一种蔬菜中乐果残留检测预处理方法 技术领域 ：
本发明属于蔬菜农药残留检测领域， 是一种用于蔬菜中乐果残留分析样品处理的 方法。 背景技术 ：
农药残留污染是影响范围最大的一种有机污染。尤其对生长期短的蔬菜类农产 品， 由于虫害多、 施药量大， 加之违规使用等， 农药残留超标现象更为突出。 在广泛应用的农 药中， 有机磷、 氨基甲酸酷类农药毒性强， 由于有机磷、 氨基甲酸酯类农药使用不当或误食 造成蔬菜农药残留超标而引起的中毒现象十分严重。世界范围内农药中毒事件屡有发生， 其中 69.5％是由有机磷农药所致。农药残留污染问题也给我国对外贸易带来影响， 近年来 欧盟、 美国、 日本、 加拿大等西方发达国家或地区， 相继对进口食品中农药残留量等卫生指 标提出了愈来愈严格的要求。 我国出口的农产品屡遭国外拒收、 扣留、 退货、 索赔， 不仅造成 严重经济损失， 也使我国外贸声誉受到影响。
现有的农药残留检测主要采用化学计量法和液相、 气相色谱法或气相色谱 - 质谱 联用法， 周期长、 成本高， 无法满足生产在线检测需要。近年来提出的农药残留快速检测方 法有酶抑制法、 紫外分光光度计法和近红外色谱分析方法， 存在不能对农药品种定性和定 量测试、 稳定性差和运行维护成本高等缺点， 制约了该技术的生产应用和推广。
农药残留分析过程包括样品前处理和检测两部分。其中样品前处理操作复杂， 所 用时间占整个分析过程的三分之二， 其间产生的误差是影响农药残留分析精度的重要原 因。 有些农药的性质在样品制备过程中或制备后也会发生变化， 影响整个分析的准确性。 经 典的农药残留样品前处理方法有匀浆、 索氏提取、 超声波提取、 液 - 液萃取、 柱层析等等， 这 些方法效率低、 需要大量的样品和有机溶剂， 威胁操作人员的健康， 造成环境污染。因此提 高农药残留分析的速度与样品的稳定性是目前农药残留分析中亟待解决的问题。
技术内容 ：
本发明提出一种蔬菜中乐果残留检测样品超高压提取前处理工艺， 旨在简化农药 残留样品前处理工艺， 提高样品稳定性。
超高压全称是 “超高冷等静压 (Ultra high isostatic hydrostatic pressure at roomtemperature)” ， 简称为冷等静压 (Cold Isostatic High Pressure， CIHP)， 超高压提 取是在常温或较低温度 ( 通常低于 100℃ ) 的条件下， 对原料液迅速施加 100MPa-1000MPa 的液体静压力， 在预定压力保持一段时间， 使原料液细胞内外压力达到平衡 ( 有效成分达 到溶解平衡 ) 后迅速卸压， 使细胞内外渗透压力差突然增大， 细胞内的有效成分穿过细胞 膜 ( 细胞膜的结构在超高压下发生变化 )， 转移到细胞外的提取液中， 达到提取的目的。
超高压提取技术具有提取率 ( 收率 ) 高、 提取液稳定性好和高效环保等特点。采 用超高压预处理技术和现有蔬菜农药残留分析技术结合， 可以提高蔬菜农药残留分析效率 和检测精度， 用于机场蔬菜进出口管理、 大型超市和蔬菜批发市场等地蔬菜农药残留在线 检测， 很有现实意义和市场价值。本发明的上述目的可通过以下技术方案实现， 结合附图说明如下 ：
四分法取样 ： 将蔬菜取可食部分， 用干净纱布轻轻擦去样品表面附着物， 用对角 线分割法沿纵向切分， 取对角部分充分混匀， 用食品粉碎机中粉碎。取样粉碎后充分混匀， 保证样品的均匀性， 根据试验要求准确称取若干份样品放入聚乙烯薄膜袋或其他柔性容器 中， 每份样品量为 25-30g。
