快速检测氯霉素残留的胶体金试纸条制备方法.pdf

摘要
申请专利号：	CN201010219939.9	申请日：	2010.07.07
公开号：	CN101943701A	公开日：	2011.01.12
当前法律状态：	终止	有效性：	无权
法律详情：	未缴年费专利权终止IPC(主分类):G01N 33/577申请日:20100707授权公告日:20140122终止日期:20140707\|\|\|授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/577申请日:20100707\|\|\|公开
IPC分类号：	G01N33/577	主分类号：	G01N33/577
申请人：	南昌大学
发明人：	刘成梅; 罗舜菁; 涂宗财; 陈文荣; 陈婷婷; 严杰琳; 高鹏; 陈臣
地址：	330000 江西省南昌市红谷滩新区学府大道999号
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内容摘要

一种快速检测氯霉素残留的胶体金试纸条制备方法，是针对现有技术的制备工艺条件复杂的问题，在胶体金标记氯霉素抗体的方法、重悬液、结合垫处理液方面做出了改进，制备工艺简单、易行，结果证明试纸条具有高灵敏度、高特异性、准确简便、重复性好等优点，制备试纸条的方法整个工艺条件稳定、成熟、可靠，可以制备出质量较好的胶体金试纸条，可以用于氯霉素试纸条的生产，同时对其它试纸条的生产具有一定的参考价值。

权利要求书

1：一种快速检测氯霉素残留的胶体金试纸条制备方法，包括胶体金的制备，胶体金标记氯霉素单克隆抗体制备金标抗体，金标抗体纯化，金标抗体结合垫以及样品垫的制备，硝酸纤维膜检测线和控制线的包被，试纸条组装，其特征是：同时加入保护剂和氯霉素单克隆抗体制备金标抗体，制得的金标抗体使用重悬液离心纯化，金标抗体结合垫先用结合垫处理液处理，再喷上金标抗体而制得。
2：根据权利要求 1 所述的快速检测氯霉素残留的胶体金试纸条制备方法，其特征是：所述保护剂是海藻糖，海藻糖终质量浓度为 0.5％～ 3％。
3：根据权利要求 1 所述的快速检测氯霉素残留的胶体金试纸条制备方法，其特征是：金标抗体离心纯化所用的重悬液其配方是终质量浓度为 0.1％～ 0.5％吐温 20， 1％～ 3％海藻糖， 0.5％～ 2％ BSA， 0.01mol/L PBS pH7.4 溶液。
4：根据权利要求 1 所述的快速检测氯霉素残留的胶体金试纸条制备方法，其特征是：结合垫处理液配方为终质量浓度为 0.1％～ 0.5％吐温 20， 1％～ 3％海藻糖， 5％～ 10％蔗糖， 0.01mol/L PBS pH7.4 溶液。

