使用金属纳米粒子探针和动态光散射的分析物检测 关于联邦政府赞助的研究或开发的声明
根据美国国家科学基金青年教授杰出科研基金 (CAREER) 奖 DMR0552295 和 DMI 奖 0506531， 美国政府可以拥有本发明的某些权利。相关申请的交叉引用
本申请要求 2008 年 1 月 3 日提交的美国临时申请 61/018,719 和 2008 年 3 月 6 日提交的美国临时申请 61/034,334 的优先权。根据 35USC 119 要求所述临时申请的优先 权并且所述申请通过引用被并入。
技术领域
本发明涉及使用受体功能化的金属纳米粒子来检测化学物类、 生物分子和生物靶 标 ( 均称为分析物 ) 的系统和方法。受体是可以通过共价或非共价化学相互作用与分析物 相互作用的任何化学物类和生物分子的通用术语。 背景技术 存在对检测用于如下各种目的的各种化学物类、 生物分子和生物靶标的需要 ： 如 医学诊断、 人和动物健康监测、 生命科学研究、 药物筛选和药剂开发、 环境保护、 工业过程监 测、 食品安全监测、 违法药物使用检测、 国家安全、 其他化学过程和生物过程的监测。
附图说明
图 1 是包括三个不同的实施方式的本发明的示意性图解。该图解是基于使用金纳 米粒子 (GNP) 与动态光散射 (DLS) 测量偶联的均相免疫测定的实例。在实施方式 A 中， 使 用两种不同的探针。探针是与匹配的抗体对轭合的金纳米粒子。在实施方式 B 中， 使用单 一类型的探针。分析物含有多个探针的结合位点， 因此在与探针上的受体结合后可以引起 纳米粒子聚集。在实施方式 C 中， 使用单一类型的探针。然而， 分析物与探针之间的结合不 引起粒子聚集。相反， 存在聚集诱导物来引发纳米粒子聚集。分析物与聚集诱导物彼此相 互竞争与探针结合。
图 2 是 DLS 系统的基本设计。
图 3a-c 代表实施使用多个检测器同时进行多个样品的 DLS 测量 (a， b) 或使用单 个检测器和可旋转圆盘传送带连续进行多个样品的 DLS 测量 (c) 的多样品平台的 DLS 系统 的示意图。图 3(b) 是图 (a) 中所显示的系统的部分侧视图。注意 ： (1) 样品平台可以是可 移动的或固定的。所显示的平台包括 12 个固定的测定溶液容器 ( 在这种情况下， 是 12 个 微孔 ) 或可移动的容器以容纳测定溶液。(3) 当它可以旋转时， 可以使用如 (c) 中所示的 可移除的测定溶液容器连续地添加样品和从圆盘传送带移除样品。 可以将此模式设置为用 于在预定的时间间隔连续测量多个样品。(4) 入射光束与散射光束之间的相对角可以通过 检测器检测， 其通常为 0-90 度之间的角。此处所图解的角为大约 13-25 度。(5) 可以用微 流装置代替圆盘传送带， 该微流装置可以放置在圆盘传送带上和从圆盘传送带上移去。 (6) 样品支架和检测器的数目可以为 1 或任何其他数目。图 4 是 通 过 DLS 在 不 同 浓 度 测 量 的 金 纳 米 杆 (GNR， 尺 寸 为 10×40nm)、 40nm(GNP40) 和 98nm(GNP98) 球形金纳米粒子的平均散射光强度。
图5是： (a) 化学结构 ； 和 (b)GNP 和 GNR 粒子的 TEM 图像 ； (c)GNP、 GNR 探针以及 它们与抗体对的轭合物 GNP-dAb 和 GNR-cAb 的 UV-Vis 吸收谱。两种抗体为抗 - 游离 PSA 抗体 ； (d) 由未轭合的 GNP、 GNR 的 DLS 测量的粒度分布 ； 和 (e) 由它们与抗体对的轭合物测 量的粒度分布。
图 6 显示在样品溶液中具有 1.0ng/mL 的 f-PSA 的测定溶液 (a) 的粒度分布的 DLS 数据。f-PSA 标准溶液 (b) 的测定结果由 DLS 分析获得。测定结果被表示为如 (a) 中所显 示的面积 A 与面积 B 的数值比率。
图 7(a)PAA-GNP( 上 ) 和 PEG-GNP( 下 ) 的化学结构。 柠檬酸盐 -GNP(b)、 PAA-GNP(c) 和 PEG-GNP(d) 在含有不同浓度的 NaCl( 图例为 NaCl 浓度 ) 的 PBS 缓冲溶液 (pH 7.4) 中 的 UV-Vis 吸收谱。
图 8 显示 ： (a) 在溶液中含有 0ng/mL 和 0.1ng/mL 的 f-PSA 的测定溶液的 DLS 数 据 ( 粒度分布 ) ； (b) 纳米粒子的流体动力学直径与 f-PSA 浓度的曲线图。进行了两组测 定。测定显示出良好的测定内和测定间再现性二者。结果由 Precision Detectors， Inc. 的 Cool Batch40 DLS 系统获得。 图 9 显示使用 100nm GNP 抗体轭合物探针在标准溶液中进行的总 PSA 的测定结 果。通过将匹配的单克隆抗总 PSA 抗体对非共价吸附至两批金纳米粒子上来制备 100nm GNP 探针。 测定结果表示为测定溶液的平均粒子直径。 测定在两个不同的浓度范围内进行 ： (a)0.2-10ng/mL 和 (b)0.001 至 1ng/mL。
图 10 显示上清液中的 PC3 细胞所分泌的总 PSA 的两次重复的测定结果， 该测定使 用 100nm GNP 抗体轭合物探针。结果表示为平均粒度。通过将匹配的单克隆抗总 PSA 抗体 对非共价吸附至两批金纳米粒子上来制备 100nm GNP 探针。在生长 24 小时后收集细胞上 清液。样品 PC3A1、 PC3B1 和 PC3C1 在培养皿中具有大约 1 百万、 50 万和 25 万个细胞。为 了进行测定， 将 2μL 的细胞上清液添加到 40μL 的混合纳米探针溶液中。将溶液在室温下 孵育 5-10 分钟后， 通过 DLS 读出结果。
图 11 是使用与图 7 和图 8 中所述相同的探针进行的四种人血清样品的测定结果。
图 12 是分别含有浓度为 34.5、 17.3、 8.6 和 4.3ng/mL 肌动蛋白的肌动蛋白的四种 样品溶液的测定结果。肌动蛋白溶液是细胞裂解物。两种探针通过将匹配的单克隆抗肌动 蛋白抗体与两批 100nm GNP 轭合来制备。前两个柱 ( 蓝色和深红色 ) 是来自两个不同测定 的平均粒度的 DLS 数据， 而第三个柱 ( 浅黄色 ) 是两次测定结果的平均值。
图 13 显示在 37℃下孵育 2 小时后与两种不同的金纳米粒子探针混合的小鼠 IgG 测定溶液的流体动力学直径 (Dh) 改变。(- □ - ： 由小鼠 IgG 与 0.1nM BSA 轭合的 GNP 制 备的对照 ； -Δ- ： 与 0.1nM 山羊抗小鼠轭合的 GNP 混合的小鼠 IgG。该测定使用 BSA 轭合的 GNP 作为研究的对照 )。
图 14 是使用经 0.01nM 山羊抗小鼠 IgG 轭合的 GNP(GNP- 抗 -IgG) 进行的小鼠 IgG 检测的直接测定结果。 使用四参数逻辑拟合而不加权将测量的数据与逻辑模型拟合。 (LLOD ＝ 0.0078ng/mL， 3σ， R＝2 ； y ＝ 187.55435+(35.46758-187.55435)/(1+x/46.97037)0.6302， R2 ＝ 0.9994 ； 误差线 ： 标准偏差。
图 15 是使用两种纳米粒子探针 GNP-IgG 和 GNP- 抗 -IgG 进行的小鼠 IgG 检测的竞 争性测定的结果。 此处， GNP- 抗 -IgG 充当探针， 并且 GNP-IgG 充当聚集诱导物。 分析物小鼠 IgG 与 GNP-IgG 竞争结合 GNP- 抗 -IgG。 GNP- 抗 -IgG 和 GNP-IgG 探针二者的浓度均为 0.1nM。 将各测定溶液在室温下孵育 4.5 小时。使用四参数逻辑拟合而不加权将测量的数据与逻 辑模型拟合。(LLOD ＝ 283.0036ng/mL， 3σ， R＝2； y ＝ 42.21247+(71.12096-42.21247)/ 0.76428 2 (1+x/5023.40461) ， R ＝ 0.9895， 误差线 ： 标准偏差。
图 16 是使用金纳米粒子探针和动态光散射的 DNA 均相检测的示意图。
图 17 是 DNA 轭合前后金纳米粒子 (AuNP) 的 UV-Vis 吸收谱 (a) 和粒度分布 (b)。
图 18 是在存在完美匹配的靶 DNA(a) 和浓度为 10pM 的单碱基对错配的 DNA(b) 的 条件下的 DNA-AuNP 测定溶液的粒度和粒度分布 ( 直径， nm)。
图 19 是由 DLS 测量所确定的含有不同浓度的靶 DNA 的测定溶液的平均直径和其 对靶 DNA 浓度所绘制的图。 发明内容 本发明的实施方式涉及用于监测和检测化学物类、 生物分子和生物靶标 ( 均称为 分析物 ) 的高度灵敏的、 快速的且方便的均相一步式分析测定， 所述化学物类、 生物分子和 生物靶标包括但不限于蛋白、 抗体、 抗原、 酶、 核酸、 激素、 药物、 药物中间体、 环境污染化学 品和物类、 化学战剂和生物战剂、 细菌和病毒、 合成的化学物质。
在一般的实施方式中， 本发明涉及用于检测分析物的分析方法， 所述分析方法包 括提供多个探针的步骤， 所述多个探针各自包含与多拷贝的相同或不同受体轭合的金属纳 米粒子。图 1 是本发明的一般图解。该图解是基于使用金纳米粒子 (GNP) 与动态光散射 (DLS) 测量偶联的均相免疫测定的实例。受体可以为天然受体 ( 例如， 抗体、 蛋白、 DNA 等 ) 或合成的受体 ( 例如， 分子、 离子、 聚合物或其他化学物类 )。 将怀疑含有至少一种分析物的 样品溶液与探针接触以形成测定溶液， 其中在分析物的存在下， 包含分析物的溶液中的一 部分探针变得聚集。动态光散射 (DLS) 用于通过测量测定溶液的聚集度来定量分析物。如 通过 DLS 所确定的由测定溶液所获得的 DLS 数据至少测定样品溶液中分析物的存在， 并且 一般还测定样品溶液中分析物的浓度。 所确定的分析物浓度可用于为医学诊断提供基础或 促进为诊断如个体是否患有 ( 或有可能患有 ) 癌症提供基础的进一步测试， 或用于其他目 的， 如环境监测。
在本文中称为单一探针类型实施方式的另一实施方式中 ( 图 1 中所图解的实施方 式 B)， 第一探针是所提供的仅有的探针类型。该探针在一个纳米粒子上含有多拷贝的单一 类型或混合类型的受体。 在该实施方式中， 分析物可以具有多个结合位点， 并且相同探针类 型可以结合分析物的多个位点以产生纳米探针聚集体。仅通过举例， 纳米粒子可以与可结 合抗原的不同表位的多重多克隆抗体层轭合。 这种结合将引起探针聚集， 该聚集可通过 DLS 检测。另一实例是带有金属离子结合配体层的纳米粒子探针， 所述金属离子结合配体层附 着在表面上。探针可以通过附着至探针的配体与金属离子形成配位络合物。当探针与含有 作为分析物的金属离子的样品接触时， 纳米粒子探针将由于络合物形成而发生聚集， 所述 聚集可以通过 DLS 检测。
在本文中称为多探针类型实施方式的另一实施方式中 ( 如图 1 所图解的实施方式
A)， 方法包括多个第一探针和多个第二探针二者， 其中所述第二探针包含与不同于第一受 体的第二受体轭合的金属纳米粒子。 第一金属纳米粒子和第二金属纳米粒子可以相同或不 同。在该实施方式中， 第一受体和第二受体均可以被选择来与分析物结合并且它们一般识 别分析物上的不同位点来结合。如此， 各受体一般不抑制其他受体的结合。
在受体包含关于抗原靶标的抗体的情况下， 抗体组合应有资格作为 “匹配的对” ， 意思是指它们可以识别抗原上的不同表位， 所以它们不明显地妨碍彼此的结合。在这具体 的情况下， 第一受体和第二受体在本文中可以如 ELISA 中一样被称为 “捕获抗体” 和 “检测 抗体” 。然而， 本发明与 ELISA 关系很小。ELISA 是异相多步式免疫测定。本发明的实施方 式提供均相测定， 所述测定消除 ELISA 对于下列的需求 ： 将捕获抗体结合至通常附着在板 孔底部的固相上， 添加抗原以及容许该抗原与结合的抗体复合， 洗涤以获得未结合的产物 以及容许检测抗体与抗原结合的第二结合步骤。另一个不同是使用动态光散射 (DLS) 来定 量分析物， 相比之下 ELISA 通过下列步骤来实现定量 ： 通过使用酶探针、 荧光探针或放射性 探针测量与基质结合的标记的二抗的量。
在第三实施方式中 ( 如在图 1 中所图解的实施方式 C)， 所述方法包括使用多个单 一探针， 所述单一探针具有与纳米粒子表面轭合的多拷贝受体。探针将主要与分析物的一 个位点结合。探针粒子可以通过与分析物不同的分子或材料形成聚集体。该分子或材料可 被称为 “聚集诱导物” 。该分子或材料可以是另一化学物类、 不同的纳米粒子或者与样品溶 液中的分析物共存的或从非样品溶液的来源添加到样品溶液中的材料。 聚集诱导物与分析 物竞争来与探针结合。探针和分析物之间的结合将抑制由聚集诱导物所引起的探针聚集。 当探针与样品溶液相接触时， 探针将形成通过聚集诱导物分子引入的聚集物。分析物将不 引起纳米粒子探针聚集或引起与聚集诱导物相比少得多的纳米粒子探针聚集。因此， 如果 样品溶液中存在分析物， 则探针聚集度将较低。探针聚集度与分析物浓度成反比。该实施 方式的一个实例是利用在纳米粒子表面上含有单一类型一抗的探针的竞争性免疫测定。 该 探针可以通过与二抗溶液混合而聚集在一起。在该情况下， 二抗是聚集诱导物。例如， 如果 探针含有从小鼠中产生的一抗， 则可以使用山羊抗小鼠 IgG 来作为聚集诱导物。当探针溶 液与含有抗原的样品溶液混合时， 抗原分子将与二抗竞争来与探针结合。由于抗原 - 探针 结合将不引起探针聚集。 所以， 当样品中存在抗原时， 将发生与样品中不存在抗原时相比较 小程度的探针聚集。样品溶液中的抗原浓度可以通过 DLS 测量来定量并且其与纳米粒子聚 集度成反比。
根据本发明的实施方式的定量包括 ： 将光 ( 例如， 紫外光、 可见光、 近红外光或红 外光 ) 导向与多个纳米粒子探针混合的含分析物的溶液 ； 以及测量来自测定溶液的散射光 信号。通过使用动态光散射而由测定溶液获得 DLS 数据至少测定了样品溶液中分析物的存 在， 并且一般还测定样品溶液中分析物的浓度。 DLS 数据包括但不限于测定溶液中的粒度和 / 或粒度分布和 / 或粒子扩散系数。 所确定的分析物浓度可用于如本文所述的多种目的， 例 如， 为医学诊断提供基础或促进为诊断如个体是否患有 ( 或有可能患有 ) 癌症提供基础的 进一步测试。
纳米粒子一般为金属， 如金或银， 已知它们均提供大的散射截面 (Yguerabide， J. ； Yguerabide， E.E.Anal.Biochem.1998， 262， 137.)。 纳米粒子可以具有不同的形状和化学组 成， 如球形纳米粒子、 纳米杆 (nanorod)、 纳米壳 (nanoshell)、 合金纳米粒子 ( 具有多于一种金属组分的纳米粒子 )、 纳米笼 (nanocage)、 纳米颗粒 (nanorice) 等。提供大的散射截 面的其他纳米粒子或胶体粒子也可能是有用的。 在本文中一般性地对于金纳米粒子描述本 发明。例如， 粒度在 10 至 100 纳米范围内的金纳米粒子， 包括球形粒子、 纳米杆或纳米壳， 在表面等离子体共振波长区域内提供异常大的光散射截面。 金纳米粒子的光散射量级是比 诸如荧光素之类的强荧光染料的光发射更高的数量级。 金纳米粒子的这种强光散射性质已 被应用于生物细胞的光学显微镜成像以供定量评估， 但是没有被用于通过动态光散射法在 均相溶液中进行的定量分析和测定。 强的光散射使得金和银纳米粒子成为用于分析应用的 优异的光学探针 / 示踪物。
受体可以是已知与给定的靶分析物缔合的任何部分。在竞争性测定实施方式中， 受体还将结合聚集诱导物。分析物和聚集诱导物竞争来与受体结合。
