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1、(10)申请公布号 CN 101949931 A (43)申请公布日 2011.01.19 CN 101949931 A *CN101949931A* (21)申请号 201010280466.3 (22)申请日 2010.09.03 G01N 33/569(2006.01) G01N 27/447(2006.01) (71)申请人 青岛科技大学 地址 266042 山东省青岛市四方区郑州路 53 号 (72)发明人 李雪梅 葛安青 李晓琳 张召香 梅振华 张书圣 (54) 发明名称 毛细管电泳电化学酶联免疫分析法检测遗忘 性贝类毒素 (57) 摘要 本发明描述了一种测定遗忘性贝类毒素的新 型。
2、毛细管电泳电化学酶联免疫方法， 属于分析检 测技术领域。将毛细管电泳和电化学酶联免疫分 析技术相结合， 对遗忘性贝类毒素的标准品溶液 及贝类样品进行了分析。 采用非竞争模式， 样品溶 液与 HRP 标记的遗忘性贝类毒素抗体反应， 混合 液中的遗忘性贝类毒素 - 酶标抗体复合物和剩余 HRP 标记的遗忘性贝类毒素抗体经毛细管电泳分 离后， 催化过氧化氢氧化底物邻氨基酚， 生成具有 电化学活性的物质 3- 氨基吩嗪， 电化学进行检 测。该方法简化了样品处理过程， 选择性好， 准确 度高。对遗忘性贝类毒素标准品溶液检测的线性 范围为0.5-50ng/mL， 检测限为0.2ng/mL。 是检测 贝类样。
3、品中遗忘性贝类毒素的理想方法。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 2 页 CN 101949934 A1/1 页 2 1. 毛细管电泳电化学酶联免疫分析法检测遗忘性贝类毒素， 其特征在于 ： 将毛细管电泳 - 电化学检测技术引入免疫分析中， 利用酶标遗忘性贝类毒素抗体， 将 酶催化过氧化氢 (H202) 氧化底物的酶促反应与其氧化产物的电极还原相偶合， 利用毛细管 电泳电化学技术检测所生成的氧化产物， 用此方法间接检测标准样品及贝类样品中的遗忘 性贝类毒素。 2. 按照权利要求 1 所述检测遗忘性贝类毒。
4、素的方法， 其特征在于贝类样品处理 ： 将贝 类样品去除贝壳， 贝肉用蒸馏水浸洗， 匀浆， 用盐酸调至 pH 3.4 4.0， 离心， 倾去上层清 液， 加入甲醇萃取， 收集上层萃取液， 在热水浴下减压蒸发萃取液至甲醇挥发完毕， 用十二 烷基硫酸钠胶束溶液溶解析出物。 3. 按照权利要求 1 所述检测遗忘性贝类毒素的方法， 其特征在于采用非竞争免疫分析 法 ： 遗忘性贝类毒素标准品或权利要求 2 中所述处理的贝类样品与过量的酶标遗忘性贝类 毒素抗体进行孵化反应， 酶标遗忘性贝类毒素抗体过量， 样品溶液在孵育后既含有酶标遗 忘性贝类毒素抗体 - 抗原结合物， 又含有未反应的酶标遗忘性贝类毒素抗体。
5、。 4. 按照权利要求 1 所述检测遗忘性贝类毒素的方法， 其特征在于采用毛细管电泳 - 电 化学酶联免疫分析法检测 ： 将权利要求3中的混合液进样， 酶标遗忘性贝类毒素抗体-抗原 结合物和剩余酶标遗忘性贝类毒素抗体根据迁移速率不同在分离毛细管中分成不同的区 带并顺次进入反应毛细管中， 催化缓冲液中的过氧化氢氧化底物， 生成具有电化学活性的 物质， 进入电化学检测池进行检测。 5. 按照权利要求 1 所述检测遗忘性贝类毒素的方法， 其特征在于 ： 所述缓冲液为 BR 缓 冲液， 其配制方法为 ： 取磷酸、 醋酸、 硼酸溶解稀释， 用氢氧化钠调 pH 后加入过氧化氢溶液 定容。 6. 按照权利要。