添加提取溶剂 ： 残留农药含量甚微 ( 痕量 )， 提取效果的好坏直接影响到检测结 果的精确性。蔬菜中农药残留主要为强极性的有机磷农药， 考虑溶剂极性、 农药理化特 性、 样本性质以及检测方法， 选用极性强的丙酮作为提取溶剂， 每份样品提取溶剂体积为 50-60mL， 样品添加溶剂后， 排出袋中空气， 用塑料封口机密封， 编号待用。
超高压处理 ： 密封编号的样品装入高压容器， 一次可以根据容量装入多个样品。 安 装容器盖， 启动液压系统加压， 系统压力到达 200-300Mpa， 保压 2-3 分钟， 然后卸压至常温， 将样品取出滤去杂质， 取滤液待后续测试。
所述的蔬菜样品超高压处理过程在常温下进行， 不需要加热。
在预定压力范围内， 所述的蔬菜样品超高压处理采取直接升压或间歇式升压到预 定压力。 在蔬菜样品超高压处理过程中， 一次可以根据容量装入多个样品。
上述的蔬菜中乐果残留检测预处理方法， 采用丙酮或其它提取溶剂也可用于蔬菜 中其他有机磷农药残留检测预处理过程。
超高压提取法与常用的农药残留前处理方法相比， 具有以下优势 ：
1. 提取率高。农药残留量是痕量检测， 对提取效率的要求很高。超高压提取法操 作简单， 提取效率高。 传统的蔬菜农药残留提取方法中， 溶剂提取法要使用大量的有机溶剂 才能保证提取效率， 固相提取法虽然减少了溶剂的用量， 但是因为操作复杂， 需要专业人员 分析。
2. 稳定性好。 在样品制备过程中和制备后， 一些性质不稳定的农药极易发生变化， 色谱检测中常需要对提取的样品进行特殊处理， 如衍生化等， 这些过程操作复杂、 大大延长 了检测的时间。超高压处理可以提高样品稳定性， 简化样品处理工艺流程， 减少分析时间， 是超高压提取法应用于蔬菜农药残留分析的一个重要优势。超高压提取是常温提取， 对于 热稳定性差的农药可减少提取过程中的农药损失， 提高检测结果的准确性。
3. 使用溶剂少。研究表明 ： 超高压提取的溶剂用量只有回流和热浸的 1/2。能降 低溶剂的消耗， 不仅降低成本， 而且减少对操作人员的危害和环境污染。
4. 杂质少。 由于超高压提取可以使酶失活， 对于检测洋葱、 大蒜、 韭菜等含硫蔬菜， 可以减少对检测的干扰。
5. 超高压提取同时可以对多个样本进行提取， 效率高。
附图说明 ：
图 1 基于超高压提取的蔬菜预处理技术流程图 ；
图 2 超高压处理后的样品经过滤后根据检测方法需要进行不同处理的流程图。用 于后续处理。具体实施方式 ：
实施例 1
超高压处理的蔬菜农药残留气谱 - 质谱检测分析。程序如下 ：
(1) 配制乐果溶液
用电子天平精密称取乐果标准品 1000mg， 置于 50mL 棕色容量瓶内， 用二氯甲烷定 容， 得到 1000mg/L 的乐果标准贮备液， 贮存到低于 4℃冰箱中， 使用时作为母液根据要求配 制成相应的工作浓度。
(2) 制备白菜样品
采用四分法提取白菜样品， 根据试验要求准确称取 2 份， 每份 25g。将乐果标准品 配制成一定使用浓度添加到每份蔬菜中， 制成乐果浓度为 2mg/kg 的样品， 添加后放置 1h。 乐果经过一段时间可以渗透到植物内部， 样本更接近于实际检测状态。
(3) 超高压提取
将 1 份白菜样品放入软质塑料袋中， 用封口机密封， 进行超高压处理 ( 加压至 300MPa、 保压 3 分钟 )， 提取后从高压容器内取出， 待后续处理 ； 另 1 份样品采用普通匀浆法 处理待用。
(4) 净化和浓缩
将上一步骤处理的两份样品分别用下述程序净化和浓缩 ：
①将经过超高压提取的样品经铺有两层滤纸和约 4gCelite545 的布氏漏斗真空 / 负压抽滤， 并用 10mL 丙酮清洗塑料袋及抽滤瓶， 合并滤液 ；