受体适于结合分析物。 受体可以包括但不限于抗体、 DNA、 RNA、 包括酶在内的蛋白、 细胞或细胞组分、 仿生物 (biomimetic)、 可以与分析物特异性结合的合成分子或材料。 仿生 物受体可以包括分子印迹抗体、 基于 DNA 的适体和肽核酸 (PNA)。
受体分子 ( 天然的和合成的 ) 将通过共价或非共价化学相互作用被附着至金属纳 米粒子以制备探针。 用于将诸如抗体的生物受体分子通过非共价化学相互作用连接至金纳 米粒子的方法是已经熟知并且通常被实践的。对于共价连接， 纳米粒子应在粒子表面具有 至少一种化学官能团如羧酸或胺， 或者可以将受体连接至纳米粒子的任何其他合适的官能 团。受体分子将与化学官能团反应形成共价化学键合。
分析物可以是任何化学物类、 生物分子和生物靶标。化学物类为任何天然的和合 成的化学物质 ( 中性的或带电荷的， 具有或不具有确定的分子结构 ) ； 诸如汞 (II)、 铅 (II) 的离子 ； 聚合物 ； 材料 ； 药物和药剂 ； 药物候选物或任何其他化学物质。生物分子一般是生 物化学物质， 如蛋白、 酶、 抗体、 抗原、 半抗原、 药物、 药物中间体或片段、 激素、 多糖、 代谢物、 核酸。生物靶标为生物物类或活系统， 如细菌、 病毒或相关组分。将使用所述发明测定的样 品可以是基于生物的或基于非生物的。生物样品可以是但不限于人和其他动物的血液、 血 浆、 血清、 尿、 唾液、 痰或其他体液 ； 细胞上清液、 细胞培养基或细胞裂解物 ； 组织提取物。非 生物样品可以是但不限于来自不同来源的水、 来自不同材料和物体的液体提取物等。样品 溶液可能需要或不需要在进行测定前进行化学预处理或物理预处理。 该处理是为了消除大 的粒子或可能显著干扰测定结果的其他因素。物理处理的实例包括过滤、 离心、 超声处理、 沉淀、 加热或冷却等。化学处理的实例包括添加一种或多种化学品来预处理样品， 所述化 学品如样品稀释剂、 表面活性剂、 氧化剂或还原剂、 消毒剂、 细胞裂解剂、 变性剂和去杂交剂 (de-hybridization agent)。用于测定的样品的量可以从纳升至微升变化。可以使用液体 处理系统或微流装置 (microfluidic device) 或纳流装置 (nanofluidic device) 将样品 溶液的一部分分为多个较小的样品部分以进行多种分析。
DLS 是广泛用于粒度和粒度分布研究的技术 (Berne， B.J. ； Pecora， R.Dynamic light scattering ： with applications to chemistry， biology， and physics( 动态光 散射 ： 化学、 生物和物理中的应用 ) ； 1976， Wiley ： New York.)。30 多年前已经确立了 DLS 的原理， 并且大量的 DLS 仪器和系统可商购获得。该技术是基于球形粒子的布朗运动， 其引起入射激光的多普勒频移。测量粒子的扩散系数并根据斯托克斯 - 爱因斯坦关系 (Stokes-Einsteinrelation) 计算粒度。 尽管研究已报道了金属 ( 例如， 金 ) 纳米粒子的生物轭合和生物分子相互作用指导的纳米粒子聚集， 但是在本发明之前， 未公开 DLS 与金属 ( 例如， 金 ) 纳米粒子探针一起用于均相和定量测定。应用于本发明的实施方式， DLS 可检 测由形成纳米粒子二聚体、 三聚体、 低聚体和聚集体而引起的粒度改变或粒度分布改变。 该 能力使得 DLS 成为用于根据本发明的实施方式的定量测定的合适分析工具。
用于本发明的金属纳米粒子在大小方面可以是单分散的或多分散的。 “多分散的” 意指纳米粒子溶液含有不同粒度范围的纳米粒子， 而 “单分散的” 意指所有纳米粒子均具 有相同或类似粒度。用于本发明的金属纳米粒子一般具有直径范围为 1-1000nm 的平均尺 寸。纳米粒子一般在粒子表面共价或非共价附着有分子、 离子或聚合物层以防止纳米粒子 去稳定。这些分子、 离子和聚合物在其中可具有或不具有硫醇基团或胺基团。硫醇和胺基 团对金纳米粒子具有高亲和力。 可以使用对金纳米粒子和银纳米粒子具有高亲和力的其他 分子。柠檬酸盐是用于保护和稳定金和银纳米粒子的常见配体。柠檬酸盐分子通过静电 相互作用与金和银纳米粒子结合。被柠檬酸盐分子稳定的金纳米粒子或胶体的制备在 50 多年前就已确立， 并且自那时起已被开始使用 (Turkevitch， J. ； Stevenson， P.C. ； Hiller， J.Discuss.Faraday Soc.1951， 11， 55 ； 和 Frenz， G.Nature Phys.Sci.1973， 241， 20.)。还 使用诸如寡聚 ( 氧化乙烯 )(OEG) 或聚 ( 氧化乙烯 )(PEG) 的在聚合物上具有一个或多个硫 醇基团的聚合物或较小的低聚体来对金和银纳米粒子表面进行修饰。 在高盐含量的溶液如 人血液和其他生物流体中， OEG 或 PEG 保护的金纳米粒子比柠檬酸盐稳定的纳米粒子稳定 得多得多。这些生物流体通常的盐浓度是约 100-200mM。 本文还描述了新的金属粒子。该金属粒子具有附着至粒子表面的聚 ( 丙烯酸 ) (PAA) 层。PAA 通过非共价相互作用如静电相互作用、 范德华相互作用和氢键合附着至纳米 粒子。与 OEG 和 PEG 保护的纳米粒子类似， PAA 保护的纳米粒子在高盐含量的溶液中也稳 定得多得多。
还描述了关于如何从 DLS 分析中提取分析物 ( 例如， 抗原 ) 浓度的新方法。该方 法描述了从 DLS 测量获得定量数据。
本发明并不限于上述公开内容或下面所提供的实施例。本发明可用于其他应用， 例如， 本发明的实施方式可一般用于检测在用合适的受体针对这些物类修饰金属 ( 例如， 金 ) 纳米粒子后可以引起纳米粒子聚集或解聚集的任何化学品、 生物分子或物质。如上面 所提到的， 除了金纳米粒子外， 本发明的实施方式还可使用银纳米粒子或提供大的散射截 面并且在非常低的浓度下可使用 DLS 技术检测的其他类型的纳米粒子。此外， 本发明不限 于检测生物样品中的化学品和生物分子。它还可用于检测非生物样品中的化学物质。
具体实施方式
下面所提供的实施例均为非限制性实施例。所公开的具体材料仅为示例性材料。 例如， 金属纳米粒子并不限于金纳米粒子 (GNP)， 分析物不限于生物分子。
实施例 1 ：
用于癌症生物标志物蛋白检测的一步式均相免疫测定
世界上有数百万人面临着癌症的风险， 癌症已成为死亡率的主要原因。早期癌症 检测可以显著地改善癌症患者的治疗和存活率。 随着肿瘤的发展， 细胞、 组织和器官可以释 放、 增加或降低循环血系统中的某些化学品的释放。 这些特定的化学品称为生物标志物。 生物标志物的检测和监测对癌症诊断和治疗具有巨大的意义。
用 于 生 物 标 志 物 检 测 的 理 想 免 疫 测 定 技 术 期 望 符 合 下 列 的 4-S 标 准 ： 简单 (simple)、 高灵敏度 (sensitive)、 高度特异性 (specific) 以及需要少量的样品 (small)。 尽管存在大量的测定和传感器技术， 但是仍需开发出符合所有这些标准的理想生物分析工 具。大多数生物测定技术或生物传感器缺乏高灵敏度， 涉及大量的样品和 / 或只有经训练 的专业人士能够进行的复杂的测定步骤 / 数据分析。 诸如 ELISA、 化学发光免疫测定的典型 异相夹心型免疫测定包括抗体固定、 多步孵育和洗涤循环， 随后是信号放大和读数。 从最初 的抗体固定到最后的测定结果读数， 整个免疫测定通常可花费数小时乃至数天来完成。传 统的免疫测定是相当耗时且耗力的。尽管在医学测试实验室中， 这些测定均是通过完全自 动化的仪器进行的， 但这些仪器笨重， 并且由于测定步骤的复杂导致制造和维护昂贵。 这些 系统不适于护理点目的和单独的研究实验室。而且， 典型的板免疫测定需要相对大量的样 品 (50 至 100μL)， 因此其不适于单滴的血液分析。 已经开发了蛋白微阵列来使测定所需的 样品量达到最小， 并且其具有另一与众不同的优点即多重能力。 然而， 蛋白微阵列涉及使用 复杂软件进行数据分析， 并且测定的开发和验证的花费对于常规目的和大多数研究实验室 将其用于生物标志物研究来说过高。 如图 1 中所图解的， 实施方式 A， 粒度范围为约 1-1000nm 的具有大的光散射截面 的金纳米粒子 (GNP) 被用作光学探针而与用于特定癌症生物标志物的抗体对 ( 捕获抗体和 检测抗体， cAb 和 dAb) 偶联。然后将这两种纳米粒子探针 (GNP-cAb 和 GNP-dAb) 与样品溶 液混合， 所述样品溶液可能需要或不需要被预先过滤或化学处理来移除大的粒子。在存在 抗原的情况下， 抗原 - 抗体结合将导致纳米粒子聚集。可通过 DLS 定量相对于单个纳米粒 子探针的纳米粒子聚集体的形成， 并且可将该数量信息与抗原浓度相关联。 可选地， 如果单 个粒子和粒子聚集体的分布峰未被分离， 则将使用由于聚集体形成所引起的平均粒度 ( 例 如， 其可以被表示为流体动力学直径 ) 增加而与抗原浓度相关联。
已知粒度在 10 至 100 纳米范围内的金纳米粒子， 包括球形粒子、 纳米杆和纳米壳， 在表面等离子体共振 (SPR) 波长区域内具有大的光吸收和散射截面。以标准化术语来讲， 30nm 金粒子在其 SPR 区域内的散射截面比 30nm 的聚苯乙烯粒子高约 250 倍。如与荧光团 的比较， 来自 60nm 金纳米粒子的散射光强度比强荧光性的荧光素分子高四至五个数量级 (Yguerabide， J. ； Yguerabide， E.E.Anal.Biochem.1998， 262， 137.)。
动态光散射 (DLS) 也称为光子相关谱或准弹性光散射， 是广泛用于粒度和粒度分 布分析的技术。该技术是基于球形粒子的布朗运动， 其引起入射激光的多普勒频移。测 量粒子的扩散系数并根据斯托克斯 - 爱因斯坦关系计算粒度。尽管在 30 多年前非常有 限数目的研究报道了使用 DLS 进行定量和均相免疫测定， 但在这些之前的工作中， 使用 聚合物胶乳粒子作为光散射增强物来与抗体轭合作为光学探针 (Cohen， RJ. ； Benedek， G.B.Immunochemistry 1975， 12， 963-966 ； Von Schulthess， G.K. ； Cohen， R.J. ； Benedek， G.B.Immunochemistry 1976， 13， 963-966)。与类似粒度的金纳米粒子相比， 聚合物胶乳粒 子的散射弱得多。这种低散射强度不足以压住来自样品溶液中其他粒子的散射信号， 从而 使得这种光散射免疫测定技术对于低丰度蛋白分析物的检测来说不合适或显著地受限。 通 过使用金纳米粒子作为探针， 从金纳米粒子探针散射的光强度强至足以压住从样品溶液中 产生的背景光散射， 因此为免疫测定提供了大大增强的灵敏性。
本发明人首次开发了使用如图 1 中所图解的实施方式 A 进行前列腺癌生物标志物 检测的均相一步式免疫测定 (Huo， Q. 等人 J.Am.Chem.Soc.2008， 130， 2780-2782)。在此工 作中， 使用了直径为 40nm 的球形金纳米粒子和尺寸为 10×40nm 的金纳米杆来制备匹配的 抗体轭合探针。在可行性研究中， 发明人使用 DLS 分析了金纳米粒子和纳米杆的检测极限。 图 4 显示了通过 DLS 在不同浓度测量的金纳米杆 (GNR， 尺寸为 10×40nm)、 37nm(GNP37) 和 98nm(GNP98) 球形金纳米粒子的平均散射光强度。根据此数据， 三种金纳米粒子材料 GNR、 GNP37 和 GNP98 的检测极限分别被确定为 0.4pM、 0.02pM 和 0.7fM。这种高灵敏性使得金纳 米粒子成为用于根据本发明的实施方式的免疫测定的非常具吸引力的光散射探针。
根据图 1 中所列出的原理， 本发明人开发了使用本发明来检测游离的前列腺特异 性抗原 ( 游离的 PSA) 的免疫测定， 所述抗原是与前列腺癌相关的生物标志物蛋白。前列 腺特异性抗原 (PSA) 是经 FDA 批准的用于前列腺癌诊断的生物标志物。健康男性的总 PSA 浓度在若干 ng/mL 的范围内而且游离的 PSA(f-PSA) 浓度通常低于 1ng/mL， 其在总 PSA 的 10-25％的范围内。游离的 PSA 是未结合形式的前列腺特异性抗原。研究已显示总 PSA 中 的 f-PSA 的百分比在患前列腺癌的患者中要比患良性前列腺增生的那些患者更低。现已将 游离 PSA 水平引入并作为用于前列腺癌筛选和诊断的又一生物标志物进行研究。 在此研究中， 发明人制备了两种类型的金纳米粒子 ： 一种是柠檬酸盐稳定的球形 金纳米粒子 (Ct-GNP， 直径 37nm)， 并且另一种是十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB) 保护的金纳 米杆 (CTAB-GNR， 10×40nm)( 图 5a)。两种抗体通过非共价吸附轭合至两种纳米粒子。此 过程对于本领域的那些技术人员是已知且熟悉的。GNP 和 GNR 的 TEM 图像和 UV-Vis 吸收 谱在图 5b 和 5c 中显示。通过 DLS 分析了粒度和粒度分布 ( 图 5d)。首先通过 UV-Vis 谱 分析和 DLS 测量证实了纳米粒子与检测抗体以及纳米杆与捕获抗体的成功轭合 ( 图 5c 和 5e)。与最初的 GNP 和 GNR 相比， 纳米粒子的 SPR 吸收带由于轭合的粒子的表面化学改变而 略微移动。对于 GNP 和 GNR， 轭合的纳米粒子的粒度还分别从 37nm 增至 57nm， 和从 30nm 增 至 37nm。这些数据表明， 两种抗体分别成功地轭合至 GNP 和 GNR。估计附着至纳米粒子表 面的抗体数目为每个粒子 10-100 个之间。较大的粒度将导致较多的抗体附着至粒子表面。
然后使用轭合的纳米粒子和纳米杆在溶液中进行 f-PSA 的均相免疫测定。将两种 纳米探针以 1 ∶ 2.5(GNP-dAb ∶ GNR-cAb) 的比例混合， 然后将其添加至不同浓度的标准 f-PSA 溶液中。GNR 探针过量添加， 并且用作内部参考。在 DLS 分析之前在室温下孵育测定 溶液 30min。在得自 PrecisionDetector， Inc. 的 Cool Batch40 系统上进行 DLS 分析。
图 6a 是在存在 1ng/mL 的 f-PSA 的情况下混合的纳米探针溶液的典型粒度分布。 如从图 5e 所看到的， 对于纯的纳米粒子和纳米杆轭合物， 仅从分布中观察到了一个粒度分 布。将 f-PSA 添加至纳米探针溶液时， DLS 测量检测到两组粒度 ( 图 6a， 峰区 A 和 B)， 一组 集中在 60nm 以下， 代表单独的纳米粒子和纳米杆 ( 区 B)， 而一组在 100nm 以上， 对应于纳米 粒子 - 纳米杆低聚体 ( 区 A)。粒度范围为 60-500nm( 区 A) 的纳米粒子低聚体相对于粒度 范围为 20-60nm( 区 B) 的单独纳米粒子的相对比率 ( 此处， 我们使用了散射光强度比 ) 可 以从粒度分布曲线进行数值计算。图 6b 是这种数值比与 f-PSA 浓度的曲线图。随着 f-PSA 浓度的增加， 纳米粒子低聚体的相对百分比增加而单独的纳米探针的百分比降低。我们在 缓冲液中使用相同的纳米探针进行了未知样品溶液的分析 (f-PSA 浓度为 0.5ng/mL)。 测得 的浓度与样品的真实浓度对应得非常好 ( 图 6b， 红色星号所指示的数据 )。
