动物源性食品中重氮氨苯脒免疫学快速检测方法 【技术领域】
本发明涉及动物源性食品中药物残留的检测方法，具体是一种动物源性食品中重氮氨苯脒免疫学快速检测方法。
背景技术
重氮氨苯脒(Diminazene)，是一种抗寄生虫药物，该药早在1994年6月已经被FAO/WHO列入需要检测残留的兽药列表中，我国农业部于2002年12月24日发布《第235号公告》，规定了该药的最高残留限量(同FAO/WHO)；同时，该药已被列入日本兽药残留“肯定列表”中。
重氮氨苯脒的检测目前已经有薄层色谱方法、高效液相色谱方法等方法进行检测，在样品的确证分析中有较好的检测效果，但同时需要配备价格昂贵的仪器并优化各种药物测定参数，操作较为复杂，且这些方法或者需要时间长、价格贵，灵敏度低，或者样品处理工作量大，或者废弃物处理困难，不太适合基层对大量样品的快速检验。免疫学快速检测(ELISA)法检测重氮氨苯脒目前国内外未见报道。
【发明内容】
本发明所要解决的技术问题是，提供一种操作简便、测量准确、灵敏度高、成本低廉的动物源性食品中重氮氨苯脒免疫学快速检测方法。
本发明的方法包括以下步骤：
a.将牛奶或者动物的肉类或内脏样品制备成用于检测的样液；
其中牛奶样液的制备方法是：将牛奶样品置于离心管中，在4℃下15000转/分钟离心10分钟，取上清液，即为样液；
动物肉类或内脏样液的制备方法是：将动物肉类或内脏样品充分磨细备用，在1重量份磨细的样品中加入2重量份体积浓度5％的甲醇0.01moL/L PH6.74PBS溶液，然后超声提取15分钟，在4℃下4000转/分钟离心10分钟，取上清液；同法再对残渣进行一次提取，合并两次提取液，置于容器中；将装有提取液的容器置于100℃水浴中煮沸1分钟，过滤后用体积浓度5％的甲醇0.01moL/L PH6.74PBS溶液定容至10重量份作为样液；
b.制备抗血清，其方法依次经过以下步骤：(1)制备重氮氨苯脒基础反应液体，其步骤是将0.05重量份重氮氨苯脒溶于2重量份蒸馏水获得的重氮氨苯脒溶液、1重量份盐酸1moL/L、0.05重量份硝酸钠溶于2重量份蒸馏水获得的溶液在室温下搅拌反应1h后，加入0.02重量份氨基磺酸铵溶于200重量份蒸馏水而获得的氨基磺酸铵溶液，反应10min终止反应，获得重氮氨苯脒基础反应液体；(2)将0.05重量份牛血清白蛋白溶于2重量份0.1moL/L PH9.1碳酸盐缓冲液获得的溶液加入前一步骤获得的所有重氮氨苯脒基础反应液体，再加入3moL/L的NaOH调节PH值至7.5-8左右，室温搅拌12h；(3)将前一步骤获得的反应液10000转/分钟离心10分钟；上清液用蒸馏水4℃透析6次，每次8小时；过G50柱；用聚乙二醇2000浓缩至过柱前体积；紫外可见光分光分度计扫描后，作为免疫原；(4)选用临床健康，体重1.5-2kg的新西兰雄性兔，注射上述免疫原；第一次免疫用1重量份弗氏完全佐剂加1重量份免疫原皮下或皮内多点注射，此后每间隔四周用1重量份弗氏不完全佐剂加1重量份免疫原皮下或皮内多点注射，前后共5次，最后一次免疫后10天宰杀，采血，分离血清；