6、求 1 或 4 所述检测遗忘性贝类毒素的方法， 其特征在于 ： 所述底物为邻 氨基酚。 7. 按照权利要求 1 或 4 所述检测遗忘性贝类毒素的方法， 其特征在于 ： 所述酶为辣根 过氧化物酶 (HRP)。 权 利 要 求 书 CN 101949931 A CN 101949934 A1/4 页 3 毛细管电泳电化学酶联免疫分析法检测遗忘性贝类毒素 技术领域 0001 本发明涉及毛细管电泳电化学酶联免疫分析技术， 具体地说是毛细管电泳电化学 酶联免疫分析法检测遗忘性贝类毒素。 背景技术 0002 不断加剧的环境污染导致海洋中赤潮毒素的种类和数量不断增加， 这些赤潮毒素 通过食物链传递， 威胁人。
7、类健康。 世界各国对进口水产品中赤潮毒素的检查也越来越严格， 亟需研究一种快速、 灵敏、 可靠的方法检测海洋中的赤潮毒素。 0003 赤潮毒素又称为 “贝类毒素” 。根据人体的中毒症状， 又分为麻痹性贝毒 (PSP)、 腹 泻性贝毒 (DSP)、 遗忘性贝类毒素 (ASP)、 神经性贝毒 (NSP)、 西加鱼毒 (CFP) 等许多种。近 年来， 还不断有新的毒素及其成分被发现。贝类毒素是目前已知的最毒有机化合物。 0004 遗忘性贝类毒素主要来源于甲藻门和硅藻门， 主要是软骨藻酸毒素。软骨藻酸及 其衍生物是一类海藻产生的水溶性毒素， 主要是大亚湾拟菱形藻等微藻类生物。大亚湾拟 菱形藻水华会导致。
8、贝类等滤食性生物体内软骨藻酸的富集。软骨藻酸对 H4 细胞具有细胞 毒作用和氧化损害作用， 并可能通过氧化损害间接诱导 HO-1 蛋白表达增多， 是引起人类记 忆缺失性中毒的致病因子。摄入污染软骨藻酸毒素的贝类食物会产生 ASP， 影响中枢神经 系统， 严重时会造成人及动物的死亡。 软骨藻酸为一种谷氨酸和红藻酸的类似物， 为不饱和 烃， 极性化合物 HLB 17 ； 水溶性， 易溶于碱性溶液， 酸性条件易分解。 0005 遗忘性贝类毒素的分析方法主要包括化学分离分析及生物分析两大类。 化学分离 分析方法有免疫分析、 气相色谱分析、 高效液相色谱、 色谱质谱联用、 毛细管电泳法及胶束 毛细管电动。
9、色谱等。免疫分析法包括放射免疫分析 (RIA) 和酶联免疫分析 (ELISA) 两种， 该法具有选择性强、 灵敏度高的特点。 0006 近 20 年来， 人们着眼于从化学和药理学角度， 对赤潮毒素进行了大量的研究， 取 得了很大的进步。 由于多数赤潮毒素的主链结构差异不大， 而侧链及细微结构却千差万别， 到目前为止仍然没有可供推广的方便的监测分析手段。毛细管电泳由于其分离效率高、 分 析速度快、 样品用量少等优点， 近几年被尝试用于海洋赤潮毒素的分离检测。 毛细管电泳紫 外检测灵敏度较低， 传统的监测方法一般是对被污染的鱼类、 贝类器官进行检测， 当发现海 洋生物被污染时， 赤潮毒素对渔业及公。
10、众安全的损害也已经造成， 往往达不到及早预报及 早防治的目的。 0007 毛细管电泳免疫分析法将毛细管电泳技术引入免疫分析中来， 使其具有以下三个 方面的突出优点 ： 实现了极低的检测量的检测 ； 由于扩散路径缩短， 使得免疫反应孵化时 间大大减少 ； 酶催化产物的稀释极大减小， 可以大大缩短酶催化放大时间。 几个方面改进的 综合结果， 使得由原来几个小时的测定时间缩短到了十几分钟甚至更短。 但目前为止， 基于 毛细管电泳电化学酶联免疫分析的检测遗忘性贝类毒素的方法还未见报道。 0008 本发明将毛细管电泳电化学方法和酶联免疫分析相结合， 以 HRP 为标记酶， 选择 高灵敏度的供氢体为底物，。