本发明人所展示的免疫测定提供传统免疫测定和其他技术水平的生物分析技术 所不可比拟的若干优点 ： (1) 极简单的测定过程 ； (2) 测定需要极少量的样品 (0.1μL 至若 干 μL)， 这意味着我们可以从取自指尖的单滴血样检测多种生物标志物 ； (3) 高灵敏度 ( 浓 度为 fM 至 aM， 或绝对质量为 fg) 而不需要任何放大步骤 ； (4) 低成本但具有高通量分析能 力； (5) 极快的分析时间 ( 完整的测定可以在少于 5 分钟之内完成 )。
实施例 2 ：
使用新的强的金纳米粒子探针的改良均相免疫测定
强的金纳米粒子探针的开发 ： 开发了在高离子强度缓冲溶液中与柠檬酸盐稳定的 金纳米粒子相比稳定性改善的两种新的纳米粒子探针。一种是由聚 ( 丙烯酸 )(PAA) 稳定 的球形金纳米粒子， 而另一种是硫醇化的聚 ( 乙二醇 ) 配体 (PEG) 稳定的金纳米粒子 ( 图 7a)。两种纳米粒子均是由柠檬酸盐稳定的金纳米粒子的表面修饰获得的。根据以下步骤 合成 PEG 保护的 GNP ： 首先根据报道的方法合成了平均核心直径为 30-35nm 的柠檬酸盐保 护 的 GNP(Turkevitch， J. ； Stevenson， P.C. ； Hiller， J.Discuss.Faraday Soc.1951， 11， 55 ； 以及 Frenz， G.Nature Phvs.Sci.1973， 241， 20.)。然后将如图 7 中所示的硫醇化的和 双官能的 PEG 配体 HS-PEG-COOH(PEG 的 MW 为 ： 3000， 得自 Rapp Polymers) 的 1mL 水溶液 -4 (2×10 M) 逐滴添加至 10mL 的柠檬酸盐保护的 GNP 溶液中。使混合物在室温下震荡过夜。 通过离心纯化了 HS-PEG-COOH 配体官能化的 GNP 并用去离子水洗涤 3 次。将 PEG-GNP 悬浮 在纯的去离子水中以供进一步使用。
根 据 以 下 步 骤 合 成 PAA 保 护 的 GNP ： 边 剧 烈 搅 拌 边 将 1.5mL 柠 檬 酸 钠 溶 液 (38.8mM) 迅速添加至煮沸的 HAuCl4(0.35mM， 100mL) 水溶液中。在煮沸 15 分钟后， 将 2mL PAA 水溶液 (27mg/mL， pH ： 约 3) 逐滴添加至上述溶液中。使混合物继续沸腾 4 小时。将溶 液冷却至室温后， 通过离心浓缩纳米粒子产物， 用去离子水充分洗涤两次， 然后用稀 NaOH 溶液 (pH ： 10) 洗涤两次。然后将 PAA 修饰的 GNP 再分散到去离子 (DI) 水中以供进一步使 用。
使用 UV-Vis 吸收谱法在不同盐浓度的缓冲溶液中进行柠檬酸盐稳定的、 PAA 稳定 的和 PEG 稳定的金纳米粒子的稳定性比较研究 ( 分别为图 7b、 7c 和 7d)。当金纳米粒子开 始聚集时， 表面等离子体共振带将移动并变宽。 根据如图 7 中所示的 UV-Vis 谱， PAA 稳定的 GNP 在 NaCl 浓度高达 150mM 的 PBS 缓冲溶液中保持稳定达 24 小时而没有显著的聚集， 然而 柠檬酸盐稳定的金纳米粒子在盐浓度为 30mM 时严重聚集。PEG 保护的 GNP 可以在 NaCl 浓 度为 100mM 的缓冲溶液中存在而没有显著的聚集。通过使用 DLS 的粒度分析进一步证实了 PAA 保护的和 PEG 保护的金纳米粒子的显著增加的稳定性 ( 此处未显示数据 )。人血的生 理盐浓度在 100-150mM 的范围内。在我们的研究中合成的 PAA 保护的和 PEG 保护的金纳米 粒子均可以合适地作为纳米探针以用于以后的生物样品测定。
使用 PAA 保护的和 PEG 保护的 GNP 与抗 -f-PSA 抗体对轭合并且进行 f-PSA 的免 疫测定。 从两种纳米粒子轭合物均获得了非常相似的免疫测定结果， 但此处仅显示 PEG-GNP 的数据来作为示例。PAA-GNP 抗体对的轭合通过类似于抗体与柠檬酸盐保护的 GNP 轭合的 简单非共价吸附进行。抗体对与 PEG-GNP 的轭合通过经由酰胺键连接的共价化学进行。轭 合后， 纳米粒子的平均直径平均增加了 10-15nm， 这与覆盖有抗体层的 PEG-GNP 或 PAA-GNP 的预期尺寸增加相对应。然后使用这些纳米粒子探针进行了标准溶液中的 f-PSA 的免疫测定。对于此测定， 将与捕获抗 -f-PSA 抗体和检测抗 -f-PSA 抗体轭合的 PEG-GNP 等量混合， 并通过 DLS 监测和分析由纳米粒子聚集引起的平均纳米粒子粒度增加。图 8a 是存在 0ng/ mL 和 0.1ng/mL f-PSA 的测定溶液中的纳米粒子的粒度分布， 并且图 8b 涉及两个不同实验 的测定结果。从图 8a 可以看到当存在分析物 f-PSA 时， 与样品溶液中不具有分析物 f-PSA 的测定溶液相比测定溶液的平均粒度增加 ( 比较两个深灰色的分布峰， 白色的粒子分布峰 来自杂质 )。如从图 8b 看到的， 平均粒度 ( 此处表示为流体动力学直径 ) 与分析物浓度的 增加成比例地增加。各样品溶液的测定重复进行。所测试的各浓度的标准偏差很小， 表明 优异的测定内再现性， 而测定间再现性也非常好。
下列 7 种生物标志物当前被作为免疫测定开发的靶分析物进行测试 ： 游离 -PSA、 总 PSA、 CA 125、 CA 15.3、 CA 19-9、 Her-2/neu 和 CEA。这些生物标志物与下列癌症的一种 或多种相关 ： 前列腺癌、 乳腺癌、 卵巢癌、 胰腺癌、 肝癌、 肺癌和结肠直肠癌。除了 CEA 外， 所 有其他的生物标志物均为 FDA 批准的血清生物标志物。本文所描述的方法可以基本上应用 于任何生物标志物。 因此， 本文所述的生物测定技术不限于这些具体的癌症生物标志物。 它 还可以延伸至其他蛋白、 抗体、 抗原、 DNA、 RNA 以及其他生物靶标的分析。
实施例 3 ：
具有改良的灵敏度和动态范围的一步式均相免疫测定的开发 ： 如图 4 中所显示 的， 来自 100nm GNP 的光散射强度基本上高于 40nm GNP 的光散射强度。最近， 我们使用平 均核心直径为 100nm 的 GNP 制备了用于总前列腺特异性抗原 (PSA) 检测的一组纳米粒子探 针。记录了测定溶液的平均粒度 ( 或粒子的所谓流体动力学直径 ) 以确定分析物浓度。将 用于总 PSA 的两种匹配的抗体与柠檬酸盐保护的 100nm GNP 轭合以形成两种纳米粒子探 针。使用这组新探针， 我们能够检测浓度低至 1pg/mL 的总 PSA， 并且将测定的动态范围延 伸至两个浓度范围 ： 0.1-10 和 0.001-1ng/mL( 图 9a 和 b， 两种动态范围通过调节添加至纳 米探针溶液的样品的不同量来获得 ： (a) 将 2μL 样品添加至 40μL 的探针溶液中 ； (b) 将 20μL 的样品与 20μL 的探针溶液混合 )。高浓度范围可用于常规的筛选目的， 而低浓度范 围可用于监测前列腺切除术之后的癌症复发。
此外， 我们在生长 24 小时后收集的细胞上清液中使用该测定来检测由前列腺癌 细胞即 PC3 分泌的 PSA。结果显示在图 10 中。样品 PC3A1、 PC3B1 和 PC3C1 在培养皿中具 有大约 1 百万、 50 万和 25 万个细胞。为了进行测定， 我们简单地将 2μL 的细胞上清液添加 到 40μL 的混合纳米探针溶液中。将溶液在室温下孵育 5-10 分钟后， 在小于 1min 内通过 DLS 读出结果。比较 PC3A1、 PC3B1 和 PC3C1， 可以清晰地看到 PSA 水平的差异 ( 图 10)。测 定的再现性非常好 ( 图 10 中所显示的数据是两次重复的 )， 并且使用不同批次的纳米探针 进行的测定也有非常好的再现性。我们使用商购获得的总 PSA ELISA 试剂盒 (Anogen) 来 测试这三种细胞上清液样品。该试剂盒一点都不能检测来自所有三种样品的 PSA( 该测定 试剂盒的有效性已经通过试剂盒中所含有的标准 PSA 溶液和多种人血清样品的测定得到 证实 )。这些结果清楚地证明了本发明所述的新测定与商业的免疫测定产品相比之下无可 比拟的优越性。
发明人还使用 100nm GNP 探针分析了来自以下 4 种不同的人血清样品的总 PSA 的 相对水平 ： F6901、 M7903、 M4406 和 M5512。测定溶液的粒度分析结果显示在图 11 中。″ F″ 意指受治疗者为女性而″ M″意指受治疗者为男性。 已知这些人受治疗者为正常的健康人，并且未被诊断出患前列腺癌。样品名称中的前两个数字为受治疗者出生的年份。根据粒度 分析的结果， 总 PSA 水平的顺序应为 ： M4406 ＞ M7903 ≌ M5512 ＞＞ F6901。M5512 的临床 确定的总 PSA 水平为 0.6ng/mL。 总 PSA 水平的这个顺序粗略地反映了女性与男性之间以及 不同年龄的男性之间的总 PSA 水平差异。女性应不具有或具有极低水平的 PSA， 而在 60-65 岁的男性中 PSA 水平增加。尽管总 PSA 水平的绝对值尚需通过建立准确的校准曲线来确 定， 但是迄今为止这些结果表明本发明中所描述的免疫测定可用于从人血液和血清样品中 进行分析物检测。
实施例 4 ：
使用如本发明所述的一步式均相免疫测定的肌动蛋白免疫测定 ： 肌动蛋白是所有 细胞类型中细胞骨架结构和收缩结构的主要组分。它在量上不同， 与细胞和组织的分化类 型以及功能状态有关。可以发现两种不同形式即球形或纤维状态的肌动蛋白。肌动蛋白常 作为标准蛋白溶液用于蛋白质印迹 (Western blot) 中以监测蛋白质印迹的成功。通过将 单克隆抗体匹配对与 100nm GNP 轭合， 本发明人开发了用于使用动态光散射进行肌动蛋白 均相测定的两种探针。图 12 是一系列肌动蛋白溶液的测定结果。该结果与由蛋白质印迹 所获得的结果很好地对应。用于蛋白质印迹分析的四种样品肌动蛋白 1 至肌动蛋白 4 的浓 度分别为约 34.5、 17.3、 8.6 和 4.3mg/mL。蛋白质印迹的肌动蛋白检测极限为大概 2mg/mL。 将这四种样品稀释 1 百万倍至分别为 34.5、 17.3、 8.6 和 4.3ng/mL 以用于使用如本文所述 的发明的均相免疫测定。如图 12 中所看到的， 可以清楚地看到四种肌动蛋白样品之间的差 异。本发明中所公开的均相免疫测定的灵敏度比传统的蛋白质印迹高约 6 个数量级。用于 本测定的样品溶液的量 (2-5 微升 ) 也大大小于蛋白质印迹分析所需使用的 (100 微升 )。 实施例 5 ：
用于小鼠 IgG 检测的使用山羊抗小鼠 IgG 金纳米粒子探针的一步式竞争性测定和 非竞争性测定 ： 在此实施例中， 本发明人开发了使用如图 1 中所图解的实施方式 B 和 C 的两 种形式的小鼠 IgG( 免疫球蛋白 G) 检测测定。此研究证明使用所述发明的竞争性测定和非 竞争性测定二者的可能性。山羊抗小鼠 IgG 是对一抗小鼠 IgG 具有特异性结合亲和力的二 抗。二抗可以与一抗的 Fab、 Fab′或 Fc 区结合， 因此认为小鼠 IgG 具有二抗的多个结合位 点。
在我们开发的用于小鼠 IgG 检测的第一种形式的测定中， 将小鼠 IgG 直接与轭合 了山羊抗小鼠 IgG 的 GNP(40nm， GNP- 抗 -IgG) 混合。山羊抗小鼠 IgG 与 GNP 的轭合通过非 共价吸附进行。由于二抗结合一抗小鼠 IgG 的多个结合位点， 小鼠 IgG 引起了纳米粒子聚 集。 图 13 为探针浓度为 0.1nM 时进行的测定， 而图 14 为探针浓度为 0.01nM 时进行的测定。 在这种一步式测定中， 当探针浓度设定为 0.01nM 时， 可以检测到小鼠 IgG 的浓度为 7.8pg/ mL 至 50ng/mL( 或约 52fM 至 0.33nM)( 来自图 14 的结果 )。如由图 13 与图 14 的比较所揭 示的， 可以使用不同浓度的纳米粒子探针来调节测定的检测极限和动态范围。此实施例为 如本发明和图 1 所描述的实施方式 B 的说明， 其使用单一类型的探针来检测具有与单一类 型的受体结合的多个结合位点的分析物， 所述受体附着至纳米粒子探针。
此研究中所开发的第二种形式的测定是使用小鼠 IgG 轭合的和山羊抗小鼠 IgG 轭 合的 GNP 即 GNP-IgG 和 GNP- 抗 -IgG 二者进行的竞争性测定。GNP- 抗 -IgG 充当探针并且 GNP-IgG 充当聚集诱导物与分析物小鼠 IgG 竞争结合 GNP- 抗 -IgG。 通过将生物素化的小鼠
IgG 与链霉抗生物素涂布的 GNP 轭合来制备小鼠 IgG 轭合的 GNP 探针。 当以约 1 ∶ 1 的摩尔 比简单地将溶液中的两种 GNP 探针混合在一起时， 两种 GNP 探针将由于小鼠 IgG 与山羊抗 小鼠 IgG 分子之间的特异性结合而聚集在一起。将小鼠 IgG 作为靶蛋白添加在混合的探针 溶液中引起两种纳米粒子探针之间聚集的减少。 溶液中的小鼠 IgG 分析物将与 GNP- 抗 -IgG 结合， 从而抑制形成聚集体的 GNP-IgG 与 GNP- 抗 -IgG 的结合。然后使用聚集的减少与靶 蛋白小鼠 IgG 的浓度相关联。图 15 显示表示为流体动力学直径形式的测定溶液平均粒度 相对于分析物浓度的测定结果。发现平均粒度与分析物浓度为反比关系。在此测定中， 可 以检测出溶液中约 100ng/mL 至 100,000ng/mL 浓度的小鼠 IgG。这种竞争性测定避免了非 竞争性测定中常遇到的 “钩状效应 (hook effect)” 的问题。
通过此研究， 发明人证明具有强的光散射性质的金纳米粒子可用作高灵敏度的光 学探针来代替传统的聚合物胶乳粒子用于激光散射免疫测定开发。 可以通过选择适当的纳 米粒子探针浓度和测定条件而非常方便地将此测定的灵敏度和动态范围调节至预期范围。 可以使用单一类型的探针或多于一种类型的探针来进行测定。 在用于各单独蛋白分析物的 实际测定开发中可以考虑竞争性测定形式和非竞争性测定形式二者。
实施例 6 ： 使用动态光散射的用于 DNA 检测的一步式高度灵敏的方法。本发明人还证明了本 发明可用于 DNA 检测和分析 (Huo Q. 等人 J.Am.Chem.Soc.2008， 130， 8138-8139)。对于用 于遗传性疾病和致病性疾病的临床诊断的特异性的 DNA 序列的快速、 低成本和灵敏的检测 存在相当大的需求。目前基于荧光光学标记的 DNA 检测方法如 DNA 微阵列和分子信标在市 场上占据优势地位。然而， 在这些广泛被采用的方法中存在若干限制。一个问题是相对低 的信号放大。由于一个 DNA 探针标记有一个或几个荧光团， 所以当靶 DNA 浓度低时， 荧光信 号相当弱， 导致相对弱的灵敏度。第二个问题是典型荧光团的弱的光稳定性。大部分有机 染料遭受严重的光漂白并且这通常导致不能再现的结果。
为了解决这些问题中的一些， 作为用于 DNA 检测的信号探针考查了几种类型的纳 米材料， 如量子点、 碳纳米管、 硅纳米线以及金属纳米粒子。 在它们之中， 多种形式的金纳米 粒子 (AuNP 或 GNP) 已基于其独特的粒度和距离依赖性光学性质而被用于检测 DNA。 Mirkin 及其同事首先开发了在均相溶液中基于存在靶 DNA 的条件下寡核苷酸功能化的 AuNP 聚 集体的形成而进行的 DNA 杂交的比色检测 (Elghanian， R. ； Storhoff， J.J. ； Mucic， R.C ； Letsinger， R.L. ； Mirkin， C.A.Science 1997， 277， 1078.)。纳米粒子聚集可以通过观察 溶液由红色向紫色的颜色变化直接检测， 或通过 UV-Vis 吸收谱监测。然而， 此方法的主要 限制是低灵敏度 (10nM)。为了增加灵敏度， 开发了 DNA 条形码扩增和其他光学信号放大 技术如 scanometric 法和表面增强拉曼光谱法 (Taton， T.A. ； Mirkin， C.A. ； Letsinger， R.L.Science 2000， 289， 1757.(b)Cao， Y.W. ； Jin， R.C ； Mirkin， C.A.Science 2002， 297， 1536.) 来将检测极限改善至飞摩尔 (femtomolar) 和渺摩尔 (attomolar) 范围。 然而， 所有 这些放大法均涉及复杂的多步步骤， 其不仅耗时而且还常引起再现性的问题。