c.制备已包被的酶标条，制备方法依次经过以下步骤：(1)包被抗原的制备，方法是，取0.05重量份重氮氨苯脒溶于1重量份蒸馏水获得的重氮氨苯脒溶液、0.025重量份卵清白蛋白溶于0.5重量份蒸馏水获得的卵清白蛋白溶液、0.025重量份碳二亚胺盐酸盐溶于0.5重量份蒸馏水获得的碳二亚胺盐酸盐溶液、0.0025重量份N-羟基琥珀酰亚胺溶于0.1重量份二甲亚枫获得的N-羟基琥珀酰亚胺溶液；室温搅拌反应12h后，将反应液10000转/分钟离心10分钟；上清液样用蒸馏水4℃透析6次，每次8小时；过G25柱，用聚乙二醇2000浓缩调整至过柱前体积，作为包被抗原；(2)酶标条的包被处理，方法是：取空白酶标条，每孔加入包被抗原与0.1moL/L PH9.1碳酸盐缓冲液体积比为1∶400的包被抗原溶液0.1体积份，置4℃12h或置37℃2h，用0.01moL/LPH6.74PBST洗涤液清洗三次，每次三分钟，甩干拍净后，加入0.2体积份1mg/mL的卵清白蛋白0.01moL/L PH6.74PBS溶液，37℃湿盒内反应0.5h后甩干拍净。
d.对样液进行检测，其方法是：吸取0.1重量份样液加入到空白的酶标条中，再加入0.1重量份抗血清与0.01moL/L PH6.74PBS重量比为1∶1500的溶液，振荡混和均匀后置37℃湿盒放置30min，然后在上述已包被的酶标条中每孔加入0.1重量份反应液，37℃湿盒内反应1.5h后，每孔加0.2重量份PBST清洗3次，每次间隔3分钟；再每孔加入羊抗兔HRP-IgG与0.01moL/L PH6.74PBS重量比为1∶5000的溶液0.1重量份，置37℃反应1h后拍干洗净；然后加入0.1重量份1mg/mL四甲基邻苯氨(TMB)的二甲基亚枫溶液，于37℃湿盒反应10min分钟，再加0.05重量份的2moL/L硫酸终止液静置5min后，在酶联免疫检测仪上读取吸光度值(OD值)；依据标准浓度重氮氨苯脒吸光度值(OD值)的梯度变化，绘制重氮氨苯脒抑制标准曲线；每个样品做4孔，按logit-log法作图，计算重氮氨苯脒含量；根据各孔的值进行数理统计，求其平均值，如果样品为牛奶，则可直接作为检测结果，如果样品为动物肉类或内脏，则需将平均值扩大10倍后作为检测结果。
本发明的有益效果体现在：
1.该方法检测线性范围为500ng-4.2ng/g(ml)，检测底线为4.2ng/ml，，线性相关系数大于0.99，该方法的重复性测定的变异系数为5.7％，该方法除对结构相似的戊烷脒有50％的交叉反应，对其他4种结构和功能相似的物质基本无交叉反应。
2.试验筛选出牛奶、牛肉、牛肾、牛肝以及猪肉中重氮氨苯脒的简便样品前处理方法，基本消除基质影响，有利于基层单位的使用。
3.操作简便，2-3小时即可完成20-30份样品的测定，大大提高检测效率。
4.该方法检测牛奶平均回收率为89％、牛肉平均回收率为82％、牛肾平均回收率为77％。牛肝平均回收率为88％、猪肉平均回收率为90％.