②将滤液置于分液漏斗内， 向滤液中加入约 5g 氯化钠使溶液处于饱和状态。猛烈 振摇 2-3min， 静置 10min， 使丙酮与水相分层， 水相用一定体积 ( 采用与提取液体积为 1 ∶ 1 的量 ) 二氯甲烷振摇 2min， 再静置分层 ；
③将丙酮与二氯甲烷提取液合并经装有 20g 无水硫酸钠的玻璃漏斗脱水滤入 250mL 圆底烧瓶中， 再以约 20mL 二氯甲烷分数洗涤容器和无水硫酸钠。洗涤液也并入烧瓶 中， 用旋转蒸发器在 50℃温度下浓缩近干， 浓缩液定量转移到 5mL 容量瓶中， 加二氯甲烷定 溶至 5mL ；
④如果溶液过于混浊用 2μm 滤膜过滤， 待测。
(5) 检测
将经过净化处理过两份样品用 GC-MC 检测， 分析农药含量。
色谱条件 ：
载气： He， 1.0mL/min ； 进样口温度： 200 ℃， 无 分 流 进 样， 进 样 量 1μL ； 柱流 量： 1min ； 炉温 ： 初 始 温 度 100 ℃， 保 持 1min， 以 15 ℃ /min 升 温 到 230 ℃ ； 色谱柱型号 ： P190915-433， HP-5μs， 30.0mm×250μm×0.25μm。
质谱条件 ：
离子源温度 ： 230℃ ； 四极杆温度 ： 150℃。
经过超高压处理和匀浆处理白菜样品回收率测试结果如表 1。
表 1 经过超高压处理和匀浆处理白菜样品添加回收率
由表 1 看出， 经过超高压处理后测得的添加回收率为 87％， 普通匀浆法添加回收 率仅为 75％， 相差 12％。
实施例 2
制备乐果添加水平分别为 1.0mg/kg、 0.5mg/kg、 0.1mg/kg 的白菜样品， 每种样品 9 份， 随机分成 3 组， 分别采用超高压预处理工艺、 农业行业标准 - 蔬菜和水果中有机磷、 有机 氯、 拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药多残留检测方法 (NY/T7611-2004) 和国家标准 - 食品 中有机磷农药残留量测定方法 (GB/T5009.20-2003) 进行前处理， 采用色谱 - 质谱联仪进行 检测。每组测得结果取平均值记入表 2。
表 2 不同预处理方法添加乐果白菜样品测得的添加回收率
从表 2 可以看出， 与两种常用的前处理方法相比， 超高压提取法的添加回收率在 1.0mg/kg、 0.5mg/kg 和 0.1mg/kg 水平上比 GB/T5009.20-2003 方法分别高 5.8％、 8.0％和 8.3％， 比 NY/T761.1-2004 分别高 1.9％、 1.7％和 0.9％。
使用低毒有机溶剂提取是农药残留分析发展的趋势， 可以减少对环境造成的二次 污染。超高压提取法所使用的丙酮毒性远远小于 NY/T761.1-2004 法的乙腈溶剂， 因此， 超 高压提取法具有比较明显的有优势。
实施例 3
(1) 采用四分法分割白菜。将分割后的白菜切碎， 再使用粉碎机进一步粉碎， 达到 糊状为准 ；
(2) 制备蔬菜提取溶液。按照白菜 25g， 添加试剂体积 50mL 装入塑料袋， 使用封口 机封口， 将袋中物质充分摇匀， 静置 1 小时， 让试剂对蔬菜成分进行萃取。然后使用布氏漏 斗和中速滤纸对袋中物质进行过滤， 得到蔬菜提取溶液 ；
(3) 使用电子天平秤取乐果固体标准品， 放置在 10mL 的离心管中 ； 使用蔬菜提取 -3 -6 溶液溶解乐果固体， 配置含农药浓度范围为 10 -10 的蔬菜提取溶液若干份， 在离心管中 摇匀。蔬菜提取溶液数量和浓度见表 3 和表 4 ；
表 3 无压样品的浓度水平
表 4 有压样品的浓度水平