说明书

快速检测氯霉素残留的胶体金试纸条制备方法
    【技术领域】
     本发明涉及快速检测氯霉素残留的方法。背景技术氯霉素 (chloramphenicol， CAP) 是由土壤中的一些特定的委内瑞拉菌属所产生的一种抗菌剂，对革兰氏阳性、阴性菌、立克次氏体，衣原体，支原体均有抑制作用，但被证明其在动物性食品中的残留会给人类带来很大的毒副作用，比如再生障碍性贫血，并且较难代谢排除。为此，许多国家禁止了氯霉素的使用，比如美国，加拿大，澳大利亚和欧盟成员国。2002 年中国农业部《动物性食品兽药残留规定》中规定氯霉素在可食部分不得检出。但有的不法分子由于氯霉素的廉价、抑菌效果良好，在利益的驱使下，仍然利用氯霉素治疗动物的细菌性感染等疾病。
     目前，检测氯霉素残留的方法有很多： HPLC、 GC、 LC-MS-MS、 GC-MS-MS，这些方法虽然都很精确，有的检测限甚至能达到 0.1ng/g，但都需要仪器，有的还很昂贵，耗时也较长。基于免疫学的 ELISA 方法，虽然减小了检测成本，也缩短了检测时间，但操作繁琐，需要专业人员进行操作。胶体金免疫层析方法检测氯霉素残留提供了一种快速、简便的氯霉素检测方法，这是一种利用胶体金标记单克隆抗体，利用抗原抗体的特异性结合判断样品中被检测物质的含量。其制备方法包括利用柠檬酸三钠法制备胶体金，在适当的标记条件下标记氯霉素单克隆抗体得到金标抗体，然后离心纯化金标抗体，接着将纯化的好的金标抗体喷在已处理好的玻璃纤维膜 ( 结合垫 ) 上，同时将包被抗原氯霉素 - 卵清蛋白 (CAP-OVA)、二抗羊抗小鼠 IgG 包被在硝酸纤维膜 (NC 膜 ) 上，将干燥好的 NC 膜、结合垫、玻璃纤维膜 ( 样品垫 )、吸水纸依次有序贴在 PVC 底板上，制备胶体金试纸条。但在标记方法、离心纯化时重悬液配方、结合垫处理液配方方面较为复杂。
     发明内容
     本发明目的在于针对现有技术氯霉素胶体金试纸条制备方法的不足，提供一种简单、易行检测氯霉素残留的胶体金试纸条的制备方法。
     实现本发明的技术方案如下：在现有的氯霉素胶体金试纸条制备的技术基础上，本发明采用胶体金标记氯霉素单克隆抗体时采用一种同时加入保护剂和抗体的方法制备金标抗体，这样由于保护剂的加入，更有利于抗体的标记；由于现有的重悬液配方复杂，金标抗体的浓缩效果欠佳，在离心纯化时使用经过改良的重悬液；由于现有的结合垫处理液不能产生理想的结合垫释放效果，金标抗体结合垫采用经过改良的结合垫处理液处理。
     本发明的工艺特点是：采用同时加入保护剂和氯霉素单克隆抗体的方法制备金标抗体，制得的金标抗体使用重悬液离心纯化，金标抗体结合垫先用结合垫处理液处理，再喷上金标抗体而制得。保护剂是海藻糖，海藻糖终质量浓度为 0.5％～ 3％，金标抗体离心纯化所用的重悬液其配方是终质量浓度为 0.1％～ 0.5％吐温 20， 1％～ 3％海藻糖， 0.5％～ 2％ BSA， 0.01mol/L PBS pH7.4 溶液，结合垫处理液配方为终质量浓度为 0.1％～ 0.5％吐温 20， 1％～ 3％海藻糖， 5％～ 10％蔗糖， 0.01mol/L PBS pH7.4 溶液。
     本发明的有益效果是，工艺步骤操作简单、易行，试剂价格低廉、易得。本发明氯霉素胶体金试纸条检测灵敏度达 3ng/ml，检测范围为 3 ～ 1000ng/ml ；特异性实验证明与新霉素、土霉素、链霉素、四环素甲砜霉素等氯霉素的结构类似物的交叉反应在 1％以下；假阳性率在 5％以下、假阴性率在 1％以下；同一批次的试纸条 10 条结果统一，说明产品重复性良好；常温干燥条件下能保持 20 天，稳定性良好。附图说明说明书附图 1 为氯霉素胶体金试纸条的示意图。
     图中 1 为样品垫， 2 为样品滴加方向， 3 为金标抗体结合垫， 4 为控制线 (C 线 )， 5为吸水纸， 6 为 PVC 底板， 7 为层析方向， 8 为检测线 (T 线 )， 9 为 NC 膜。
     说明书附图 2 为检测结果示意图。
     图中， 1 为阴性结果， 2 为阳性结果， 3 为无效， C 为控制线， T 为检测线。