在此工作中， 本发明人将本发明应用于 DNA 检测。如在图 16 中所图解的， 将两组 单链 DNA 探针功能化在柠檬酸盐保护的金纳米粒子 (DNA1-AuNP 和 DNA2-AuNP) 上。当两种 DNA 功能化的 AuNP 探针在含有互补的靶 DNA 的样品溶液中混合时， 靶 DNA 与两种纳米粒子 探针的杂交将导致纳米粒子形成二聚体、 三聚体和更大的聚集体。这种纳米粒子聚集将增
加整个纳米粒子群体的平均直径， 其可以通过 DLS 分析来检测。然后可以将纳米粒子的平 均直径增加与靶 DNA 浓度定量地相关联。如图 16 中所示， 较高的靶 DNA 浓度应导致更大范 围的纳米粒子聚集和更大的平均纳米粒子粒度增加。
在此工作中， 本发明人根据报道的步骤合成了柠檬酸盐稳定的具有 30nm 的核 心 直 径 的 金 纳 米 粒 子 (Turkevich， J. ； Stevenson， P.C ； Hillier， J.Discuss.Faraday Soc.1951， 11， 55.)。将先前用于 Mirkin 等人的工作中的两种 DNA 探针与金纳米粒子轭合 (Jin， R. ； Wu， G. ； Li， Z. ； Mirkin， C.A. ； 和 Schatz， G.C.J.Am.Chem.Soc.2003， 125， 1643. Stoeva， S.I. ； Lee， J.S. ； Thaxton， C.S. ；和 Mirkin， C.A.Angew.Chem.Int.Ed.2006， 45， 3303)。 图 17a 是 AuNP 探针在与 DNA 探针轭合之前和之后的 UV-Vis 吸收谱。 AuNP 溶液开始 为粉红色， SPR 带在 520nm。在单链 DNA 的功能化之后， SPR 带保持在 520nm， 表明由于与单 链 DNA 轭合之后在纳米粒子之间的互斥作用增加而没有粒子聚集。使用 DLS 测量来监测与 两种 DNA 探针轭合前后 AuNP 的粒度改变。如图 17b 中所示， 对于 DNA1-AuNP 和 DNA2-AuNP， 纳米粒子的流体动力学直径由 29.0nm 分别略增至 34.4nm 和 38.2nm。 这种流体动力学直径 改变是由在纳米粒子表面上添加 DNA 层而引起的。DLS 数据还揭示了 DNA 修饰之前和之后 AuNP 的非常窄的粒度分布。UV-Vis 吸收和 DLS 测量均表明 DNA-AuNP 探针仍然单独分散在 溶液中。
对于靶 DNA 检测， 将浓度为 100pM 的两种 DNA-AuNP 探针的 1 ∶ 1 混合溶液添加到 浓度范围在 5pM 至 5nM 的一组靶 DNA 溶液中。使用 UV-Vis 吸收谱确定了 DNA-AuNP 探针的 浓度。在 70℃下将混合的溶液孵育 5min， 然后使其冷却至室温并静置 2 小时。然后将溶液 稀释 100 倍以供 DLS 测量 (DLS 样品池需要 1-1.5mL 样品溶液 )。 如图 18a 中所示， 溶液中具 有 0M 靶 DNA 的对照样品中金纳米粒子的平均粒度为约 35.2nm。在含有 5pM 靶 DNA 的样品 溶液中， 平均纳米粒子粒度增加至 40.6nm。整个纳米粒子群现在含有单独分散的 DNA-AuNP 探针， 由于 DNA 靶标与 DNA 探针杂交而形成的纳米粒子二聚体、 三聚体和低聚体。 随着靶 DNA 浓度的增加， 平均纳米粒子流体动力学直径相应地增加。图 19 是靶 DNA 浓度从 5pM 至 5nM 时的粒度的曲线。估计检测极限为约 1pM。不进行任何优化， 此检测极限已高于先前所报 道的基于吸收的方法 4 个数量级 (Elghanian， R. ； Storhoff， J.J. ； Mucic， R.C ； Letsinger， R.L. ； Mirkin， C.A.Science 1997， 277， 1078.)。如从各浓度的小标准偏差 ( 每个浓度运行 三个样品 ) 和测定的良好线性所判断的， 该测定表现出优异的再现性 ( 参见图 19 中的插 图 )。
为了考察新测定的选择性， 本发明人对来自完美匹配的 DNA 靶标的单碱基对错配 的 DNA 进行了比较研究。研究了两种类型的错配的 DNA 靶标 ： 一个具有位于靶 DNA 序列末 端的错配对， 而一个具有位于靶 DNA 序列中间的错配对 ( 错配的序列显示在发明人的论文 的补充信息中， Huo Q.， 等人 J.Am.Chem.Soc.2008， 130， 8138-8139)。在严格相同的测定条 件下， DLS 分析揭示了在靶 DNA 具有单错配的碱基对时纳米粒子聚集程度小得多， 这是从 图 18b 所示的纳米粒子的流体动力学直径所判断的。这种单碱基对错配研究是在 10pM 的 靶 DNA 浓度下进行的。结果证明我们的新测定在不使用先前报道的方法 (Elghanian， R. ； Storhoff， J.J. ； Mucic， R.C. ； Letsinger， R.L. ； Mirkin， C.A.Science 1997， 277， 1078.) 所 需的 DNA- 纳米粒子聚集体熔化转变的条件下区分单碱基对错配的 DNA 与完美匹配的靶 DNA 的能力。总之， 本发明人证明了基于本发明的用于 DNA 检测的一步式均相杂交测定。该测 定极易实施， 提供与基于吸收的方法相比高得多的灵敏度， 然而却没有任何信号放大过程。 可以在环境条件下从 DLS 分析直接容易地区分单碱基对错配的 DNA 与完美互补的 DNA。
实施例 7
DLS 系统
图 2 显示用于手动地一次一个样品地确定分析物的存在的根据本发明的基本 DLS 系统 200。系统 200 包括由光学上透明的材料形成的容器 / 池 204， 其用于容纳怀疑含有至 少一种靶分析物的样品溶液和与受体轭合的相同的或两种不同的纳米探针。 受体可以是相 同的或不同的。诸如激光器 210 的光源将具有合适波长的光 ( 例如， 紫外光、 可见光、 近红 外光或红外光 ) 导向装在容器 / 池 204 中的包含分析物的溶液。可以使用或不使用衰减器 217 来调节来自激光器 210 的入射激光束的强度。 提供至少一个检测器如检测器 211 和 212 来测量来自包含分析物的溶液的散射光信号。检测器可以相对于入射激光束以 0 至 180 度 角的不同角度放置， 在更具体的实施方式中， 所述角度为 0-90 度。在一个实施方式中， 所检 测的分析物不包括 DNA， 或者如果 DNA 是靶分析物， 则检测器相对于激光必须为 0-90 度之 间。在不同的检测器角度， 测定的灵敏度可能不同。应选择最佳检测器角度来最灵敏地检 测纳米粒子聚集体。一个实例为 13 度的前向角 (forward angle)。依据所用的金属粒子的 类型和测定形式， 还可以使用其他角。可以使用多于 1 个检测器来同时分析多个样品。来 自检测器 211 和 212 的输出显示为与相关器或其他类型的处理器 221 偶联， 所述相关器或 其他类型的处理器 221 与计算机 230 相连， 计算机 230 使用相关软件并可进行操作以用于 由相关函数确定粒子扩散系数和 / 或粒度和 / 或粒度分布。数据收集、 处理、 分析和显示将 由计算机 230 控制。计算机软件将把 DLS 数据转化成分析物浓度信息。测定溶液的 DLS 数 据与分析物浓度之间存在线性相关或非线性相关。 绝对分析物浓度可以通过与使用已知浓 度的标准分析物溶液获得的校准曲线比较来确定。 当标准分析物溶液不可用或不必获得绝 对分析物浓度时， 可以直接使用纳米粒子扩散系数、 粒度和 / 或粒度分布数据来从不同样 品获得相对分析物水平。
在其他更具体的实施方式中， 本发明涉及尤其适于通过自动控制来同时或顺序进 行多个样品的测定实施方式的 DLS 系统。具有两种不同设置的这种适合的 DLS 系统的实例 在图 3 中图解。第一种设置用于一次分析一个样品溶液 ( 图 3c) 并且第二种设置用于同时 测量多个样品 ( 意味着多于一个样品 )( 图 3a 和 3b)。除了图 2 中所示的基本 DLS 所需的 组件之外， 这种修改的系统 300 含有下列另外的部件 / 组件 ： (1) 激光束 312， 其可以分裂为 多个束 ( 或多个激光 ) 以作为用于多种测定溶液 316 的入射光束 322， 并由此产生散射光 信号 322 ； (2) 可移动的平台 318， 如圆盘传送带， 其可支持一个或多于一个测定溶液容器。 图 3 图解圆盘传送带 318 的实例， 其具有 12 个测定溶液容器 316 或池支架， 其中含有测定 溶液的池可手动或自动地加载到该支架上。圆盘传送带 318 可以是独立装置。将圆盘传送 带 318 手动或自动地插入 DLS 主系统中。如图 3b 所图解， 圆盘传送带还可以在平面内旋转 (326)。系统 300 可以任选地包括液体处理系统 324 以用于向池中递送流体和 / 或从池中 移出流体。
一般地， DLS 配备有单个或多个检测器。检测器的数目可以与圆盘传送带中的样 品溶液容器的数目匹配。检测器的数目可以小于圆盘传送带中的样品溶液容器的数目。每个检测器将检测来自一个样品溶液的散射光信号。可以通过同一处理器 ( 如相关器 ) 顺序 处理或多个处理器同时处理从每个检测器收集的数据以获得各测定溶液的相关函数。 作为 实例， 图 3 图解了可以使用一个激光光源和 12 个检测器同时分析 12 个样品。可选择地， 一 次可以仅打开一个检测器， 加载一个样品到圆盘传送带。 通过旋转圆盘传送带， 使用者可以 连续加载新样品并从圆盘传动带中卸载分析样品以便可以顺序分析多个样品。图 3 仅为示 例。还可以采用基于样品概念的其他设置。例如， 圆盘传送带可以含有任何数目的样品溶 液容器或池支架而非 12 个。可以用装置中嵌入有样品溶液容器的微流装置代替圆盘传送 带。还可以用不具有图 3 所显示的圆形形状但与圆盘传送带功能相同的装置来代替圆盘传 送带。可以将如上文所讨论的不同模式 ( 使用单个检测器或同时使用多个检测器的固定圆 盘传送带与可旋转圆盘传送带 ) 组合在一起以加速测定并减少花费。
图 3c 中显示的是替代性实施方式， 其降低了所需的 DLS 检测器的量， 但还允许使 用者能够方便地操作样品以将其放入和移出可移动平台。系统 350 包括具有至少第一容器 354 和第二容器 356 的可移动平台 355。可移动平台 355 可以将容器 354、 356 的一个或另 一个由加载区 357 移至检测区 359。光源 351 发送入射光束 358 到检测区 359 中的容器从 而产生散射光信号 360。检测器 361 检测散射光信号以用于计算机的进一步处理。
对于两种 DLS 系统， 都将使用计算机软件来进行以下控制 ： 液体混合、 样品加载和 卸载以及 DLS 测量 ； 将散射光强度数据处理为相关函数 ； 将相关函数数据处理为粒子扩散 系数、 粒度和 / 或粒度分布信息 ； 并使用和不使用校准曲线来将这信息处理为分析物浓度 ( 包括相对浓度或绝对浓度 )。校准曲线通过测定具有已知分析物浓度的一系列标准样品 溶液来确立。通常， 从未知样品溶液获得的 DLS 数据与校准曲线的比较将揭示未知样品中 的分析物浓度。
如本领域的技术人员所理解， 本发明的实施方式可以被具体化为包括处理模块和 / 或含有至少一个程序编码模块的计算机程序产品在内的装置或系统。因此， 本发明可以 采取完全为硬件的实施方式形式或组合了软件和硬件方面的实施方式形式。此外， 本发明 可以包括在计算机可用存储介质上的计算机程序产品， 所述计算机可用存储介质在该介质 中收录有计算机可用的程序编码工具。可以使用任何合适的计算机可读介质， 包括硬盘、 CD-ROM、 DVD、 光存储装置或磁存储装置。
术语 “处理模块” 可以包括单个处理装置或多个处理装置。 这种处理装置可以是微 处理器、 微控制器、 数字信号处理器、 微型计算机、 中央处理单元、 现场可编程门阵列 (field programmable gate array)、 可编程逻辑装置、 状态机、 逻辑电路、 模拟电路、 数字电路和 / 或根据操作指令处理信号 ( 模拟的和 / 或数字的 ) 的任何装置。处理模块可以具有可操作 地偶联在其上的或与其整合的存储装置。存储装置可以是单个存储装置或多个存储装置。 这种存储装置可以是只读存储器、 随机存取存储器、 易失存储器、 非易失存储器、 静态存储 器、 动态存储器、 闪速存储器和 / 或储存数字信息的任何装置。如本文所用的计算机是包括 至少一个处理模块和任选地至少一个存储装置在内的装置。
计算机可用介质或计算机可读介质可以是或者包括但不限于例如， 电子的、 磁的、 光的、 电磁的、 红外的或半导体的系统、 设备、 装置或传播介质。 计算机可读介质的更具体实 例 ( 非详尽列表 ) 将包括下列 ： 具有一根或多根电线的电连接、 便携式计算机磁盘、 随机存 取存储器 (RAM)、 只读存储器 (ROM)、 可擦除可编程只读存储器 (EPROM 或闪速存储器 )、 光纤和便携式光盘只读存储器 (CD-ROM)、 CD ROM、 DVD( 数字视频光盘 ) 或其他电子存储介质。 注意计算机可用介质或计算机可读介质甚至可以是纸或上面印有程序的另一合适介质， 因 为程序可以经由例如纸或其他介质的光扫描而被电子捕获， 然后被编译、 译码或若需要的 话以合适的方式另外处理， 然后被储存在计算机存储器中。
进行本发明的某些实施方式的操作的计算机程序代码可以用包括但不限于下列 的面向对象编程语言和 / 或传统程序编程语言来书写 ： Java、 Smalltalk、 Perl、 Python、 Ruby、 Lisp、 PHP、″ C″、 FORTRAN 或 C++。程序代码可以如下执行 ： 全部在用户计算机上、 部分在用户计算机上、 作为单机软件包、 部分在用户计算机上且部分在远程计算机上或者 全部在远程计算机上。 在后一种情况中， 远程计算机可以通过局域网 (LAN) 或广域网 (WAN) 与用户计算机连接， 或者可以与外部计算机连接 ( 例如， 通过使用互联网服务提供商的互 联网 )。
应理解本文所述的 DLS 系统的功能可以通过计算机可读程序编码模块实施。可以 将这些程序编码模块提供给一般目的的计算机、 特殊目的的计算机、 嵌入式处理器或其他 可编程数据处理设备的处理模块以制造机器， 以使得经由计算机的所述处理模块或其他可 编程数据处理设备来执行的程序编码模块产生用于实施流程图和 / 或方框图的方框中所 指明的功能的工具。
这些计算机程序编码模块还可被储存在可以指导计算机或其他可编程数据处理 设备以特定方式运行的计算机可读存储器中以使储存在计算机可读存储器中的程序编码 模块产生制品。
还可以将计算机程序编码模块加载到计算机或其他可编程数据处理设备上以使 得在计算机或其他可编程设备上进行一系列操作步骤而产生计算机执行的过程以使得计 算机或其他可编程设备上所执行的指令提供用于实施流程图和 / 或方框图方框中所指明 的功能的步骤。
本发明可以在不背离其精神或本质属性的条件下以其他形式来实施， 因此应当参 考下列权利要求而非上述说明书来指明本发明的范围。