11、 酶催化反应产物经毛细管电泳分离后用微电极进行安培检测， 说 明 书 CN 101949931 A CN 101949934 A2/4 页 4 可实现遗忘性贝类毒素的快速在线检测， 检测时间由常规免疫分析 1d 以上缩短至几分钟， 操作简便， 试剂消耗量少， 可满足现场检测要求。 发明内容 0009 本发明的目的是提供一种检测遗忘性贝类毒素的方法， 该方法简化了样品处理过 程、 操作程序简单、 选择性好、 灵敏快速， 特别适用于贝类样品中遗忘性贝类毒素含量的快 速检测。 0010 本方法所用仪器装置为 ： 实验采用柱端式安培检测 ： 毛细管电泳一电化学检测系 统购自西安瑞迈分析仪器有限公司， 。
12、包括一台高压电源 (MPI-A 型 )， 一台电化学分析仪 (MPI-A 型 )， 三维检测池 ； 三电极系统 ： 铂工作电极， Ag-AgCl 参比电极， 铂对电极 ； 数字式 恒温水浴箱(浙江余姚工业仪表二厂)。 聚丙烯酰胺脂内涂层毛细管(50mID， 375m OD) 购自美国赛分科技有限公司有限公司。分离管长度为 30cm， 反应管长度为 6cm。 0011 所用试剂为 ： 邻氨基酚、 磷酸、 硼酸、 醋酸、 氢氧化钠、 辣根过氧化物酶 ( 上海雪满 生物科技有限公司 )， 遗忘性贝类毒素诊断试剂盒 ( 美国， Abraxis 公司 )， 其他试剂为分析 纯， 所有溶液均用二次蒸馏水配。
13、制， 所有缓冲液及样品溶液在使用前均需用 0.22m 微孔 滤膜滤过， 且在临用前进行超声脱气处理。 0012 本发明所述的溶液配制方法具体陈述如下 ： H2O2溶液 ： 取市售 30的 11.3L， 用 二次水稀释到 100mL， 浓度为 1.010-3mol/L， 用时现配 ； OAP 溶液 ： 准确称取邻氨基酚 ( 分 析纯 )0.109g， 用 10mL 乙醇溶解并用水定容至 100mL， 浓度为 1.010-2mol/L， 使用时可用 二次蒸馏水再稀释 ； 1.010-2mol/LBR 缓冲溶液。 0013 本发明采用的技术方案为 ： 0014 1)、 遗忘性贝类毒素标准品的检测 0。
14、015 采用非竞争模式， 将一系列不同浓度的遗忘性贝类毒素标准品和 HRP 标记的遗 忘性贝类毒素抗体加入微富集管， 于 37水浴中孵育 30min， 取出后用缓冲溶液稀释到 200L， 压力进样， 运行电泳并记录。 0016 2)、 贝类样品处理 ： 将贝类去除贝壳， 贝肉浸洗、 匀浆后， 用盐酸调 pH， 离心， 倾去 上清液， 加入甲醇萃取， 收集上层萃取液， 减压蒸发萃取液至甲醇挥发完毕， 用十二烷基 硫酸钠胶束溶液溶解析出物 ； 在上述处理的贝类样品溶液中加入一定量的酶标抗体孵育 30min ； 取出后用缓冲溶液稀释到 200L， 在最佳检测条件下运行电泳并记录。 0017 所述缓冲。
15、液为 BR 缓冲液， 由磷酸、 醋酸、 硼酸加过氧化氢溶液配制而成。 0018 所述底物为邻氨基酚 ； 所述酶为辣根过氧化物酶。 0019 本发明的优点 ： 0020 1、 本发明将毛细管电泳、 电化学检测和免疫分析结合起来， 既具有毛细管电泳的 高分离效率、 电化学分析的高灵敏度， 又具有免疫分析的高选择性和专一性， 用于贝类样品 中遗忘性贝类毒素的检测， 避免了贝类样品前处理中需要过离子交换柱的烦琐程序， 简化 了操作步骤。 0021 2、 将毛细管电泳电化学酶联免疫分析法应用于遗忘性贝类毒素的检测， 检测时间 由常规免疫分析 1 天以上缩短至几分钟， 操作简便快速， 试剂消耗量少。 00。