     具体实施方式实施例 1
     1. 胶体金制备：在冷凝回流装置中的圆底烧瓶中加入 100ml 超纯水和 1ml 1％的氯金酸溶液，加热至沸后加入 1ml1％浓度的柠檬酸三钠溶液，观察颜色变化，待颜色稳定时继续反应 10min。冷却静置一天，利用粒度仪检测制得粒径为 40nm 胶体金，其最大吸收峰在 526nm。
     2. 胶体金标记抗体：最少稳定蛋白量再增加 10％左右为最佳标记蛋白用量。胶体金用 0.1mol/L 的 HCl 和 K2CO3 调至 pH8.2，取最佳用量氯霉素单克隆抗体 16μg/ml、终质量浓度为 1％的海藻糖同时加入 100ml 胶体金溶液，在磁力搅拌器下混合 10min 后，加入终质量浓度为 0.5％的 BSA， 4℃保存过夜后冷冻超速离心纯化。
     3. 金标抗体的纯化：
     (1) 金标抗体溶液常温低速 (1500rpm) 离心 20min，弃去出凝聚的金颗粒形成的沉淀，取红色上清溶液于 4℃再 8000r/min 离心 30min。
     (2) 溶液分为三层：透明上清，管底可流动的暗红色沉淀及管底壁上黑色致密的金颗粒层。将可流动的暗红色沉淀转移到另外一个离心管中，用重悬液重悬至原量，重悬液：终质量浓度为 0.1％％吐温 20， 1％海藻糖， 0.5％ BSA， 0.01mol/L PBS pH7.4 溶液。
     (3) 重复离心 3 次，最后重悬至原体积的 1/20，加入 0.1％的叠氮钠 4℃保存备用。
     4. 结合垫的前处理：样品垫和结合垫经剪裁后通过浸蘸前处理液进行水化和封闭处理，浸泡 30min 后 37℃、 2h 烘干，结合垫处理液：含有终质量浓度为 0.3％％吐温 20， 2％海藻糖， 10％蔗糖， 0.01mol/L PBS pH7.4 溶液。
     5. 喷金：金标抗体调浓度至 OD526 为 5，点样机将金标抗体在结合垫上均匀点样，点 2 样量在 30μl/cm ， 37℃干燥。
     6. 检测线抗原和控制线二抗的包被：将包被抗原 CAP-OVA 稀释到 1.5mg/ml，二抗稀释度为商品化稀释 1mg/ml 倍，手工点样在 NC 膜上分别划 T 线和 C 线，间距为 5mm， 37℃干燥。
     7. 试纸条的组装：将 2cm×0.3cmNC 膜、 1.8cm×0.3cm 吸水纸、 1cm×0.3cm 金标垫、 1.5cm×0.3cm 样品垫按图 1 方式依次粘贴在 PVC 胶板上，即成氯霉素胶体金试纸条。
     8. 将氯霉素竞争品按 1ng/m、 3ng/ml、 5ng/ml、 10ng/ml 的浓度依次滴加在氯霉素胶体金试纸条上，用 PBS 作为对照组，观察实验结果。
     实施例 2
     1. 根据实施例 1 中 1 所述。
     2. 胶体金标记抗体：最少稳定蛋白量再增加 10％左右为最佳标记蛋白用量。胶体金用 0.1mol/L 的 HCl 和 K2CO3 调至 pH9.2，取最佳用量氯霉素单克隆抗体 16μg/ml、终质量浓度为 0.5％的海藻糖同时加入 100ml 胶体金溶液，在磁力搅拌器下混合 10min 后，加入终质量浓度为 0.5％的 BSA， 4℃保存过夜后冷冻超速离心纯化。
     3. 金标抗体的纯化：
     (1) 金标抗体溶液常温低速 (1500rpm) 离心 20min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀，取红色上清溶液于 4℃再 10000r/min 离心 30min。
     (2) 溶液分为三层：透明上清，管底可流动的暗红色沉淀及管底壁上黑色致密的金颗粒层。将可流动的暗红色沉淀转移到另外一个离心管中，用重悬液重悬至原量，重悬液：终质量浓度为 0.2％吐温 20， 2％海藻糖， 1％ BSA， 0.01mol/L PBS pH7.4 溶液。
     (3) 重复离心 3 次，最后重悬至原体积的 1/20，加入 0.1％的叠氮钠 4℃保存备用。