根据美国国家科学基金青年教授杰出科研基金 (CAREER) 奖 DMR0552295 和 DMI 奖 0506531， 美国政府可以拥有本发明的某些权利。相关申请的交叉引用
本申请要求 2008 年 1 月 3 日提交的美国临时申请 61/018,719 和 2008 年 3 月 6 日提交的美国临时申请 61/034,334 的优先权。根据 35USC 119 要求所述临时申请的优先 权并且所述申请通过引用被并入。
技术领域
本发明涉及使用受体功能化的金属纳米粒子来检测化学物类、 生物分子和生物靶 标 ( 均称为分析物 ) 的系统和方法。受体是可以通过共价或非共价化学相互作用与分析物 相互作用的任何化学物类和生物分子的通用术语。 背景技术 存在对检测用于如下各种目的的各种化学物类、 生物分子和生物靶标的需要 ： 如 医学诊断、 人和动物健康监测、 生命科学研究、 药物筛选和药剂开发、 环境保护、 工业过程监 测、 食品安全监测、 违法药物使用检测、 国家安全、 其他化学过程和生物过程的监测。
附图说明
图 1 是包括三个不同的实施方式的本发明的示意性图解。该图解是基于使用金纳 米粒子 (GNP) 与动态光散射 (DLS) 测量偶联的均相免疫测定的实例。在实施方式 A 中， 使 用两种不同的探针。探针是与匹配的抗体对轭合的金纳米粒子。在实施方式 B 中， 使用单 一类型的探针。分析物含有多个探针的结合位点， 因此在与探针上的受体结合后可以引起 纳米粒子聚集。在实施方式 C 中， 使用单一类型的探针。然而， 分析物与探针之间的结合不 引起粒子聚集。相反， 存在聚集诱导物来引发纳米粒子聚集。分析物与聚集诱导物彼此相 互竞争与探针结合。
图 2 是 DLS 系统的基本设计。
图 3a-c 代表实施使用多个检测器同时进行多个样品的 DLS 测量 (a， b) 或使用单 个检测器和可旋转圆盘传送带连续进行多个样品的 DLS 测量 (c) 的多样品平台的 DLS 系统 的示意图。图 3(b) 是图 (a) 中所显示的系统的部分侧视图。注意 ： (1) 样品平台可以是可 移动的或固定的。所显示的平台包括 12 个固定的测定溶液容器 ( 在这种情况下， 是 12 个 微孔 ) 或可移动的容器以容纳测定溶液。(3) 当它可以旋转时， 可以使用如 (c) 中所示的 可移除的测定溶液容器连续地添加样品和从圆盘传送带移除样品。 可以将此模式设置为用 于在预定的时间间隔连续测量多个样品。(4) 入射光束与散射光束之间的相对角可以通过 检测器检测， 其通常为 0-90 度之间的角。此处所图解的角为大约 13-25 度。(5) 可以用微 流装置代替圆盘传送带， 该微流装置可以放置在圆盘传送带上和从圆盘传送带上移去。 (6) 样品支架和检测器的数目可以为 1 或任何其他数目。图 4 是 通 过 DLS 在 不 同 浓 度 测 量 的 金 纳 米 杆 (GNR， 尺 寸 为 10×40nm)、 40nm(GNP40) 和 98nm(GNP98) 球形金纳米粒子的平均散射光强度。
图5是： (a) 化学结构 ； 和 (b)GNP 和 GNR 粒子的 TEM 图像 ； (c)GNP、 GNR 探针以及 它们与抗体对的轭合物 GNP-dAb 和 GNR-cAb 的 UV-Vis 吸收谱。两种抗体为抗 - 游离 PSA 抗体 ； (d) 由未轭合的 GNP、 GNR 的 DLS 测量的粒度分布 ； 和 (e) 由它们与抗体对的轭合物测 量的粒度分布。
图 6 显示在样品溶液中具有 1.0ng/mL 的 f-PSA 的测定溶液 (a) 的粒度分布的 DLS 数据。f-PSA 标准溶液 (b) 的测定结果由 DLS 分析获得。测定结果被表示为如 (a) 中所显 示的面积 A 与面积 B 的数值比率。
图 7(a)PAA-GNP( 上 ) 和 PEG-GNP( 下 ) 的化学结构。 柠檬酸盐 -GNP(b)、 PAA-GNP(c) 和 PEG-GNP(d) 在含有不同浓度的 NaCl( 图例为 NaCl 浓度 ) 的 PBS 缓冲溶液 (pH 7.4) 中 的 UV-Vis 吸收谱。
图 8 显示 ： (a) 在溶液中含有 0ng/mL 和 0.1ng/mL 的 f-PSA 的测定溶液的 DLS 数 据 ( 粒度分布 ) ； (b) 纳米粒子的流体动力学直径与 f-PSA 浓度的曲线图。进行了两组测 定。测定显示出良好的测定内和测定间再现性二者。结果由 Precision Detectors， Inc. 的 Cool Batch40 DLS 系统获得。 图 9 显示使用 100nm GNP 抗体轭合物探针在标准溶液中进行的总 PSA 的测定结 果。通过将匹配的单克隆抗总 PSA 抗体对非共价吸附至两批金纳米粒子上来制备 100nm GNP 探针。 测定结果表示为测定溶液的平均粒子直径。 测定在两个不同的浓度范围内进行 ： (a)0.2-10ng/mL 和 (b)0.001 至 1ng/mL。
图 10 显示上清液中的 PC3 细胞所分泌的总 PSA 的两次重复的测定结果， 该测定使 用 100nm GNP 抗体轭合物探针。结果表示为平均粒度。通过将匹配的单克隆抗总 PSA 抗体 对非共价吸附至两批金纳米粒子上来制备 100nm GNP 探针。在生长 24 小时后收集细胞上 清液。样品 PC3A1、 PC3B1 和 PC3C1 在培养皿中具有大约 1 百万、 50 万和 25 万个细胞。为 了进行测定， 将 2μL 的细胞上清液添加到 40μL 的混合纳米探针溶液中。将溶液在室温下 孵育 5-10 分钟后， 通过 DLS 读出结果。
图 11 是使用与图 7 和图 8 中所述相同的探针进行的四种人血清样品的测定结果。
图 12 是分别含有浓度为 34.5、 17.3、 8.6 和 4.3ng/mL 肌动蛋白的肌动蛋白的四种 样品溶液的测定结果。肌动蛋白溶液是细胞裂解物。两种探针通过将匹配的单克隆抗肌动 蛋白抗体与两批 100nm GNP 轭合来制备。前两个柱 ( 蓝色和深红色 ) 是来自两个不同测定 的平均粒度的 DLS 数据， 而第三个柱 ( 浅黄色 ) 是两次测定结果的平均值。
图 13 显示在 37℃下孵育 2 小时后与两种不同的金纳米粒子探针混合的小鼠 IgG 测定溶液的流体动力学直径 (Dh) 改变。(- □ - ： 由小鼠 IgG 与 0.1nM BSA 轭合的 GNP 制 备的对照 ； -Δ- ： 与 0.1nM 山羊抗小鼠轭合的 GNP 混合的小鼠 IgG。该测定使用 BSA 轭合的 GNP 作为研究的对照 )。
图 14 是使用经 0.01nM 山羊抗小鼠 IgG 轭合的 GNP(GNP- 抗 -IgG) 进行的小鼠 IgG 检测的直接测定结果。 使用四参数逻辑拟合而不加权将测量的数据与逻辑模型拟合。 (LLOD ＝ 0.0078ng/mL， 3σ， R＝2 ； y ＝ 187.55435+(35.46758-187.55435)/(1+x/46.97037)0.6302， R2 ＝ 0.9994 ； 误差线 ： 标准偏差。
图 15 是使用两种纳米粒子探针 GNP-IgG 和 GNP- 抗 -IgG 进行的小鼠 IgG 检测的竞 争性测定的结果。 此处， GNP- 抗 -IgG 充当探针， 并且 GNP-IgG 充当聚集诱导物。 分析物小鼠 IgG 与 GNP-IgG 竞争结合 GNP- 抗 -IgG。 GNP- 抗 -IgG 和 GNP-IgG 探针二者的浓度均为 0.1nM。 将各测定溶液在室温下孵育 4.5 小时。使用四参数逻辑拟合而不加权将测量的数据与逻 辑模型拟合。(LLOD ＝ 283.0036ng/mL， 3σ， R＝2； y ＝ 42.21247+(71.12096-42.21247)/ 0.76428 2 (1+x/5023.40461) ， R ＝ 0.9895， 误差线 ： 标准偏差。
图 16 是使用金纳米粒子探针和动态光散射的 DNA 均相检测的示意图。
图 17 是 DNA 轭合前后金纳米粒子 (AuNP) 的 UV-Vis 吸收谱 (a) 和粒度分布 (b)。
图 18 是在存在完美匹配的靶 DNA(a) 和浓度为 10pM 的单碱基对错配的 DNA(b) 的 条件下的 DNA-AuNP 测定溶液的粒度和粒度分布 ( 直径， nm)。
图 19 是由 DLS 测量所确定的含有不同浓度的靶 DNA 的测定溶液的平均直径和其 对靶 DNA 浓度所绘制的图。 发明内容 本发明的实施方式涉及用于监测和检测化学物类、 生物分子和生物靶标 ( 均称为 分析物 ) 的高度灵敏的、 快速的且方便的均相一步式分析测定， 所述化学物类、 生物分子和 生物靶标包括但不限于蛋白、 抗体、 抗原、 酶、 核酸、 激素、 药物、 药物中间体、 环境污染化学 品和物类、 化学战剂和生物战剂、 细菌和病毒、 合成的化学物质。
在一般的实施方式中， 本发明涉及用于检测分析物的分析方法， 所述分析方法包 括提供多个探针的步骤， 所述多个探针各自包含与多拷贝的相同或不同受体轭合的金属纳 米粒子。图 1 是本发明的一般图解。该图解是基于使用金纳米粒子 (GNP) 与动态光散射 (DLS) 测量偶联的均相免疫测定的实例。受体可以为天然受体 ( 例如， 抗体、 蛋白、 DNA 等 ) 或合成的受体 ( 例如， 分子、 离子、 聚合物或其他化学物类 )。 将怀疑含有至少一种分析物的 样品溶液与探针接触以形成测定溶液， 其中在分析物的存在下， 包含分析物的溶液中的一 部分探针变得聚集。动态光散射 (DLS) 用于通过测量测定溶液的聚集度来定量分析物。如 通过 DLS 所确定的由测定溶液所获得的 DLS 数据至少测定样品溶液中分析物的存在， 并且 一般还测定样品溶液中分析物的浓度。 所确定的分析物浓度可用于为医学诊断提供基础或 促进为诊断如个体是否患有 ( 或有可能患有 ) 癌症提供基础的进一步测试， 或用于其他目 的， 如环境监测。
在本文中称为单一探针类型实施方式的另一实施方式中 ( 图 1 中所图解的实施方 式 B)， 第一探针是所提供的仅有的探针类型。该探针在一个纳米粒子上含有多拷贝的单一 类型或混合类型的受体。 在该实施方式中， 分析物可以具有多个结合位点， 并且相同探针类 型可以结合分析物的多个位点以产生纳米探针聚集体。仅通过举例， 纳米粒子可以与可结 合抗原的不同表位的多重多克隆抗体层轭合。 这种结合将引起探针聚集， 该聚集可通过 DLS 检测。另一实例是带有金属离子结合配体层的纳米粒子探针， 所述金属离子结合配体层附 着在表面上。探针可以通过附着至探针的配体与金属离子形成配位络合物。当探针与含有 作为分析物的金属离子的样品接触时， 纳米粒子探针将由于络合物形成而发生聚集， 所述 聚集可以通过 DLS 检测。
在本文中称为多探针类型实施方式的另一实施方式中 ( 如图 1 所图解的实施方式
A)， 方法包括多个第一探针和多个第二探针二者， 其中所述第二探针包含与不同于第一受 体的第二受体轭合的金属纳米粒子。 第一金属纳米粒子和第二金属纳米粒子可以相同或不 同。在该实施方式中， 第一受体和第二受体均可以被选择来与分析物结合并且它们一般识 别分析物上的不同位点来结合。如此， 各受体一般不抑制其他受体的结合。
在受体包含关于抗原靶标的抗体的情况下， 抗体组合应有资格作为 “匹配的对” ， 意思是指它们可以识别抗原上的不同表位， 所以它们不明显地妨碍彼此的结合。在这具体 的情况下， 第一受体和第二受体在本文中可以如 ELISA 中一样被称为 “捕获抗体” 和 “检测 抗体” 。然而， 本发明与 ELISA 关系很小。ELISA 是异相多步式免疫测定。本发明的实施方 式提供均相测定， 所述测定消除 ELISA 对于下列的需求 ： 将捕获抗体结合至通常附着在板 孔底部的固相上， 添加抗原以及容许该抗原与结合的抗体复合， 洗涤以获得未结合的产物 以及容许检测抗体与抗原结合的第二结合步骤。另一个不同是使用动态光散射 (DLS) 来定 量分析物， 相比之下 ELISA 通过下列步骤来实现定量 ： 通过使用酶探针、 荧光探针或放射性 探针测量与基质结合的标记的二抗的量。
在第三实施方式中 ( 如在图 1 中所图解的实施方式 C)， 所述方法包括使用多个单 一探针， 所述单一探针具有与纳米粒子表面轭合的多拷贝受体。探针将主要与分析物的一 个位点结合。探针粒子可以通过与分析物不同的分子或材料形成聚集体。该分子或材料可 被称为 “聚集诱导物” 。该分子或材料可以是另一化学物类、 不同的纳米粒子或者与样品溶 液中的分析物共存的或从非样品溶液的来源添加到样品溶液中的材料。 聚集诱导物与分析 物竞争来与探针结合。探针和分析物之间的结合将抑制由聚集诱导物所引起的探针聚集。 当探针与样品溶液相接触时， 探针将形成通过聚集诱导物分子引入的聚集物。分析物将不 引起纳米粒子探针聚集或引起与聚集诱导物相比少得多的纳米粒子探针聚集。因此， 如果 样品溶液中存在分析物， 则探针聚集度将较低。探针聚集度与分析物浓度成反比。该实施 方式的一个实例是利用在纳米粒子表面上含有单一类型一抗的探针的竞争性免疫测定。 该 探针可以通过与二抗溶液混合而聚集在一起。在该情况下， 二抗是聚集诱导物。例如， 如果 探针含有从小鼠中产生的一抗， 则可以使用山羊抗小鼠 IgG 来作为聚集诱导物。当探针溶 液与含有抗原的样品溶液混合时， 抗原分子将与二抗竞争来与探针结合。由于抗原 - 探针 结合将不引起探针聚集。 所以， 当样品中存在抗原时， 将发生与样品中不存在抗原时相比较 小程度的探针聚集。样品溶液中的抗原浓度可以通过 DLS 测量来定量并且其与纳米粒子聚 集度成反比。
根据本发明的实施方式的定量包括 ： 将光 ( 例如， 紫外光、 可见光、 近红外光或红 外光 ) 导向与多个纳米粒子探针混合的含分析物的溶液 ； 以及测量来自测定溶液的散射光 信号。通过使用动态光散射而由测定溶液获得 DLS 数据至少测定了样品溶液中分析物的存 在， 并且一般还测定样品溶液中分析物的浓度。 DLS 数据包括但不限于测定溶液中的粒度和 / 或粒度分布和 / 或粒子扩散系数。 所确定的分析物浓度可用于如本文所述的多种目的， 例 如， 为医学诊断提供基础或促进为诊断如个体是否患有 ( 或有可能患有 ) 癌症提供基础的 进一步测试。
纳米粒子一般为金属， 如金或银， 已知它们均提供大的散射截面 (Yguerabide， J. ； Yguerabide， E.E.Anal.Biochem.1998， 262， 137.)。 纳米粒子可以具有不同的形状和化学组 成， 如球形纳米粒子、 纳米杆 (nanorod)、 纳米壳 (nanoshell)、 合金纳米粒子 ( 具有多于一种金属组分的纳米粒子 )、 纳米笼 (nanocage)、 纳米颗粒 (nanorice) 等。提供大的散射截 面的其他纳米粒子或胶体粒子也可能是有用的。 在本文中一般性地对于金纳米粒子描述本 发明。例如， 粒度在 10 至 100 纳米范围内的金纳米粒子， 包括球形粒子、 纳米杆或纳米壳， 在表面等离子体共振波长区域内提供异常大的光散射截面。 金纳米粒子的光散射量级是比 诸如荧光素之类的强荧光染料的光发射更高的数量级。 金纳米粒子的这种强光散射性质已 被应用于生物细胞的光学显微镜成像以供定量评估， 但是没有被用于通过动态光散射法在 均相溶液中进行的定量分析和测定。 强的光散射使得金和银纳米粒子成为用于分析应用的 优异的光学探针 / 示踪物。
受体可以是已知与给定的靶分析物缔合的任何部分。在竞争性测定实施方式中， 受体还将结合聚集诱导物。分析物和聚集诱导物竞争来与受体结合。
受体适于结合分析物。 受体可以包括但不限于抗体、 DNA、 RNA、 包括酶在内的蛋白、 细胞或细胞组分、 仿生物 (biomimetic)、 可以与分析物特异性结合的合成分子或材料。 仿生 物受体可以包括分子印迹抗体、 基于 DNA 的适体和肽核酸 (PNA)。