5.该方法在37℃稳定放置7天，4℃放置3个月后，线性关系良好，有利于试剂盒的运输、携带和、贮存。
【具体实施方式】
本发明的实施例包括以下步骤：
a.将牛奶或者动物的肉类或内脏样品制备成用于检测的样液；
其中牛奶样液的制备方法是：将牛奶样品置于离心管中，在4℃下15000转/分钟离心10分钟，取上清液，即为样液；
动物肉类或内脏样液的制备方法是：将动物肉类或内脏样品充分磨细备用，在1重量份磨细的样品中加入2重量份体积浓度5％的甲醇0.01moL/L PH6.74PBS溶液，然后超声提取15分钟，在4℃下4000转/分钟离心10分钟，取上清液；同法再对残渣进行一次提取，合并两次提取液，置于容器中；将装有提取液的容器置于100℃水浴中煮沸1分钟，过滤后用体积浓度5％的甲醇0.01moL/L PH6.74PBS溶液定容至10重量份作为样液；
b.制备抗血清，其方法依次经过以下步骤：(1)制备重氮氨苯脒基础反应液体，其步骤是将0.05重量份重氮氨苯脒溶于2重量份蒸馏水获得的重氮氨苯脒溶液、1重量份盐酸1moL/L、0.05重量份硝酸钠溶于2重量份蒸馏水获得的溶液在室温下搅拌反应1h后，加入0.02重量份氨基磺酸铵溶于200重量份蒸馏水而获得的氨基磺酸铵溶液，反应10min终止反应，获得重氮氨苯脒基础反应液体；(2)将0.05重量份牛血清白蛋白溶于2重量份0.1moL/L PH9.1碳酸盐缓冲液获得的溶液加入前一步骤获得的所有重氮氨苯脒基础反应液体，再加入3moL/L的NaOH调节PH值至7.5-8左右，室温搅拌12h；(3)将前一步骤获得的反应液10000转/分钟离心10分钟；上清液用蒸馏水4℃透析6次，每次8小时；过G50柱；用聚乙二醇2000浓缩至过柱前体积；紫外可见光分光分度计扫描后，作为免疫原；(4)选用临床健康，体重1.5-2kg的新西兰雄性兔，注射上述免疫原；第一次免疫用1重量份弗氏完全佐剂加1重量份免疫原皮下或皮内多点注射，此后每间隔四周用1重量份弗氏不完全佐剂加1重量份免疫原皮下或皮内多点注射，前后共5次，最后一次免疫后10天宰杀，采血，分离血清；
c.制备已包被的酶标条，制备方法依次经过以下步骤：(1)包被抗原的制备，方法是，取0.05重量份重氮氨苯脒溶于1重量份蒸馏水获得的重氮氨苯脒溶液、0.025重量份卵清白蛋白溶于0.5重量份蒸馏水获得的卵清白蛋白溶液、0.025重量份碳二亚铵溶于0.5重量份蒸馏水获得的碳二亚铵溶液、0.0025重量份N-羟基琥珀酰亚胺溶于0.1重量份二甲亚枫获得的N-羟基琥珀酰亚胺溶液；室温搅拌反应12h后，将反应液10000转/分钟离心10分钟；上清液样用蒸馏水4℃透析6次，每次8小时；过G25柱，用聚乙二醇2000浓缩至过柱前体积，作为包被抗原；(2)酶标条的包被处理，方法是，取空白酶标条，每孔加入包被抗原与0.1moL/L PH9.1碳酸盐缓冲液重量比为1∶400的包被抗原溶液0.1重量份，置4℃12h或置37℃2h，用0.01moL/L PH6.74PBST洗涤液清洗三次，每次三分钟，甩干拍净后，加入0.2体积份1mg/mL的卵清白蛋白0.01moL/L PH6.74PBS溶液，37℃湿盒内反应0.5h后甩干拍净。
d.对样液进行检测，其方法是：吸取0.1重量份样液加入到空白的酶标条中，再加入0.1重量份抗血清与0.01moL/L PH6.74PBS重量比为1∶1500的溶液，振荡混和均匀后置37℃湿盒放置30min，然后在上述已包被的酶标条中每孔加入0.1重量份反应液，37℃湿盒内反应1.5h后，每孔加0.2重量份PBST清洗3次，每次间隔3分钟；再每孔加入羊抗兔HRP-IgG与0.01moL/LPH6.74PBS重量比为1∶5000的溶液0.1重量份，置37℃反应1h后拍干洗净；然后加入0.1重量份1mg/mL四甲基邻苯氨(TMB)的二甲基亚枫溶液，于37℃湿盒反应10min分钟，再加0.05重量份的2moL/L硫酸终止液静置5min后，在酶联免疫检测仪上读取吸光度值(OD值)；依据标准浓度重氮氨苯脒吸光度值(OD值)的梯度变化，绘制重氮氨苯脒抑制标准曲线；每个样品做4孔，按logit-log法作图，计算重氮氨苯脒含量；根据各孔的值进行数理统计，取其平均值，如果样品为牛奶，则可直接作为检测结果，如果样品为动物肉类或内脏，则需将平均值扩大10倍后作为检测结果。