16、22 3、 遗忘性贝类毒素免疫混合物在分离过程中使用缓冲液压池和底物液压池确保 说 明 书 CN 101949931 A CN 101949934 A3/4 页 5 分离毛细管两端压力平衡， 整个分离过程只有电场驱动力， 分离效率高， 同时由于压力的作 用也确保底物进入反应毛细管。 0023 4、 利用免疫反应的专一性， 将遗忘性贝类毒素免疫复合物及游离的酶标物经毛细 管电泳分离后， 可实现毛细管电泳电化学酶联免疫分析法测定遗忘性贝类毒素化合物。 附图说明 0024 图 1 为遗忘性贝类毒素的化学结构 ； 0025 图 2 为本发明检测遗忘性贝类毒素的毛细管电泳电化学免疫分析装置示意图 ； 0。
17、026 图 3 为本发明毛细管电泳电化学免疫分析酶催化体系的反应方程式及酶催化产 物在电极上发生反应的方程式 ； 0027 图 4 为本发明一个实施例中酶标遗忘性贝类毒素抗体的毛细管电泳谱图 ； 0028 图5为本发明一个实施例中标准样品中遗忘性贝类毒素-酶标抗体复合物及过量 酶标遗忘性贝类毒素抗体的毛细管电泳谱图， 峰 1 为过量酶标遗忘性贝类毒素抗体催化底 物形成的电泳峰， 峰 2 为遗忘性贝类毒素 - 酶标抗体复合物催化底物形成的电泳峰 ； 0029 图 6 为本发明一个实施例中贝类样品中的遗忘性贝类毒素与酶标抗体反应后的 毛细管电泳谱图， 峰1为过量酶标遗忘性贝类毒素抗体催化底物形成的。
18、电泳峰， 峰2为遗忘 性贝类毒素 - 酶标抗体复合物催化底物形成的电泳峰。 具体实施方式 0030 以下为实施本发明的具体示例， 其作用在于进一步阐明本发明的内容， 使阅读者 更容易理解， 但不构成对本发明要求的保护范围的限定或限制。 0031 实施例一毛细管电泳电化学酶联免疫分析法检测标准样品中的遗忘性贝类毒素 0032 所用仪器及试剂如前所述。 0033 采用非竞争模式， 将一系列不同浓度的遗忘性贝类毒素标准品和 HRP 标记的遗 忘性贝类毒素抗体加入微富集管， 于 37水浴中孵育 30min， 取出后用缓冲溶液稀释到 200L， 压力进样 (9cm， 20s)， 运行电泳并记录。采用非竞。
19、争模式， HRP 标记的遗忘性贝类毒 素抗体 (Ab*) 过量， 样品溶液在孵育后既含有 HRP 标记的遗忘性贝类毒素抗体 - 抗原结合 物(Ag-Ab*)， 又含有未反应的遗忘性贝类毒素抗体(Ab*)， 混合液中的遗忘性贝类毒素-酶 标抗体复合物和剩余酶标遗忘性贝类毒素抗体根据迁移速率不同在分离毛细管中分成不 同的区带并顺次进入反应毛细管中， 经毛细管电泳分离后， 分别在反应毛细管中催化缓冲 液中的过氧化氢氧化底物邻氨基酚， 生成具有电化学活性的物质 3- 氨基吩嗪， 进入电化 学检测池进行检测， 可检测到两个电泳峰。 遗忘性贝类毒素的浓度不同， 形成的遗忘性贝类 毒素抗原抗体结合物的量不同。
20、， 催化过氧化氢氧化邻氨基酚生成氧化产物 3- 氨基吩嗪 的浓度就不同， 产生不同的电化学信号， 由此可对酶标遗忘性贝类毒素 - 抗体复合物以及 贝类样品中的遗忘性贝类毒素进行定量分析。 0034 考察了运行缓冲溶液浓度和 pH 值、 分离电压、 检测电势、 进样时间和电压对遗忘 性贝类毒素检测的影响， 确定最佳检测条件是 ： 1.010-2mol/L BR 缓冲溶液 (pH 5.0) ； 分 离电压 15kV ； 检测电势 -350mV ； 压力进样 (9cm， 20s)。 0035 在最佳检测条件下， 遗忘性贝类毒素标准品溶液检测的线性范围为 0.5-50ng/mL， 说 明 书 CN 1。