受体分子 ( 天然的和合成的 ) 将通过共价或非共价化学相互作用被附着至金属纳 米粒子以制备探针。 用于将诸如抗体的生物受体分子通过非共价化学相互作用连接至金纳 米粒子的方法是已经熟知并且通常被实践的。对于共价连接， 纳米粒子应在粒子表面具有 至少一种化学官能团如羧酸或胺， 或者可以将受体连接至纳米粒子的任何其他合适的官能 团。受体分子将与化学官能团反应形成共价化学键合。
分析物可以是任何化学物类、 生物分子和生物靶标。化学物类为任何天然的和合 成的化学物质 ( 中性的或带电荷的， 具有或不具有确定的分子结构 ) ； 诸如汞 (II)、 铅 (II) 的离子 ； 聚合物 ； 材料 ； 药物和药剂 ； 药物候选物或任何其他化学物质。生物分子一般是生 物化学物质， 如蛋白、 酶、 抗体、 抗原、 半抗原、 药物、 药物中间体或片段、 激素、 多糖、 代谢物、 核酸。生物靶标为生物物类或活系统， 如细菌、 病毒或相关组分。将使用所述发明测定的样 品可以是基于生物的或基于非生物的。生物样品可以是但不限于人和其他动物的血液、 血 浆、 血清、 尿、 唾液、 痰或其他体液 ； 细胞上清液、 细胞培养基或细胞裂解物 ； 组织提取物。非 生物样品可以是但不限于来自不同来源的水、 来自不同材料和物体的液体提取物等。样品 溶液可能需要或不需要在进行测定前进行化学预处理或物理预处理。 该处理是为了消除大 的粒子或可能显著干扰测定结果的其他因素。物理处理的实例包括过滤、 离心、 超声处理、 沉淀、 加热或冷却等。化学处理的实例包括添加一种或多种化学品来预处理样品， 所述化 学品如样品稀释剂、 表面活性剂、 氧化剂或还原剂、 消毒剂、 细胞裂解剂、 变性剂和去杂交剂 (de-hybridization agent)。用于测定的样品的量可以从纳升至微升变化。可以使用液体 处理系统或微流装置 (microfluidic device) 或纳流装置 (nanofluidic device) 将样品 溶液的一部分分为多个较小的样品部分以进行多种分析。
DLS 是广泛用于粒度和粒度分布研究的技术 (Berne， B.J. ； Pecora， R.Dynamic light scattering ： with applications to chemistry， biology， and physics( 动态光 散射 ： 化学、 生物和物理中的应用 ) ； 1976， Wiley ： New York.)。30 多年前已经确立了 DLS 的原理， 并且大量的 DLS 仪器和系统可商购获得。该技术是基于球形粒子的布朗运动， 其引起入射激光的多普勒频移。测量粒子的扩散系数并根据斯托克斯 - 爱因斯坦关系 (Stokes-Einsteinrelation) 计算粒度。 尽管研究已报道了金属 ( 例如， 金 ) 纳米粒子的生物轭合和生物分子相互作用指导的纳米粒子聚集， 但是在本发明之前， 未公开 DLS 与金属 ( 例如， 金 ) 纳米粒子探针一起用于均相和定量测定。应用于本发明的实施方式， DLS 可检 测由形成纳米粒子二聚体、 三聚体、 低聚体和聚集体而引起的粒度改变或粒度分布改变。 该 能力使得 DLS 成为用于根据本发明的实施方式的定量测定的合适分析工具。
用于本发明的金属纳米粒子在大小方面可以是单分散的或多分散的。 “多分散的” 意指纳米粒子溶液含有不同粒度范围的纳米粒子， 而 “单分散的” 意指所有纳米粒子均具 有相同或类似粒度。用于本发明的金属纳米粒子一般具有直径范围为 1-1000nm 的平均尺 寸。纳米粒子一般在粒子表面共价或非共价附着有分子、 离子或聚合物层以防止纳米粒子 去稳定。这些分子、 离子和聚合物在其中可具有或不具有硫醇基团或胺基团。硫醇和胺基 团对金纳米粒子具有高亲和力。 可以使用对金纳米粒子和银纳米粒子具有高亲和力的其他 分子。柠檬酸盐是用于保护和稳定金和银纳米粒子的常见配体。柠檬酸盐分子通过静电 相互作用与金和银纳米粒子结合。被柠檬酸盐分子稳定的金纳米粒子或胶体的制备在 50 多年前就已确立， 并且自那时起已被开始使用 (Turkevitch， J. ； Stevenson， P.C. ； Hiller， J.Discuss.Faraday Soc.1951， 11， 55 ； 和 Frenz， G.Nature Phys.Sci.1973， 241， 20.)。还 使用诸如寡聚 ( 氧化乙烯 )(OEG) 或聚 ( 氧化乙烯 )(PEG) 的在聚合物上具有一个或多个硫 醇基团的聚合物或较小的低聚体来对金和银纳米粒子表面进行修饰。 在高盐含量的溶液如 人血液和其他生物流体中， OEG 或 PEG 保护的金纳米粒子比柠檬酸盐稳定的纳米粒子稳定 得多得多。这些生物流体通常的盐浓度是约 100-200mM。 本文还描述了新的金属粒子。该金属粒子具有附着至粒子表面的聚 ( 丙烯酸 ) (PAA) 层。PAA 通过非共价相互作用如静电相互作用、 范德华相互作用和氢键合附着至纳米 粒子。与 OEG 和 PEG 保护的纳米粒子类似， PAA 保护的纳米粒子在高盐含量的溶液中也稳 定得多得多。
还描述了关于如何从 DLS 分析中提取分析物 ( 例如， 抗原 ) 浓度的新方法。该方 法描述了从 DLS 测量获得定量数据。
本发明并不限于上述公开内容或下面所提供的实施例。本发明可用于其他应用， 例如， 本发明的实施方式可一般用于检测在用合适的受体针对这些物类修饰金属 ( 例如， 金 ) 纳米粒子后可以引起纳米粒子聚集或解聚集的任何化学品、 生物分子或物质。如上面 所提到的， 除了金纳米粒子外， 本发明的实施方式还可使用银纳米粒子或提供大的散射截 面并且在非常低的浓度下可使用 DLS 技术检测的其他类型的纳米粒子。此外， 本发明不限 于检测生物样品中的化学品和生物分子。它还可用于检测非生物样品中的化学物质。
具体实施方式
下面所提供的实施例均为非限制性实施例。所公开的具体材料仅为示例性材料。 例如， 金属纳米粒子并不限于金纳米粒子 (GNP)， 分析物不限于生物分子。
实施例 1 ：
用于癌症生物标志物蛋白检测的一步式均相免疫测定
世界上有数百万人面临着癌症的风险， 癌症已成为死亡率的主要原因。早期癌症 检测可以显著地改善癌症患者的治疗和存活率。 随着肿瘤的发展， 细胞、 组织和器官可以释 放、 增加或降低循环血系统中的某些化学品的释放。 这些特定的化学品称为生物标志物。 生物标志物的检测和监测对癌症诊断和治疗具有巨大的意义。
用 于 生 物 标 志 物 检 测 的 理 想 免 疫 测 定 技 术 期 望 符 合 下 列 的 4-S 标 准 ： 简单 (simple)、 高灵敏度 (sensitive)、 高度特异性 (specific) 以及需要少量的样品 (small)。 尽管存在大量的测定和传感器技术， 但是仍需开发出符合所有这些标准的理想生物分析工 具。大多数生物测定技术或生物传感器缺乏高灵敏度， 涉及大量的样品和 / 或只有经训练 的专业人士能够进行的复杂的测定步骤 / 数据分析。 诸如 ELISA、 化学发光免疫测定的典型 异相夹心型免疫测定包括抗体固定、 多步孵育和洗涤循环， 随后是信号放大和读数。 从最初 的抗体固定到最后的测定结果读数， 整个免疫测定通常可花费数小时乃至数天来完成。传 统的免疫测定是相当耗时且耗力的。尽管在医学测试实验室中， 这些测定均是通过完全自 动化的仪器进行的， 但这些仪器笨重， 并且由于测定步骤的复杂导致制造和维护昂贵。 这些 系统不适于护理点目的和单独的研究实验室。而且， 典型的板免疫测定需要相对大量的样 品 (50 至 100μL)， 因此其不适于单滴的血液分析。 已经开发了蛋白微阵列来使测定所需的 样品量达到最小， 并且其具有另一与众不同的优点即多重能力。 然而， 蛋白微阵列涉及使用 复杂软件进行数据分析， 并且测定的开发和验证的花费对于常规目的和大多数研究实验室 将其用于生物标志物研究来说过高。 如图 1 中所图解的， 实施方式 A， 粒度范围为约 1-1000nm 的具有大的光散射截面 的金纳米粒子 (GNP) 被用作光学探针而与用于特定癌症生物标志物的抗体对 ( 捕获抗体和 检测抗体， cAb 和 dAb) 偶联。然后将这两种纳米粒子探针 (GNP-cAb 和 GNP-dAb) 与样品溶 液混合， 所述样品溶液可能需要或不需要被预先过滤或化学处理来移除大的粒子。在存在 抗原的情况下， 抗原 - 抗体结合将导致纳米粒子聚集。可通过 DLS 定量相对于单个纳米粒 子探针的纳米粒子聚集体的形成， 并且可将该数量信息与抗原浓度相关联。 可选地， 如果单 个粒子和粒子聚集体的分布峰未被分离， 则将使用由于聚集体形成所引起的平均粒度 ( 例 如， 其可以被表示为流体动力学直径 ) 增加而与抗原浓度相关联。
已知粒度在 10 至 100 纳米范围内的金纳米粒子， 包括球形粒子、 纳米杆和纳米壳， 在表面等离子体共振 (SPR) 波长区域内具有大的光吸收和散射截面。以标准化术语来讲， 30nm 金粒子在其 SPR 区域内的散射截面比 30nm 的聚苯乙烯粒子高约 250 倍。如与荧光团 的比较， 来自 60nm 金纳米粒子的散射光强度比强荧光性的荧光素分子高四至五个数量级 (Yguerabide， J. ； Yguerabide， E.E.Anal.Biochem.1998， 262， 137.)。
动态光散射 (DLS) 也称为光子相关谱或准弹性光散射， 是广泛用于粒度和粒度分 布分析的技术。该技术是基于球形粒子的布朗运动， 其引起入射激光的多普勒频移。测 量粒子的扩散系数并根据斯托克斯 - 爱因斯坦关系计算粒度。尽管在 30 多年前非常有 限数目的研究报道了使用 DLS 进行定量和均相免疫测定， 但在这些之前的工作中， 使用 聚合物胶乳粒子作为光散射增强物来与抗体轭合作为光学探针 (Cohen， RJ. ； Benedek， G.B.Immunochemistry 1975， 12， 963-966 ； Von Schulthess， G.K. ； Cohen， R.J. ； Benedek， G.B.Immunochemistry 1976， 13， 963-966)。与类似粒度的金纳米粒子相比， 聚合物胶乳粒 子的散射弱得多。这种低散射强度不足以压住来自样品溶液中其他粒子的散射信号， 从而 使得这种光散射免疫测定技术对于低丰度蛋白分析物的检测来说不合适或显著地受限。 通 过使用金纳米粒子作为探针， 从金纳米粒子探针散射的光强度强至足以压住从样品溶液中 产生的背景光散射， 因此为免疫测定提供了大大增强的灵敏性。
本发明人首次开发了使用如图 1 中所图解的实施方式 A 进行前列腺癌生物标志物 检测的均相一步式免疫测定 (Huo， Q. 等人 J.Am.Chem.Soc.2008， 130， 2780-2782)。在此工 作中， 使用了直径为 40nm 的球形金纳米粒子和尺寸为 10×40nm 的金纳米杆来制备匹配的 抗体轭合探针。在可行性研究中， 发明人使用 DLS 分析了金纳米粒子和纳米杆的检测极限。 图 4 显示了通过 DLS 在不同浓度测量的金纳米杆 (GNR， 尺寸为 10×40nm)、 37nm(GNP37) 和 98nm(GNP98) 球形金纳米粒子的平均散射光强度。根据此数据， 三种金纳米粒子材料 GNR、 GNP37 和 GNP98 的检测极限分别被确定为 0.4pM、 0.02pM 和 0.7fM。这种高灵敏性使得金纳 米粒子成为用于根据本发明的实施方式的免疫测定的非常具吸引力的光散射探针。
根据图 1 中所列出的原理， 本发明人开发了使用本发明来检测游离的前列腺特异 性抗原 ( 游离的 PSA) 的免疫测定， 所述抗原是与前列腺癌相关的生物标志物蛋白。前列 腺特异性抗原 (PSA) 是经 FDA 批准的用于前列腺癌诊断的生物标志物。健康男性的总 PSA 浓度在若干 ng/mL 的范围内而且游离的 PSA(f-PSA) 浓度通常低于 1ng/mL， 其在总 PSA 的 10-25％的范围内。游离的 PSA 是未结合形式的前列腺特异性抗原。研究已显示总 PSA 中 的 f-PSA 的百分比在患前列腺癌的患者中要比患良性前列腺增生的那些患者更低。现已将 游离 PSA 水平引入并作为用于前列腺癌筛选和诊断的又一生物标志物进行研究。 在此研究中， 发明人制备了两种类型的金纳米粒子 ： 一种是柠檬酸盐稳定的球形 金纳米粒子 (Ct-GNP， 直径 37nm)， 并且另一种是十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB) 保护的金纳 米杆 (CTAB-GNR， 10×40nm)( 图 5a)。两种抗体通过非共价吸附轭合至两种纳米粒子。此 过程对于本领域的那些技术人员是已知且熟悉的。GNP 和 GNR 的 TEM 图像和 UV-Vis 吸收 谱在图 5b 和 5c 中显示。通过 DLS 分析了粒度和粒度分布 ( 图 5d)。首先通过 UV-Vis 谱 分析和 DLS 测量证实了纳米粒子与检测抗体以及纳米杆与捕获抗体的成功轭合 ( 图 5c 和 5e)。与最初的 GNP 和 GNR 相比， 纳米粒子的 SPR 吸收带由于轭合的粒子的表面化学改变而 略微移动。对于 GNP 和 GNR， 轭合的纳米粒子的粒度还分别从 37nm 增至 57nm， 和从 30nm 增 至 37nm。这些数据表明， 两种抗体分别成功地轭合至 GNP 和 GNR。估计附着至纳米粒子表 面的抗体数目为每个粒子 10-100 个之间。较大的粒度将导致较多的抗体附着至粒子表面。
然后使用轭合的纳米粒子和纳米杆在溶液中进行 f-PSA 的均相免疫测定。将两种 纳米探针以 1 ∶ 2.5(GNP-dAb ∶ GNR-cAb) 的比例混合， 然后将其添加至不同浓度的标准 f-PSA 溶液中。GNR 探针过量添加， 并且用作内部参考。在 DLS 分析之前在室温下孵育测定 溶液 30min。在得自 PrecisionDetector， Inc. 的 Cool Batch40 系统上进行 DLS 分析。
图 6a 是在存在 1ng/mL 的 f-PSA 的情况下混合的纳米探针溶液的典型粒度分布。 如从图 5e 所看到的， 对于纯的纳米粒子和纳米杆轭合物， 仅从分布中观察到了一个粒度分 布。将 f-PSA 添加至纳米探针溶液时， DLS 测量检测到两组粒度 ( 图 6a， 峰区 A 和 B)， 一组 集中在 60nm 以下， 代表单独的纳米粒子和纳米杆 ( 区 B)， 而一组在 100nm 以上， 对应于纳米 粒子 - 纳米杆低聚体 ( 区 A)。粒度范围为 60-500nm( 区 A) 的纳米粒子低聚体相对于粒度 范围为 20-60nm( 区 B) 的单独纳米粒子的相对比率 ( 此处， 我们使用了散射光强度比 ) 可 以从粒度分布曲线进行数值计算。图 6b 是这种数值比与 f-PSA 浓度的曲线图。随着 f-PSA 浓度的增加， 纳米粒子低聚体的相对百分比增加而单独的纳米探针的百分比降低。我们在 缓冲液中使用相同的纳米探针进行了未知样品溶液的分析 (f-PSA 浓度为 0.5ng/mL)。 测得 的浓度与样品的真实浓度对应得非常好 ( 图 6b， 红色星号所指示的数据 )。
本发明人所展示的免疫测定提供传统免疫测定和其他技术水平的生物分析技术 所不可比拟的若干优点 ： (1) 极简单的测定过程 ； (2) 测定需要极少量的样品 (0.1μL 至若 干 μL)， 这意味着我们可以从取自指尖的单滴血样检测多种生物标志物 ； (3) 高灵敏度 ( 浓 度为 fM 至 aM， 或绝对质量为 fg) 而不需要任何放大步骤 ； (4) 低成本但具有高通量分析能 力； (5) 极快的分析时间 ( 完整的测定可以在少于 5 分钟之内完成 )。