     4. 结合垫的前处理：样品垫和结合垫经剪裁后通过浸蘸前处理液进行水化和封闭处理，浸泡 30min 后 37℃、 2h 烘干，结合垫处理液：含有终质量浓度为 0.2％％吐温 20， 1％海藻糖， 8％蔗糖， 0.01mol/L PBS pH7.4 溶液。
     5. 根据实施例 1 中 5 所述。
     6. 根据实施例 1 中 6 所述。
     7. 根据实施例 1 中 7 所述。
     8. 根据实施例 1 中 8 所述。
     实施例 3
     1. 根据实施例 1 中 1 所述。
     2. 胶体金标记抗体：最少稳定蛋白量再增加 10％左右为最佳标记蛋白用量。胶体金用 0.1mol/L 的 HCl 和 K2CO3 调至 pH9.2，取最佳用量氯霉素单克隆抗体 16μg/ml、终质量浓度为 2％的海藻糖同时加入 100ml 胶体金溶液，在磁力搅拌器下混合 10min 后，加入终质量浓度为 0.5％的 BSA， 4℃保存过夜后冷冻超速离心纯化。
     3. 金标抗体的纯化：
     (1) 金标抗体溶液常温低速 (1500rpm) 离心 20min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀，取红色上清溶液于 4℃再 12000r/min 离心 30min。
     (2) 溶液分为三层：透明上清，管底可流动的暗红色沉淀及管底壁上黑色致密的金颗粒层。将可流动的暗红色沉淀转移到另外一个离心管中，用重悬液重悬至原量，重悬液：终质量浓度为 0.5％％吐温 20， 3％海藻糖， 2％ BSA， 0.01mol/L PBS pH7.4 溶液。
     (3) 重复离心 3 次，最后重悬至原体积的 1/20，加入 0.1％的叠氮钠 4℃保存备用。
     4. 结合垫的前处理：样品垫和结合垫经剪裁后通过浸蘸前处理液进行水化和封闭处理，浸泡 30min 后 37℃、 2h 烘干，结合垫处理液：含有终质量浓度为 0.5％％吐温 20，3％海藻糖， 6％蔗糖， 0.01mol/L PBS pH7.4 溶液。
     5. 根据实施例 1 中 5 所述。
     6. 根据实施例 1 中 6 所述。
     7. 根据实施例 1 中 7 所述。
     8. 根据实施例 1 中 8 所述。
     实施例 4
     1. 根据实施例 1 中 1 所述。
     2. 胶体金标记抗体：最少稳定蛋白量再增加 10％左右为最佳标记蛋白用量。胶体金用 0.1mol/L 的 HCl 和 K2CO3 调至 pH9.2，取最佳用量氯霉素单克隆抗体 16μg/ml、终质量浓度为 1.5％的海藻糖同时加入 100ml 胶体金溶液，在磁力搅拌器下混合 10min 后，加入终质量浓度为 0.5％的 BSA， 4℃保存过夜后冷冻超速离心纯化。
     3. 金标抗体的纯化：
     (1) 金标抗体溶液常温低速 (1500rpm) 离心 20min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀，取红色上清溶液于 4℃再 12000r/min 离心 30min。
     (2) 溶液分为三层：透明上清，管底可流动的暗红色沉淀及管底壁上黑色致密的金颗粒层。将可流动的暗红色沉淀转移到另外一个离心管中，用重悬液重悬至原量，重悬液：终质量浓度为 0.3％％吐温 20， 2.5％海藻糖， 1.5％ BSA， 0.01mol/L PBS pH7.4 溶液。 (3) 重复离心 3 次，最后重悬至原体积的 1/20，加入 0.1％的叠氮钠 4℃保存备用。
     4. 结合垫的前处理：样品垫和结合垫经剪裁后通过浸蘸前处理液进行水化和封闭处理，浸泡 30min 后 37 ℃、 2h 烘干，结合垫处理液：含有终质量浓度为 0.3 ％吐温 20， 2.5％海藻糖， 5％蔗糖， 0.01mol/L PBS pH7.4 溶液。
     5. 根据实施例 1 中 5 所述。
     6. 根据实施例 1 中 6 所述。
     7. 根据实施例 1 中 7 所述。
     8. 根据实施例 1 中 8 所述。