21、01949931 A CN 101949934 A4/4 页 6 检测限为 0.2ng/mL。工作曲线的线性回归方程为 y 0.02279x+0.52558( 其中 x 为遗忘性 贝类毒素浓度， ng/mL， y 为峰面积， C， n 5)， 其相关系数 0.9962。 0036 实施例二使用毛细管电泳电化学酶联免疫分析方法检测贝类样品中的遗忘性贝 类毒素 0037 将贝类(扇贝或牡蛎)去除贝壳， 贝肉用蒸馏水浸洗3次， 匀浆10min， 冰水浴超声 10min， 用 6mol/L 盐酸调至 pH 3.4 4.0， 离心 5min， 倾去上层清液， 加入甲醇搅匀， 超声萃 取5min， 离心5。
22、min， 收集上层萃取液， 在3550水浴下减压蒸发萃取液至甲醇挥发完毕， 用十二烷基硫酸钠胶束溶液溶解析出物 ； 0038 在上述处理的贝类样品溶液中加入过量酶标遗忘性贝类毒素抗体， 在 37孵化反 应 30min， 贝类样品中的遗忘性贝类毒素和酶标抗体反应， 进行电泳分离检测。 0039 实验采用非竞争模式， HRP 标记的遗忘性贝类毒素抗体 (Ab*) 过量， 样品溶液在孵 育后既含有 HRP 标记的遗忘性贝类毒素抗原抗体结合物 (Ag-Ab*)， 又含有未反应的遗忘性 贝类毒素抗体 (Ab*)， 经毛细管电泳分离后， 分别在反应毛细管中催化底物溶液反应， 可检 测到两个电泳峰。遗忘性贝。
23、类毒素的浓度不同， 形成的遗忘性贝类毒素抗原抗体结合物的 量不同， 催化过氧化氢氧化邻氨基酚生成氧化产物 3- 氨基吩嗪的浓度就不同， 产生不同 的电化学信号， 由此可对酶标遗忘性贝类毒素 - 抗体复合物以及贝类样品中的遗忘性贝类 毒素进行定量分析。 0040 其实验结果 ： 0041 如图 4 所示， HRP 标记的遗忘性贝类毒素抗体从毛细管入口端进样， 在 14kV 高压 电场下向阴极迁移， 进入电化学检测池进行检测， 电泳峰出现在 100s 附近。 0042 如图5所示， 遗忘性贝类毒素与过量的酶标抗体溶液在37孵化反应30min， 形成 遗忘性贝类毒素抗原抗体结合物， 将混合溶液 14。
24、kV 电动进样 5s 后进行电泳分离检测， 峰 1 为过量酶标遗忘性贝类毒素抗体催化底物形成的电泳峰， 峰2(出峰时间约200s)为遗忘性 贝类毒素抗原抗体结合物催化底物形成的电泳峰， 两个电泳峰峰形较好， 可以达到基线分 离。随着遗忘性贝类毒素抗原浓度的增大， 峰 1 逐渐变小， 峰 2 逐渐变大， 根据非竞争免疫 分析的原理， 峰 1 和峰 2 分别代表酶标遗忘性贝类毒素抗体和遗忘性贝类毒素抗原抗体结 合物。 0043 如图 6 所示， 在酶标遗忘性贝类毒素抗体溶液中加入扇贝样品， 扇贝样品中的遗 忘性贝类毒素同酶标抗体反应， 生成遗忘性贝类毒素抗原抗体 ( 峰 2)， 说明扇贝样品中含 有遗忘性贝类毒素。 说 明 书 CN 101949931 A CN 101949934 A1/2 页 7 图 1 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 101949931 A CN 101949934 A2/2 页 8 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 101949931 A 。