实施例 2 ：
使用新的强的金纳米粒子探针的改良均相免疫测定
强的金纳米粒子探针的开发 ： 开发了在高离子强度缓冲溶液中与柠檬酸盐稳定的 金纳米粒子相比稳定性改善的两种新的纳米粒子探针。一种是由聚 ( 丙烯酸 )(PAA) 稳定 的球形金纳米粒子， 而另一种是硫醇化的聚 ( 乙二醇 ) 配体 (PEG) 稳定的金纳米粒子 ( 图 7a)。两种纳米粒子均是由柠檬酸盐稳定的金纳米粒子的表面修饰获得的。根据以下步骤 合成 PEG 保护的 GNP ： 首先根据报道的方法合成了平均核心直径为 30-35nm 的柠檬酸盐保 护 的 GNP(Turkevitch， J. ； Stevenson， P.C. ； Hiller， J.Discuss.Faraday Soc.1951， 11， 55 ； 以及 Frenz， G.Nature Phvs.Sci.1973， 241， 20.)。然后将如图 7 中所示的硫醇化的和 双官能的 PEG 配体 HS-PEG-COOH(PEG 的 MW 为 ： 3000， 得自 Rapp Polymers) 的 1mL 水溶液 -4 (2×10 M) 逐滴添加至 10mL 的柠檬酸盐保护的 GNP 溶液中。使混合物在室温下震荡过夜。 通过离心纯化了 HS-PEG-COOH 配体官能化的 GNP 并用去离子水洗涤 3 次。将 PEG-GNP 悬浮 在纯的去离子水中以供进一步使用。
根 据 以 下 步 骤 合 成 PAA 保 护 的 GNP ： 边 剧 烈 搅 拌 边 将 1.5mL 柠 檬 酸 钠 溶 液 (38.8mM) 迅速添加至煮沸的 HAuCl4(0.35mM， 100mL) 水溶液中。在煮沸 15 分钟后， 将 2mL PAA 水溶液 (27mg/mL， pH ： 约 3) 逐滴添加至上述溶液中。使混合物继续沸腾 4 小时。将溶 液冷却至室温后， 通过离心浓缩纳米粒子产物， 用去离子水充分洗涤两次， 然后用稀 NaOH 溶液 (pH ： 10) 洗涤两次。然后将 PAA 修饰的 GNP 再分散到去离子 (DI) 水中以供进一步使 用。
使用 UV-Vis 吸收谱法在不同盐浓度的缓冲溶液中进行柠檬酸盐稳定的、 PAA 稳定 的和 PEG 稳定的金纳米粒子的稳定性比较研究 ( 分别为图 7b、 7c 和 7d)。当金纳米粒子开 始聚集时， 表面等离子体共振带将移动并变宽。 根据如图 7 中所示的 UV-Vis 谱， PAA 稳定的 GNP 在 NaCl 浓度高达 150mM 的 PBS 缓冲溶液中保持稳定达 24 小时而没有显著的聚集， 然而 柠檬酸盐稳定的金纳米粒子在盐浓度为 30mM 时严重聚集。PEG 保护的 GNP 可以在 NaCl 浓 度为 100mM 的缓冲溶液中存在而没有显著的聚集。通过使用 DLS 的粒度分析进一步证实了 PAA 保护的和 PEG 保护的金纳米粒子的显著增加的稳定性 ( 此处未显示数据 )。人血的生 理盐浓度在 100-150mM 的范围内。在我们的研究中合成的 PAA 保护的和 PEG 保护的金纳米 粒子均可以合适地作为纳米探针以用于以后的生物样品测定。
使用 PAA 保护的和 PEG 保护的 GNP 与抗 -f-PSA 抗体对轭合并且进行 f-PSA 的免 疫测定。 从两种纳米粒子轭合物均获得了非常相似的免疫测定结果， 但此处仅显示 PEG-GNP 的数据来作为示例。PAA-GNP 抗体对的轭合通过类似于抗体与柠檬酸盐保护的 GNP 轭合的 简单非共价吸附进行。抗体对与 PEG-GNP 的轭合通过经由酰胺键连接的共价化学进行。轭 合后， 纳米粒子的平均直径平均增加了 10-15nm， 这与覆盖有抗体层的 PEG-GNP 或 PAA-GNP 的预期尺寸增加相对应。然后使用这些纳米粒子探针进行了标准溶液中的 f-PSA 的免疫测定。对于此测定， 将与捕获抗 -f-PSA 抗体和检测抗 -f-PSA 抗体轭合的 PEG-GNP 等量混合， 并通过 DLS 监测和分析由纳米粒子聚集引起的平均纳米粒子粒度增加。图 8a 是存在 0ng/ mL 和 0.1ng/mL f-PSA 的测定溶液中的纳米粒子的粒度分布， 并且图 8b 涉及两个不同实验 的测定结果。从图 8a 可以看到当存在分析物 f-PSA 时， 与样品溶液中不具有分析物 f-PSA 的测定溶液相比测定溶液的平均粒度增加 ( 比较两个深灰色的分布峰， 白色的粒子分布峰 来自杂质 )。如从图 8b 看到的， 平均粒度 ( 此处表示为流体动力学直径 ) 与分析物浓度的 增加成比例地增加。各样品溶液的测定重复进行。所测试的各浓度的标准偏差很小， 表明 优异的测定内再现性， 而测定间再现性也非常好。
下列 7 种生物标志物当前被作为免疫测定开发的靶分析物进行测试 ： 游离 -PSA、 总 PSA、 CA 125、 CA 15.3、 CA 19-9、 Her-2/neu 和 CEA。这些生物标志物与下列癌症的一种 或多种相关 ： 前列腺癌、 乳腺癌、 卵巢癌、 胰腺癌、 肝癌、 肺癌和结肠直肠癌。除了 CEA 外， 所 有其他的生物标志物均为 FDA 批准的血清生物标志物。本文所描述的方法可以基本上应用 于任何生物标志物。 因此， 本文所述的生物测定技术不限于这些具体的癌症生物标志物。 它 还可以延伸至其他蛋白、 抗体、 抗原、 DNA、 RNA 以及其他生物靶标的分析。
实施例 3 ：
具有改良的灵敏度和动态范围的一步式均相免疫测定的开发 ： 如图 4 中所显示 的， 来自 100nm GNP 的光散射强度基本上高于 40nm GNP 的光散射强度。最近， 我们使用平 均核心直径为 100nm 的 GNP 制备了用于总前列腺特异性抗原 (PSA) 检测的一组纳米粒子探 针。记录了测定溶液的平均粒度 ( 或粒子的所谓流体动力学直径 ) 以确定分析物浓度。将 用于总 PSA 的两种匹配的抗体与柠檬酸盐保护的 100nm GNP 轭合以形成两种纳米粒子探 针。使用这组新探针， 我们能够检测浓度低至 1pg/mL 的总 PSA， 并且将测定的动态范围延 伸至两个浓度范围 ： 0.1-10 和 0.001-1ng/mL( 图 9a 和 b， 两种动态范围通过调节添加至纳 米探针溶液的样品的不同量来获得 ： (a) 将 2μL 样品添加至 40μL 的探针溶液中 ； (b) 将 20μL 的样品与 20μL 的探针溶液混合 )。高浓度范围可用于常规的筛选目的， 而低浓度范 围可用于监测前列腺切除术之后的癌症复发。
此外， 我们在生长 24 小时后收集的细胞上清液中使用该测定来检测由前列腺癌 细胞即 PC3 分泌的 PSA。结果显示在图 10 中。样品 PC3A1、 PC3B1 和 PC3C1 在培养皿中具 有大约 1 百万、 50 万和 25 万个细胞。为了进行测定， 我们简单地将 2μL 的细胞上清液添加 到 40μL 的混合纳米探针溶液中。将溶液在室温下孵育 5-10 分钟后， 在小于 1min 内通过 DLS 读出结果。比较 PC3A1、 PC3B1 和 PC3C1， 可以清晰地看到 PSA 水平的差异 ( 图 10)。测 定的再现性非常好 ( 图 10 中所显示的数据是两次重复的 )， 并且使用不同批次的纳米探针 进行的测定也有非常好的再现性。我们使用商购获得的总 PSA ELISA 试剂盒 (Anogen) 来 测试这三种细胞上清液样品。该试剂盒一点都不能检测来自所有三种样品的 PSA( 该测定 试剂盒的有效性已经通过试剂盒中所含有的标准 PSA 溶液和多种人血清样品的测定得到 证实 )。这些结果清楚地证明了本发明所述的新测定与商业的免疫测定产品相比之下无可 比拟的优越性。
发明人还使用 100nm GNP 探针分析了来自以下 4 种不同的人血清样品的总 PSA 的 相对水平 ： F6901、 M7903、 M4406 和 M5512。测定溶液的粒度分析结果显示在图 11 中。″ F″ 意指受治疗者为女性而″ M″意指受治疗者为男性。 已知这些人受治疗者为正常的健康人，并且未被诊断出患前列腺癌。样品名称中的前两个数字为受治疗者出生的年份。根据粒度 分析的结果， 总 PSA 水平的顺序应为 ： M4406 ＞ M7903 ≌ M5512 ＞＞ F6901。M5512 的临床 确定的总 PSA 水平为 0.6ng/mL。 总 PSA 水平的这个顺序粗略地反映了女性与男性之间以及 不同年龄的男性之间的总 PSA 水平差异。女性应不具有或具有极低水平的 PSA， 而在 60-65 岁的男性中 PSA 水平增加。尽管总 PSA 水平的绝对值尚需通过建立准确的校准曲线来确 定， 但是迄今为止这些结果表明本发明中所描述的免疫测定可用于从人血液和血清样品中 进行分析物检测。
实施例 4 ：
使用如本发明所述的一步式均相免疫测定的肌动蛋白免疫测定 ： 肌动蛋白是所有 细胞类型中细胞骨架结构和收缩结构的主要组分。它在量上不同， 与细胞和组织的分化类 型以及功能状态有关。可以发现两种不同形式即球形或纤维状态的肌动蛋白。肌动蛋白常 作为标准蛋白溶液用于蛋白质印迹 (Western blot) 中以监测蛋白质印迹的成功。通过将 单克隆抗体匹配对与 100nm GNP 轭合， 本发明人开发了用于使用动态光散射进行肌动蛋白 均相测定的两种探针。图 12 是一系列肌动蛋白溶液的测定结果。该结果与由蛋白质印迹 所获得的结果很好地对应。用于蛋白质印迹分析的四种样品肌动蛋白 1 至肌动蛋白 4 的浓 度分别为约 34.5、 17.3、 8.6 和 4.3mg/mL。蛋白质印迹的肌动蛋白检测极限为大概 2mg/mL。 将这四种样品稀释 1 百万倍至分别为 34.5、 17.3、 8.6 和 4.3ng/mL 以用于使用如本文所述 的发明的均相免疫测定。如图 12 中所看到的， 可以清楚地看到四种肌动蛋白样品之间的差 异。本发明中所公开的均相免疫测定的灵敏度比传统的蛋白质印迹高约 6 个数量级。用于 本测定的样品溶液的量 (2-5 微升 ) 也大大小于蛋白质印迹分析所需使用的 (100 微升 )。 实施例 5 ：
用于小鼠 IgG 检测的使用山羊抗小鼠 IgG 金纳米粒子探针的一步式竞争性测定和 非竞争性测定 ： 在此实施例中， 本发明人开发了使用如图 1 中所图解的实施方式 B 和 C 的两 种形式的小鼠 IgG( 免疫球蛋白 G) 检测测定。此研究证明使用所述发明的竞争性测定和非 竞争性测定二者的可能性。山羊抗小鼠 IgG 是对一抗小鼠 IgG 具有特异性结合亲和力的二 抗。二抗可以与一抗的 Fab、 Fab′或 Fc 区结合， 因此认为小鼠 IgG 具有二抗的多个结合位 点。
在我们开发的用于小鼠 IgG 检测的第一种形式的测定中， 将小鼠 IgG 直接与轭合 了山羊抗小鼠 IgG 的 GNP(40nm， GNP- 抗 -IgG) 混合。山羊抗小鼠 IgG 与 GNP 的轭合通过非 共价吸附进行。由于二抗结合一抗小鼠 IgG 的多个结合位点， 小鼠 IgG 引起了纳米粒子聚 集。 图 13 为探针浓度为 0.1nM 时进行的测定， 而图 14 为探针浓度为 0.01nM 时进行的测定。 在这种一步式测定中， 当探针浓度设定为 0.01nM 时， 可以检测到小鼠 IgG 的浓度为 7.8pg/ mL 至 50ng/mL( 或约 52fM 至 0.33nM)( 来自图 14 的结果 )。如由图 13 与图 14 的比较所揭 示的， 可以使用不同浓度的纳米粒子探针来调节测定的检测极限和动态范围。此实施例为 如本发明和图 1 所描述的实施方式 B 的说明， 其使用单一类型的探针来检测具有与单一类 型的受体结合的多个结合位点的分析物， 所述受体附着至纳米粒子探针。
此研究中所开发的第二种形式的测定是使用小鼠 IgG 轭合的和山羊抗小鼠 IgG 轭 合的 GNP 即 GNP-IgG 和 GNP- 抗 -IgG 二者进行的竞争性测定。GNP- 抗 -IgG 充当探针并且 GNP-IgG 充当聚集诱导物与分析物小鼠 IgG 竞争结合 GNP- 抗 -IgG。 通过将生物素化的小鼠
IgG 与链霉抗生物素涂布的 GNP 轭合来制备小鼠 IgG 轭合的 GNP 探针。 当以约 1 ∶ 1 的摩尔 比简单地将溶液中的两种 GNP 探针混合在一起时， 两种 GNP 探针将由于小鼠 IgG 与山羊抗 小鼠 IgG 分子之间的特异性结合而聚集在一起。将小鼠 IgG 作为靶蛋白添加在混合的探针 溶液中引起两种纳米粒子探针之间聚集的减少。 溶液中的小鼠 IgG 分析物将与 GNP- 抗 -IgG 结合， 从而抑制形成聚集体的 GNP-IgG 与 GNP- 抗 -IgG 的结合。然后使用聚集的减少与靶 蛋白小鼠 IgG 的浓度相关联。图 15 显示表示为流体动力学直径形式的测定溶液平均粒度 相对于分析物浓度的测定结果。发现平均粒度与分析物浓度为反比关系。在此测定中， 可 以检测出溶液中约 100ng/mL 至 100,000ng/mL 浓度的小鼠 IgG。这种竞争性测定避免了非 竞争性测定中常遇到的 “钩状效应 (hook effect)” 的问题。
通过此研究， 发明人证明具有强的光散射性质的金纳米粒子可用作高灵敏度的光 学探针来代替传统的聚合物胶乳粒子用于激光散射免疫测定开发。 可以通过选择适当的纳 米粒子探针浓度和测定条件而非常方便地将此测定的灵敏度和动态范围调节至预期范围。 可以使用单一类型的探针或多于一种类型的探针来进行测定。 在用于各单独蛋白分析物的 实际测定开发中可以考虑竞争性测定形式和非竞争性测定形式二者。
实施例 6 ： 使用动态光散射的用于 DNA 检测的一步式高度灵敏的方法。本发明人还证明了本 发明可用于 DNA 检测和分析 (Huo Q. 等人 J.Am.Chem.Soc.2008， 130， 8138-8139)。对于用 于遗传性疾病和致病性疾病的临床诊断的特异性的 DNA 序列的快速、 低成本和灵敏的检测 存在相当大的需求。目前基于荧光光学标记的 DNA 检测方法如 DNA 微阵列和分子信标在市 场上占据优势地位。然而， 在这些广泛被采用的方法中存在若干限制。一个问题是相对低 的信号放大。由于一个 DNA 探针标记有一个或几个荧光团， 所以当靶 DNA 浓度低时， 荧光信 号相当弱， 导致相对弱的灵敏度。第二个问题是典型荧光团的弱的光稳定性。大部分有机 染料遭受严重的光漂白并且这通常导致不能再现的结果。
为了解决这些问题中的一些， 作为用于 DNA 检测的信号探针考查了几种类型的纳 米材料， 如量子点、 碳纳米管、 硅纳米线以及金属纳米粒子。 在它们之中， 多种形式的金纳米 粒子 (AuNP 或 GNP) 已基于其独特的粒度和距离依赖性光学性质而被用于检测 DNA。 Mirkin 及其同事首先开发了在均相溶液中基于存在靶 DNA 的条件下寡核苷酸功能化的 AuNP 聚 集体的形成而进行的 DNA 杂交的比色检测 (Elghanian， R. ； Storhoff， J.J. ； Mucic， R.C ； Letsinger， R.L. ； Mirkin， C.A.Science 1997， 277， 1078.)。纳米粒子聚集可以通过观察 溶液由红色向紫色的颜色变化直接检测， 或通过 UV-Vis 吸收谱监测。然而， 此方法的主要 限制是低灵敏度 (10nM)。为了增加灵敏度， 开发了 DNA 条形码扩增和其他光学信号放大 技术如 scanometric 法和表面增强拉曼光谱法 (Taton， T.A. ； Mirkin， C.A. ； Letsinger， R.L.Science 2000， 289， 1757.(b)Cao， Y.W. ； Jin， R.C ； Mirkin， C.A.Science 2002， 297， 1536.) 来将检测极限改善至飞摩尔 (femtomolar) 和渺摩尔 (attomolar) 范围。 然而， 所有 这些放大法均涉及复杂的多步步骤， 其不仅耗时而且还常引起再现性的问题。