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1、(10)申请公布号 CN 101943701 A (43)申请公布日 2011.01.12 CN 101943701 A *CN101943701A* (21)申请号 201010219939.9 (22)申请日 2010.07.07 G01N 33/577(2006.01) (71)申请人南昌大学地址 330000 江西省南昌市红谷滩新区学府大道 999 号 (72)发明人刘成梅罗舜菁涂宗财陈文荣陈婷婷严杰琳高鹏陈臣 (54) 发明名称快速检测氯霉素残留的胶体金试纸条制备方法 (57) 摘要一种快速检测氯霉素残留的胶体金试纸条制备方法，是针对现有技术的制备工艺。

2、条件复杂的问题，在胶体金标记氯霉素抗体的方法、重悬液、结合垫处理液方面做出了改进，制备工艺简单、易行，结果证明试纸条具有高灵敏度、高特异性、准确简便、重复性好等优点，制备试纸条的方法整个工艺条件稳定、成熟、可靠，可以制备出质量较好的胶体金试纸条，可以用于氯霉素试纸条的生产，同时对其它试纸条的生产具有一定的参考价值。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书 1 页说明书 4 页附图 1 页 CN 101943708 A1/1 页 2 1. 一种快速检测氯霉素残留的胶体金试纸条制备方法，包括胶体金。

3、的制备，胶体金标记氯霉素单克隆抗体制备金标抗体，金标抗体纯化，金标抗体结合垫以及样品垫的制备，硝酸纤维膜检测线和控制线的包被，试纸条组装，其特征是：同时加入保护剂和氯霉素单克隆抗体制备金标抗体，制得的金标抗体使用重悬液离心纯化，金标抗体结合垫先用结合垫处理液处理，再喷上金标抗体而制得。 2. 根据权利要求 1 所述的快速检测氯霉素残留的胶体金试纸条制备方法，其特征是：所述保护剂是海藻糖，海藻糖终质量浓度为 0.5 3。 3. 根据权利要求 1 所述的快速检测氯霉素残留的胶体金试纸条制备方法，其特征是：金标抗体离心纯化所用的重悬液其配方是终质量浓度为。

4、0.1 0.5吐温 20， 1 3 海藻糖， 0.5 2 BSA， 0.01mol/L PBS pH7.4 溶液。 4. 根据权利要求 1 所述的快速检测氯霉素残留的胶体金试纸条制备方法，其特征是：结合垫处理液配方为终质量浓度为 0.1 0.5吐温 20， 1 3海藻糖， 5 10蔗糖， 0.01mol/L PBS pH7.4 溶液。权利要求书 CN 101943701 A CN 101943708 A1/4 页 3 快速检测氯霉素残留的胶体金试纸条制备方法技术领域 0001 本发明涉及快速检测氯霉素残留的方法。背景技术 0002 氯霉素 (chloramphenicol。

5、， CAP) 是由土壤中的一些特定的委内瑞拉菌属所产生的一种抗菌剂，对革兰氏阳性、阴性菌、立克次氏体，衣原体，支原体均有抑制作用，但被证明其在动物性食品中的残留会给人类带来很大的毒副作用，比如再生障碍性贫血，并且较难代谢排除。为此，许多国家禁止了氯霉素的使用，比如美国，加拿大，澳大利亚和欧盟成员国。2002 年中国农业部动物性食品兽药残留规定中规定氯霉素在可食部分不得检出。但有的不法分子由于氯霉素的廉价、抑菌效果良好，在利益的驱使下，仍然利用氯霉素治疗动物的细菌性感染等疾病。 0003 目前，检测氯霉素残留的方法有很多： HPLC、 GC、。

6、LC-MS-MS、 GC-MS-MS，这些方法虽然都很精确，有的检测限甚至能达到 0.1ng/g，但都需要仪器，有的还很昂贵，耗时也较长。基于免疫学的 ELISA 方法，虽然减小了检测成本，也缩短了检测时间，但操作繁琐，需要专业人员进行操作。胶体金免疫层析方法检测氯霉素残留提供了一种快速、简便的氯霉素检测方法，这是一种利用胶体金标记单克隆抗体，利用抗原抗体的特异性结合判断样品中被检测物质的含量。其制备方法包括利用柠檬酸三钠法制备胶体金，在适当的标记条件下标记氯霉素单克隆抗体得到金标抗体，然后离心纯化金标抗体，接着将纯化的好的金标抗体喷在已处理好的玻璃。

