鸡新城疫病毒F48E9株血凝素2神经氨酸酶基因免疫诱导免疫保护的初步研究.中国农业科学，2002，35(12)：1565-1569.)的毒株及相应阳性血清，及马立克氏病(MD)、传染性喉气管炎(ILT)、传染性贫血病(CIA)、鸡白痢(PD)血清来自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。
2 主要仪器和材料
醛基化载玻片购自上海百傲生物工程有限公司，紫外分光光度计为Eppendorf公司的BioPhotometer。芯片点样仪为Bio-Rad公司的VersArrayCompactsys tem，空心点样针(SM9)购自TeleChem International Inc。胎牛血清(FBS)为Biological Industries公司产品，吐温20为天津市光复精细化工研究所产品，DMSO，Triton，对苯二酚，BSA，明胶，脱脂乳购自哈尔滨鸿博公司，兔抗鸡金标二抗购自北京意宏安生物技术有限公司。
3 显色液的配制
参照文献(Duan L，Wang Y，Li SS.Rapid and simultaneous detection of humanhepatitis B virus and hepatitis C virus antibodies based on a protein chip assay usingnano-gold immunological amplificationand silver staining method.BMC Infect Dis.2005，5：53.)，并加以优化：A液：1％明胶溶液；B液：柠檬酸2.55g，柠檬酸三钠2.35g，灭菌水100ml，调PH为3.5；C液：对苯二酚1.7g溶于30ml去离子水，避光保存；D液：硝酸银溶液80mg溶于2ml去离子水中。四种溶液分别用0.45nm滤器过滤，A，B，C，D体积比为6:1:3:1均匀混合。
4 病毒蛋白的纯化
将AI，IB，ND种毒分别用灭菌PBS稀释100倍接种9日龄SPF鸡胚，每个鸡胚接种毒稀释液0.1mL，37℃孵化48-96h后收取鸡胚尿囊液，IBD接种成鸡纤维细胞48h收获细胞。将收获的病毒用超速离心和30-50％的蔗糖密度梯离心法纯化。测量蛋白浓度值，分装后放置-20℃冰箱中保存。
病毒抗原蛋白纯化后，用紫外分光光度计测量蛋白浓度值，记录结果，结果见表1。
表1 病毒蛋白纯化后浓度

实施例1 本发明蛋白芯片的制备
用含1％BSA的Printing Buffer(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na₂HPO₄，2mMKH₂PO₄，1％BSA，0.05％TW20)将纯化后的病毒抗原蛋白分别稀释至2000μg/ml，加入384孔板中(每孔20μl)。保持温度在25℃，湿度50％～60％的条件下点样至醛基化载玻片上，以SPF鸡血清作为阳性对照，Printing Buffer作为阴性对照，每种病毒抗原蛋白6个重复，形成6×6的蛋白芯片阵列(图1)。点样后室温放置1h后，干燥盒内4℃固定24-48h。选用1％BSA溶液作为封闭剂，37℃温箱孵育1h，取出后用PBS清洗3遍，每次30秒。
试验例1 制备本发明蛋白芯片的有关条件的优化
一、点样后固定时间对信号值的影响
实验发现固定时间小于24h会有一些蛋白尚未固定完全，在封闭前的漂洗和杂交反应中容易脱落，造成信号值偏低或者拖尾现象，固定时间在24-96h，信号值趋于稳定，变化很小(图2)；最优选的固定时间为24-48h。
二、四种封闭缓冲液的比较
在实施例1的蛋白芯片制备过程中分别选用3％FCS溶液、1％BSA，5％脱脂乳和0.1％明胶溶液作为封闭剂，37℃温箱孵育1h，取出后用PBS清洗3遍，每次30s。试验结果见图3和图4。
由图中可以看出，不同封闭剂封闭效果之间的差异显著，1％BSA溶液封闭明显优于其它三种封闭剂，有较低的背景和较高灰度值。
三、点样浓度的选择
将浓度为75-500μg/ml的抗原点到芯片上，封闭后与一抗杂交，再与金标二抗孵育1h，显色后观察结果。由图5可知，灰度值随固定在芯片上的抗原浓度的增加逐渐增加，当抗原浓度达到2000μg/ml时灰度值趋于饱和，几乎不再变化，因此选择2000μg/ml的抗原浓度为首先。
试验例2 蛋白芯片的敏感性和特异性试验
取AI、IB、ND、IBD四种禽病已知阳性血清各20份与实施例1所制备的蛋白芯片杂交，放入湿盒内37℃杂交1.0h。倒掉一抗阳性血清，加入新鲜的洗涤缓冲液低速摇床上洗涤10min，PBS中洗涤10min。低速甩干片子，将片子平放到湿盒内，在杂交区加胶体金标记二抗50μl，湿盒内室温杂交1小时。杂交后洗涤液洗涤3min，PBS洗涤3min。将300μl显影液加到反应区表面1-14min观察反应结果，以双蒸水迅速终止反应，洗涤晾干。用显微镜拍摄图片，用软件imageJ和spss分析并统计结果。同时用传统血清学方法(AGP法)对已知阳性血清进行检测。
试验结果显示AGP试验在对AI和IBD检测时稀释2-8倍时检出率均为100％，稀释16倍时检出率为90％和95％，稀释32倍以上时则不能测出结果；而当血清稀释至6400倍时本发明所制备的蛋白芯片对四种禽病检测的准确率仍全部为100％，表明本发明蛋白芯片灵敏度大约是AGP法的400倍。取鸡SPF血清20份，MD、ILT、CIA、PD阳性血清各与与本发明蛋白芯片杂交，结果均为阴性，证明本发明蛋白芯片有较好的特异性(图6)。
试验例3 现地血清样品的检测试验
用本发明所制备的蛋白芯片技术对18份现地血清样品进行检测，同时分别用四种禽病现有的传统血清学检测方法(HI，NT)检测血清样品，与用本发明蛋白芯片的检测结果做比较。
检测结果表明，HI，NT两种传统血清检测方法与采用本发明蛋白芯片进行检测的结果基本一致，而AGP检测方法的检出率明显低于本发明芯片的检测结果(见表2)。
表2 现地血清样品检测结果