在此工作中， 本发明人将本发明应用于 DNA 检测。如在图 16 中所图解的， 将两组 单链 DNA 探针功能化在柠檬酸盐保护的金纳米粒子 (DNA1-AuNP 和 DNA2-AuNP) 上。当两种 DNA 功能化的 AuNP 探针在含有互补的靶 DNA 的样品溶液中混合时， 靶 DNA 与两种纳米粒子 探针的杂交将导致纳米粒子形成二聚体、 三聚体和更大的聚集体。这种纳米粒子聚集将增
加整个纳米粒子群体的平均直径， 其可以通过 DLS 分析来检测。然后可以将纳米粒子的平 均直径增加与靶 DNA 浓度定量地相关联。如图 16 中所示， 较高的靶 DNA 浓度应导致更大范 围的纳米粒子聚集和更大的平均纳米粒子粒度增加。
在此工作中， 本发明人根据报道的步骤合成了柠檬酸盐稳定的具有 30nm 的核 心 直 径 的 金 纳 米 粒 子 (Turkevich， J. ； Stevenson， P.C ； Hillier， J.Discuss.Faraday Soc.1951， 11， 55.)。将先前用于 Mirkin 等人的工作中的两种 DNA 探针与金纳米粒子轭合 (Jin， R. ； Wu， G. ； Li， Z. ； Mirkin， C.A. ； 和 Schatz， G.C.J.Am.Chem.Soc.2003， 125， 1643. Stoeva， S.I. ； Lee， J.S. ； Thaxton， C.S. ；和 Mirkin， C.A.Angew.Chem.Int.Ed.2006， 45， 3303)。 图 17a 是 AuNP 探针在与 DNA 探针轭合之前和之后的 UV-Vis 吸收谱。 AuNP 溶液开始 为粉红色， SPR 带在 520nm。在单链 DNA 的功能化之后， SPR 带保持在 520nm， 表明由于与单 链 DNA 轭合之后在纳米粒子之间的互斥作用增加而没有粒子聚集。使用 DLS 测量来监测与 两种 DNA 探针轭合前后 AuNP 的粒度改变。如图 17b 中所示， 对于 DNA1-AuNP 和 DNA2-AuNP， 纳米粒子的流体动力学直径由 29.0nm 分别略增至 34.4nm 和 38.2nm。 这种流体动力学直径 改变是由在纳米粒子表面上添加 DNA 层而引起的。DLS 数据还揭示了 DNA 修饰之前和之后 AuNP 的非常窄的粒度分布。UV-Vis 吸收和 DLS 测量均表明 DNA-AuNP 探针仍然单独分散在 溶液中。
对于靶 DNA 检测， 将浓度为 100pM 的两种 DNA-AuNP 探针的 1 ∶ 1 混合溶液添加到 浓度范围在 5pM 至 5nM 的一组靶 DNA 溶液中。使用 UV-Vis 吸收谱确定了 DNA-AuNP 探针的 浓度。在 70℃下将混合的溶液孵育 5min， 然后使其冷却至室温并静置 2 小时。然后将溶液 稀释 100 倍以供 DLS 测量 (DLS 样品池需要 1-1.5mL 样品溶液 )。 如图 18a 中所示， 溶液中具 有 0M 靶 DNA 的对照样品中金纳米粒子的平均粒度为约 35.2nm。在含有 5pM 靶 DNA 的样品 溶液中， 平均纳米粒子粒度增加至 40.6nm。整个纳米粒子群现在含有单独分散的 DNA-AuNP 探针， 由于 DNA 靶标与 DNA 探针杂交而形成的纳米粒子二聚体、 三聚体和低聚体。 随着靶 DNA 浓度的增加， 平均纳米粒子流体动力学直径相应地增加。图 19 是靶 DNA 浓度从 5pM 至 5nM 时的粒度的曲线。估计检测极限为约 1pM。不进行任何优化， 此检测极限已高于先前所报 道的基于吸收的方法 4 个数量级 (Elghanian， R. ； Storhoff， J.J. ； Mucic， R.C ； Letsinger， R.L. ； Mirkin， C.A.Science 1997， 277， 1078.)。如从各浓度的小标准偏差 ( 每个浓度运行 三个样品 ) 和测定的良好线性所判断的， 该测定表现出优异的再现性 ( 参见图 19 中的插 图 )。
为了考察新测定的选择性， 本发明人对来自完美匹配的 DNA 靶标的单碱基对错配 的 DNA 进行了比较研究。研究了两种类型的错配的 DNA 靶标 ： 一个具有位于靶 DNA 序列末 端的错配对， 而一个具有位于靶 DNA 序列中间的错配对 ( 错配的序列显示在发明人的论文 的补充信息中， Huo Q.， 等人 J.Am.Chem.Soc.2008， 130， 8138-8139)。在严格相同的测定条 件下， DLS 分析揭示了在靶 DNA 具有单错配的碱基对时纳米粒子聚集程度小得多， 这是从 图 18b 所示的纳米粒子的流体动力学直径所判断的。这种单碱基对错配研究是在 10pM 的 靶 DNA 浓度下进行的。结果证明我们的新测定在不使用先前报道的方法 (Elghanian， R. ； Storhoff， J.J. ； Mucic， R.C. ； Letsinger， R.L. ； Mirkin， C.A.Science 1997， 277， 1078.) 所 需的 DNA- 纳米粒子聚集体熔化转变的条件下区分单碱基对错配的 DNA 与完美匹配的靶 DNA 的能力。总之， 本发明人证明了基于本发明的用于 DNA 检测的一步式均相杂交测定。该测 定极易实施， 提供与基于吸收的方法相比高得多的灵敏度， 然而却没有任何信号放大过程。 可以在环境条件下从 DLS 分析直接容易地区分单碱基对错配的 DNA 与完美互补的 DNA。
实施例 7
DLS 系统
图 2 显示用于手动地一次一个样品地确定分析物的存在的根据本发明的基本 DLS 系统 200。系统 200 包括由光学上透明的材料形成的容器 / 池 204， 其用于容纳怀疑含有至 少一种靶分析物的样品溶液和与受体轭合的相同的或两种不同的纳米探针。 受体可以是相 同的或不同的。诸如激光器 210 的光源将具有合适波长的光 ( 例如， 紫外光、 可见光、 近红 外光或红外光 ) 导向装在容器 / 池 204 中的包含分析物的溶液。可以使用或不使用衰减器 217 来调节来自激光器 210 的入射激光束的强度。 提供至少一个检测器如检测器 211 和 212 来测量来自包含分析物的溶液的散射光信号。检测器可以相对于入射激光束以 0 至 180 度 角的不同角度放置， 在更具体的实施方式中， 所述角度为 0-90 度。在一个实施方式中， 所检 测的分析物不包括 DNA， 或者如果 DNA 是靶分析物， 则检测器相对于激光必须为 0-90 度之 间。在不同的检测器角度， 测定的灵敏度可能不同。应选择最佳检测器角度来最灵敏地检 测纳米粒子聚集体。一个实例为 13 度的前向角 (forward angle)。依据所用的金属粒子的 类型和测定形式， 还可以使用其他角。可以使用多于 1 个检测器来同时分析多个样品。来 自检测器 211 和 212 的输出显示为与相关器或其他类型的处理器 221 偶联， 所述相关器或 其他类型的处理器 221 与计算机 230 相连， 计算机 230 使用相关软件并可进行操作以用于 由相关函数确定粒子扩散系数和 / 或粒度和 / 或粒度分布。数据收集、 处理、 分析和显示将 由计算机 230 控制。计算机软件将把 DLS 数据转化成分析物浓度信息。测定溶液的 DLS 数 据与分析物浓度之间存在线性相关或非线性相关。 绝对分析物浓度可以通过与使用已知浓 度的标准分析物溶液获得的校准曲线比较来确定。 当标准分析物溶液不可用或不必获得绝 对分析物浓度时， 可以直接使用纳米粒子扩散系数、 粒度和 / 或粒度分布数据来从不同样 品获得相对分析物水平。
在其他更具体的实施方式中， 本发明涉及尤其适于通过自动控制来同时或顺序进 行多个样品的测定实施方式的 DLS 系统。具有两种不同设置的这种适合的 DLS 系统的实例 在图 3 中图解。第一种设置用于一次分析一个样品溶液 ( 图 3c) 并且第二种设置用于同时 测量多个样品 ( 意味着多于一个样品 )( 图 3a 和 3b)。除了图 2 中所示的基本 DLS 所需的 组件之外， 这种修改的系统 300 含有下列另外的部件 / 组件 ： (1) 激光束 312， 其可以分裂为 多个束 ( 或多个激光 ) 以作为用于多种测定溶液 316 的入射光束 322， 并由此产生散射光 信号 322 ； (2) 可移动的平台 318， 如圆盘传送带， 其可支持一个或多于一个测定溶液容器。 图 3 图解圆盘传送带 318 的实例， 其具有 12 个测定溶液容器 316 或池支架， 其中含有测定 溶液的池可手动或自动地加载到该支架上。圆盘传送带 318 可以是独立装置。将圆盘传送 带 318 手动或自动地插入 DLS 主系统中。如图 3b 所图解， 圆盘传送带还可以在平面内旋转 (326)。系统 300 可以任选地包括液体处理系统 324 以用于向池中递送流体和 / 或从池中 移出流体。
一般地， DLS 配备有单个或多个检测器。检测器的数目可以与圆盘传送带中的样 品溶液容器的数目匹配。检测器的数目可以小于圆盘传送带中的样品溶液容器的数目。每个检测器将检测来自一个样品溶液的散射光信号。可以通过同一处理器 ( 如相关器 ) 顺序 处理或多个处理器同时处理从每个检测器收集的数据以获得各测定溶液的相关函数。 作为 实例， 图 3 图解了可以使用一个激光光源和 12 个检测器同时分析 12 个样品。可选择地， 一 次可以仅打开一个检测器， 加载一个样品到圆盘传送带。 通过旋转圆盘传送带， 使用者可以 连续加载新样品并从圆盘传动带中卸载分析样品以便可以顺序分析多个样品。图 3 仅为示 例。还可以采用基于样品概念的其他设置。例如， 圆盘传送带可以含有任何数目的样品溶 液容器或池支架而非 12 个。可以用装置中嵌入有样品溶液容器的微流装置代替圆盘传送 带。还可以用不具有图 3 所显示的圆形形状但与圆盘传送带功能相同的装置来代替圆盘传 送带。可以将如上文所讨论的不同模式 ( 使用单个检测器或同时使用多个检测器的固定圆 盘传送带与可旋转圆盘传送带 ) 组合在一起以加速测定并减少花费。
图 3c 中显示的是替代性实施方式， 其降低了所需的 DLS 检测器的量， 但还允许使 用者能够方便地操作样品以将其放入和移出可移动平台。系统 350 包括具有至少第一容器 354 和第二容器 356 的可移动平台 355。可移动平台 355 可以将容器 354、 356 的一个或另 一个由加载区 357 移至检测区 359。光源 351 发送入射光束 358 到检测区 359 中的容器从 而产生散射光信号 360。检测器 361 检测散射光信号以用于计算机的进一步处理。
对于两种 DLS 系统， 都将使用计算机软件来进行以下控制 ： 液体混合、 样品加载和 卸载以及 DLS 测量 ； 将散射光强度数据处理为相关函数 ； 将相关函数数据处理为粒子扩散 系数、 粒度和 / 或粒度分布信息 ； 并使用和不使用校准曲线来将这信息处理为分析物浓度 ( 包括相对浓度或绝对浓度 )。校准曲线通过测定具有已知分析物浓度的一系列标准样品 溶液来确立。通常， 从未知样品溶液获得的 DLS 数据与校准曲线的比较将揭示未知样品中 的分析物浓度。
如本领域的技术人员所理解， 本发明的实施方式可以被具体化为包括处理模块和 / 或含有至少一个程序编码模块的计算机程序产品在内的装置或系统。因此， 本发明可以 采取完全为硬件的实施方式形式或组合了软件和硬件方面的实施方式形式。此外， 本发明 可以包括在计算机可用存储介质上的计算机程序产品， 所述计算机可用存储介质在该介质 中收录有计算机可用的程序编码工具。可以使用任何合适的计算机可读介质， 包括硬盘、 CD-ROM、 DVD、 光存储装置或磁存储装置。
术语 “处理模块” 可以包括单个处理装置或多个处理装置。 这种处理装置可以是微 处理器、 微控制器、 数字信号处理器、 微型计算机、 中央处理单元、 现场可编程门阵列 (field programmable gate array)、 可编程逻辑装置、 状态机、 逻辑电路、 模拟电路、 数字电路和 / 或根据操作指令处理信号 ( 模拟的和 / 或数字的 ) 的任何装置。处理模块可以具有可操作 地偶联在其上的或与其整合的存储装置。存储装置可以是单个存储装置或多个存储装置。 这种存储装置可以是只读存储器、 随机存取存储器、 易失存储器、 非易失存储器、 静态存储 器、 动态存储器、 闪速存储器和 / 或储存数字信息的任何装置。如本文所用的计算机是包括 至少一个处理模块和任选地至少一个存储装置在内的装置。
计算机可用介质或计算机可读介质可以是或者包括但不限于例如， 电子的、 磁的、 光的、 电磁的、 红外的或半导体的系统、 设备、 装置或传播介质。 计算机可读介质的更具体实 例 ( 非详尽列表 ) 将包括下列 ： 具有一根或多根电线的电连接、 便携式计算机磁盘、 随机存 取存储器 (RAM)、 只读存储器 (ROM)、 可擦除可编程只读存储器 (EPROM 或闪速存储器 )、 光纤和便携式光盘只读存储器 (CD-ROM)、 CD ROM、 DVD( 数字视频光盘 ) 或其他电子存储介质。 注意计算机可用介质或计算机可读介质甚至可以是纸或上面印有程序的另一合适介质， 因 为程序可以经由例如纸或其他介质的光扫描而被电子捕获， 然后被编译、 译码或若需要的 话以合适的方式另外处理， 然后被储存在计算机存储器中。
进行本发明的某些实施方式的操作的计算机程序代码可以用包括但不限于下列 的面向对象编程语言和 / 或传统程序编程语言来书写 ： Java、 Smalltalk、 Perl、 Python、 Ruby、 Lisp、 PHP、″ C″、 FORTRAN 或 C++。程序代码可以如下执行 ： 全部在用户计算机上、 部分在用户计算机上、 作为单机软件包、 部分在用户计算机上且部分在远程计算机上或者 全部在远程计算机上。 在后一种情况中， 远程计算机可以通过局域网 (LAN) 或广域网 (WAN) 与用户计算机连接， 或者可以与外部计算机连接 ( 例如， 通过使用互联网服务提供商的互 联网 )。
应理解本文所述的 DLS 系统的功能可以通过计算机可读程序编码模块实施。可以 将这些程序编码模块提供给一般目的的计算机、 特殊目的的计算机、 嵌入式处理器或其他 可编程数据处理设备的处理模块以制造机器， 以使得经由计算机的所述处理模块或其他可 编程数据处理设备来执行的程序编码模块产生用于实施流程图和 / 或方框图的方框中所 指明的功能的工具。
这些计算机程序编码模块还可被储存在可以指导计算机或其他可编程数据处理 设备以特定方式运行的计算机可读存储器中以使储存在计算机可读存储器中的程序编码 模块产生制品。
还可以将计算机程序编码模块加载到计算机或其他可编程数据处理设备上以使 得在计算机或其他可编程设备上进行一系列操作步骤而产生计算机执行的过程以使得计 算机或其他可编程设备上所执行的指令提供用于实施流程图和 / 或方框图方框中所指明 的功能的步骤。
本发明可以在不背离其精神或本质属性的条件下以其他形式来实施， 因此应当参 考下列权利要求而非上述说明书来指明本发明的范围。
所引用的所有参考文献的公开内容均以不与本文的教导矛盾的程度整体并入本 文。20101978254 A CN 101978259
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