7、纤维膜 ( 结合垫 ) 上，同时将包被抗原氯霉素 - 卵清蛋白 (CAP-OVA)、二抗羊抗小鼠 IgG 包被在硝酸纤维膜 (NC 膜 ) 上，将干燥好的 NC 膜、结合垫、玻璃纤维膜 ( 样品垫 )、吸水纸依次有序贴在 PVC 底板上，制备胶体金试纸条。但在标记方法、离心纯化时重悬液配方、结合垫处理液配方方面较为复杂。发明内容 0004 本发明目的在于针对现有技术氯霉素胶体金试纸条制备方法的不足，提供一种简单、易行检测氯霉素残留的胶体金试纸条的制备方法。 0005 实现本发明的技术方案如下：在现有的氯霉素胶体金试纸条制备的技术基础上，本发明采用胶体金标记氯霉。

8、素单克隆抗体时采用一种同时加入保护剂和抗体的方法制备金标抗体，这样由于保护剂的加入，更有利于抗体的标记；由于现有的重悬液配方复杂，金标抗体的浓缩效果欠佳，在离心纯化时使用经过改良的重悬液；由于现有的结合垫处理液不能产生理想的结合垫释放效果，金标抗体结合垫采用经过改良的结合垫处理液处理。 0006 本发明的工艺特点是：采用同时加入保护剂和氯霉素单克隆抗体的方法制备金标抗体，制得的金标抗体使用重悬液离心纯化，金标抗体结合垫先用结合垫处理液处理，再喷上金标抗体而制得。保护剂是海藻糖，海藻糖终质量浓度为 0.5 3，金标抗体离心纯化所用的重悬液其配方是终质量。

9、浓度为 0.1 0.5吐温 20， 1 3海藻糖， 0.5 2 BSA， 0.01mol/L PBS pH7.4 溶液，结合垫处理液配方为终质量浓度为 0.1 0.5吐说明书 CN 101943701 A CN 101943708 A2/4 页 4 温 20， 1 3海藻糖， 5 10蔗糖， 0.01mol/L PBS pH7.4 溶液。 0007 本发明的有益效果是，工艺步骤操作简单、易行，试剂价格低廉、易得。本发明氯霉素胶体金试纸条检测灵敏度达3ng/ml，检测范围为31000ng/ml ；特异性实验证明与新霉素、土霉素、链霉素、四环素甲砜霉素等氯霉素的结构。

10、类似物的交叉反应在 1以下；假阳性率在 5以下、假阴性率在 1以下；同一批次的试纸条 10 条结果统一，说明产品重复性良好；常温干燥条件下能保持 20 天，稳定性良好。附图说明 0008 说明书附图 1 为氯霉素胶体金试纸条的示意图。 0009 图中1为样品垫， 2为样品滴加方向， 3为金标抗体结合垫， 4为控制线(C线)， 5为吸水纸， 6 为 PVC 底板， 7 为层析方向， 8 为检测线 (T 线 )， 9 为 NC 膜。 0010 说明书附图 2 为检测结果示意图。 0011 图中， 1 为阴性结果， 2 为阳性结果， 3 为无效， C 为控制线， T 为检测。

11、线。具体实施方式 0012 实施例 1 0013 1. 胶体金制备：在冷凝回流装置中的圆底烧瓶中加入 100ml 超纯水和 1ml 1的氯金酸溶液，加热至沸后加入 1ml1浓度的柠檬酸三钠溶液，观察颜色变化，待颜色稳定时继续反应10min。冷却静置一天，利用粒度仪检测制得粒径为40nm胶体金，其最大吸收峰在 526nm。 0014 2.胶体金标记抗体：最少稳定蛋白量再增加10左右为最佳标记蛋白用量。胶体金用 0.1mol/L 的 HCl 和 K2CO3调至 pH8.2，取最佳用量氯霉素单克隆抗体 16g/ml、终质量浓度为 1的海藻糖同时加入 100ml 胶。