(4) 将步骤 3 中配置的溶液装入塑料袋中， 排除袋中气体， 使用封口机封口， 记录 样品乐果浓度， 编号待用 ；
(5) 将步骤 4 中有压样品进行超高压预处理 ( 加压至 300MPa、 保压 3 分钟 )， 无压 样品直接进行步骤 6 ；
(6) 将样品装入离心管， 待近红外光谱检测。
(7) 近红外光谱扫描 ：
A) 仪器预热 30 分钟左右， 确保仪器性能稳定性 ； 选择 1mm 光程反射构件， 固定在 枪式探头上 ；
B) 启动 OPUS 软件， 设置近红外光谱仪参数 ；
C) 测试空气本底 ；
D) 在 OPUS 环 境 中 设 置 测 试 样 品 名、 保存路径和样品的重复测量次数 (RepeatedMeasurements) ；
E) 将样品摇匀倒入 5mL 烧杯中， 将枪式光线探头插入样品， 使样品没过探头的流 通池， 晃动几下探头， 确保液体样品填满流通池， 排净气泡 ；
F) 近红外光谱检测期间保持光纤探头不动， 避免液体流动影响光的反射 ；
G) 检测完毕， 系统自动保存光谱， 供建模使用 ；
H) 清洗光纤探头和烧杯。 将反射构件拆下， 用丙酮涮洗探头和反射构件 3 次， 用脱 脂棉将包裹光纤的金属体擦拭净。 为了不磨损探头表面和反射构件， 其余部分自然风干 ； 烧 杯中样品倒入废液池， 使用丙酮清洗烧杯 3 次， 自然风干。
为了加快检测速度， 准备 5mL 烧杯 4 个， 轮流使用盛装样品， 25mL 烧杯 3 个， 轮流使 用清洗光纤探头。
(8) 近红外光谱数据处理 ：
无压样品光谱预处理和建模方法： 基 线 校 正， 去 除 10000-12000cm-1 和 4000-4500cm-1 两 段 光 谱， 归 一 化 处 理， 然 后 进 行 25 点 平 滑， 在 6101.9-5448.1 和 -1 4601.5-4499.3cm 内使用 FD+MSC 预处理方法建立 PLS 模型。 有压样品光谱预处理和建模方法： 基 线 校 正， 去 除 11000-12000cm-1 和 4000-4100cm-1 两段光谱， 21 点平滑， 在 6800-6099.9cm-1 和 4601.5-4248.5cm-1 内使用 VN 预 处理方法建立 PLS 模型。
分别使用无压样品和有压样品的验证集样品， 对其光谱模型进行预测。由于在建 -3 -4 模过程中， 10 浓度的样品剔除， 模型样品范围缩至 10 -10-6， 预测样品中的 10-3 浓度的样 品 25 号不再进行预测。结果如表 5 所示， 单位为 ： mg/L。
表 5 样品验证集预测结果
注： 编号为 Wxx 样品为无压样品， 编号为 Yxx 样品为有压样品。
由表 5 可见， 在相关系数不高的情况下， W26 预测样品的真实值和预测值较为 接近， 相对误差为 26.57 ％， W27 和 W28 的真实值和预测值之间差别较大， 相对误差分别 为 -49.39％和 -93.06％， 预测效果不理想。
Y26 和 Y27 预测样品的真实值和预测值较为接近， 相对误差分别为 1.55 ％和
8.17％， Y28 的真实值和预测值相对误差为 -86.88％。较无压状态的样品， 预测效果有所提 高。
在整个建模过程中， 有压样品组数据相对比较稳定， 出现奇异点的次数不多， 各种 预处理方法得到的相关参数也比较接近。无压样品组数据出现的奇异点比较多， 并且不够 稳定， 各种处理结果之间的数据相差比较大。 从预测结果分析， 有压样品的光谱模型预测效 果优于无压样品的光谱模型的预测效果， 使近红外光谱的检测限从 10-4 提高到 10-5。