12、体金溶液，在磁力搅拌器下混合 10min 后，加入终质量浓度为 0.5的 BSA， 4保存过夜后冷冻超速离心纯化。 0015 3. 金标抗体的纯化： 0016 (1)金标抗体溶液常温低速(1500rpm)离心20min，弃去出凝聚的金颗粒形成的沉淀，取红色上清溶液于 4再 8000r/min 离心 30min。 0017 (2) 溶液分为三层：透明上清，管底可流动的暗红色沉淀及管底壁上黑色致密的金颗粒层。将可流动的暗红色沉淀转移到另外一个离心管中，用重悬液重悬至原量，重悬液：终质量浓度为 0.1吐温 20， 1海藻糖， 0.5 BSA， 0.01mol/L PB。

13、S pH7.4 溶液。 0018 (3) 重复离心 3 次，最后重悬至原体积的 1/20，加入 0.1的叠氮钠 4保存备用。 0019 4. 结合垫的前处理：样品垫和结合垫经剪裁后通过浸蘸前处理液进行水化和封闭处理，浸泡 30min 后 37、 2h 烘干，结合垫处理液：含有终质量浓度为 0.3吐温 20， 2海藻糖， 10蔗糖， 0.01mol/L PBS pH7.4 溶液。 0020 5.喷金：金标抗体调浓度至OD526为5，点样机将金标抗体在结合垫上均匀点样，点样量在 30l/cm2， 37干燥。 0021 6. 检测线抗原和控制线二抗的包被：将包被抗原。

14、CAP-OVA 稀释到 1.5mg/ml，二抗稀释度为商品化稀释1mg/ml倍，手工点样在NC膜上分别划T线和C线，间距为5mm， 37干燥。说明书 CN 101943701 A CN 101943708 A3/4 页 5 0022 7. 试纸条的组装：将 2cm0.3cmNC 膜、 1.8cm0.3cm 吸水纸、 1cm0.3cm 金标垫、 1.5cm0.3cm 样品垫按图 1 方式依次粘贴在 PVC 胶板上，即成氯霉素胶体金试纸条。 0023 8. 将氯霉素竞争品按 1ng/m、 3ng/ml、 5ng/ml、 10ng/ml 的浓度依次滴加在氯霉素胶体金试纸条上。

15、，用 PBS 作为对照组，观察实验结果。 0024 实施例 2 0025 1. 根据实施例 1 中 1 所述。 0026 2.胶体金标记抗体：最少稳定蛋白量再增加10左右为最佳标记蛋白用量。胶体金用 0.1mol/L 的 HCl 和 K2CO3调至 pH9.2，取最佳用量氯霉素单克隆抗体 16g/ml、终质量浓度为 0.5的海藻糖同时加入 100ml 胶体金溶液，在磁力搅拌器下混合 10min 后，加入终质量浓度为 0.5的 BSA， 4保存过夜后冷冻超速离心纯化。 0027 3. 金标抗体的纯化： 0028 (1)金标抗体溶液常温低速(1500rpm)离心20min。

16、，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀，取红色上清溶液于 4再 10000r/min 离心 30min。 0029 (2) 溶液分为三层：透明上清，管底可流动的暗红色沉淀及管底壁上黑色致密的金颗粒层。将可流动的暗红色沉淀转移到另外一个离心管中，用重悬液重悬至原量，重悬液：终质量浓度为 0.2吐温 20， 2海藻糖， 1 BSA， 0.01mol/L PBS pH7.4 溶液。 0030 (3) 重复离心 3 次，最后重悬至原体积的 1/20，加入 0.1的叠氮钠 4保存备用。 0031 4. 结合垫的前处理：样品垫和结合垫经剪裁后通过浸蘸前处理液进行水化和封闭处理，。

17、浸泡 30min 后 37、 2h 烘干，结合垫处理液：含有终质量浓度为 0.2吐温 20， 1海藻糖， 8蔗糖， 0.01mol/L PBS pH7.4 溶液。 0032 5. 根据实施例 1 中 5 所述。 0033 6. 根据实施例 1 中 6 所述。 0034 7. 根据实施例 1 中 7 所述。 0035 8. 根据实施例 1 中 8 所述。 0036 实施例 3 0037 1. 根据实施例 1 中 1 所述。 0038 2.胶体金标记抗体：最少稳定蛋白量再增加10左右为最佳标记蛋白用量。胶体金用 0.1mol/L 的 HCl 和 K2CO3调至 pH9.2，取最佳用。

18、量氯霉素单克隆抗体 16g/ml、终质量浓度为 2的海藻糖同时加入 100ml 胶体金溶液，在磁力搅拌器下混合 10min 后，加入终质量浓度为 0.5的 BSA， 4保存过夜后冷冻超速离心纯化。 0039 3. 金标抗体的纯化： 0040 (1)金标抗体溶液常温低速(1500rpm)离心20min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀，取红色上清溶液于 4再 12000r/min 离心 30min。 0041 (2) 溶液分为三层：透明上清，管底可流动的暗红色沉淀及管底壁上黑色致密的金颗粒层。将可流动的暗红色沉淀转移到另外一个离心管中，用重悬液重悬至原量，重悬液：。

19、终质量浓度为 0.5吐温 20， 3海藻糖， 2 BSA， 0.01mol/L PBS pH7.4 溶液。 0042 (3) 重复离心 3 次，最后重悬至原体积的 1/20，加入 0.1的叠氮钠 4保存备用。 0043 4. 结合垫的前处理：样品垫和结合垫经剪裁后通过浸蘸前处理液进行水化和封闭处理，浸泡 30min 后 37、 2h 烘干，结合垫处理液：含有终质量浓度为 0.5吐温 20，说明书 CN 101943701 A CN 101943708 A4/4 页 6 3海藻糖， 6蔗糖， 0.01mol/L PBS pH7.4 溶液。 0044 5. 根据实施例 1 。

20、中 5 所述。 0045 6. 根据实施例 1 中 6 所述。 0046 7. 根据实施例 1 中 7 所述。 0047 8. 根据实施例 1 中 8 所述。 0048 实施例 4 0049 1. 根据实施例 1 中 1 所述。 0050 2.胶体金标记抗体：最少稳定蛋白量再增加10左右为最佳标记蛋白用量。胶体金用 0.1mol/L 的 HCl 和 K2CO3调至 pH9.2，取最佳用量氯霉素单克隆抗体 16g/ml、终质量浓度为 1.5的海藻糖同时加入 100ml 胶体金溶液，在磁力搅拌器下混合 10min 后，加入终质量浓度为 0.5的 BSA， 4保存过夜后冷冻超速离。

21、心纯化。 0051 3. 金标抗体的纯化： 0052 (1)金标抗体溶液常温低速(1500rpm)离心20min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀，取红色上清溶液于 4再 12000r/min 离心 30min。 0053 (2) 溶液分为三层：透明上清，管底可流动的暗红色沉淀及管底壁上黑色致密的金颗粒层。将可流动的暗红色沉淀转移到另外一个离心管中，用重悬液重悬至原量，重悬液：终质量浓度为 0.3吐温 20， 2.5海藻糖， 1.5 BSA， 0.01mol/L PBS pH7.4 溶液。 0054 (3) 重复离心 3 次，最后重悬至原体积的 1/20，加入 0.1。

22、的叠氮钠 4保存备用。 0055 4. 结合垫的前处理：样品垫和结合垫经剪裁后通过浸蘸前处理液进行水化和封闭处理，浸泡 30min 后 37、 2h 烘干，结合垫处理液：含有终质量浓度为 0.3吐温 20， 2.5海藻糖， 5蔗糖， 0.01mol/L PBS pH7.4 溶液。 0056 5. 根据实施例 1 中 5 所述。 0057 6. 根据实施例 1 中 6 所述。 0058 7. 根据实施例 1 中 7 所述。 0059 8. 根据实施例 1 中 8 所述。说明书 CN 101943701 A CN 101943708 A1/1 页 7 图 1 图 2 说明书附图 CN 101943701 A 。

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