一种测定制浆黑液还原糖含量的方法.pdf

摘要
申请专利号：	CN201010279985.8	申请日：	2010.09.11
公开号：	CN101963578A	公开日：	2011.02.02
当前法律状态：	撤回	有效性：	无权
法律详情：	发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):G01N 21/31申请公布日:20110202\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):G01N 21/31申请日:20100911\|\|\|公开
IPC分类号：	G01N21/31; G01N1/28; G01N1/34; G01J3/427	主分类号：	G01N21/31
申请人：	大连工业大学
发明人：	鲁杰; 杨瑞丰; 卜令习
地址：	116034 辽宁省大连市甘井子区轻工苑1号
优先权：
专利代理机构：	大连东方专利代理有限责任公司 21212	代理人：	毕进
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内容摘要

本发明提供一种采用3，5-二硝基水杨酸双波长分光光度法测定制浆黑液中还原糖含量的方法。本发明能排除黑液中木素对还原糖含量测定的影响。通过对木素与葡萄糖在3，5-二硝基水杨酸溶液中紫外-可见特定波长区域吸收谱图的分析，结合木素和葡萄糖各波长处吸光度值与浓度比例系数的对比值，确定了测试适宜波长。通过对木素DNS溶液在520nm和570nm吸光度值与木素浓度关系曲线，确定双波长差示信号放大系数。木素葡萄糖溶液差示信号与浓度之间比例系数与未加木素的葡萄糖溶液比例系数之间校正系数为k＝1.2。本发明能反映酶解过程中黑液中还原糖含量变化；测定加入葡萄糖的酶解后黑液中还原糖含量，具有较好的稳定性，测定结果较理想。

权利要求书

1：一种测定制浆黑液还原糖含量的方法，其特征在于按以下步骤进行操作：第一步、 3， 5- 二硝基水杨酸溶液配制，称取 6.3g 3， 5- 二硝基水杨酸和 262ml2mol· l-1 氢氧化钠溶液加入酒石酸钾钠热溶液中，再加 5g 结晶酚和 5g 亚硫酸钠搅拌溶解，冷却后定容至 1000ml，储存于棕色瓶，放置 72h 后使用；第二步、木素的提取，取一定量的碱法蒸煮黑液，用稀硫酸调节溶液至 pH6，离心分离，取上层液体，再用稀硫酸调至 pH 3，再离心分离，取出沉淀物，并用稀硫酸洗涤，然后离心，重复操作 2 ～ 3 次，取离心后沉淀物置于 80℃真空干燥箱烘干，用研钵研碎，制得粗木素；第三步、木素的提纯，将粗木素溶于 140ml 吡啶 - 醋酸 - 水体系中，用 180ml 氯仿萃取，静置 4h 分层后摇荡，再次分层后，分出下层溶有木素的有机层；上层溶液中加入 150ml 氯仿再次萃取，摇荡后静置，待分层后分离出下层的有机层；合并两次有机层萃取液，在旋转真空蒸发器中浓缩至 95 ～ 105ml，移至 1000ml 无水乙醚中，搅拌使析出沉淀，将沉淀用乙醚洗涤，至无吡啶味为止，置于 P2O5 的真空干燥器中干燥，得到浅灰色精制木素；第四步、葡萄糖及木素标准溶液配制，定量称取分析纯葡萄糖，用 pH 4.8 的醋酸 - 醋酸钠缓冲液配制成 1g/L 葡萄糖标准溶液；准确称取精制木素，配制成 0.05g/ml 木素的 3， 5- 二硝基水杨酸溶液，然后用去离子水定容，得 0.01g/ml 木素标准溶液；第五步、放大系数的确定，通过测定不同木素含量 3， 5- 二硝基水杨酸溶液在波长 520nm 和 570nm 处吸光度值，得到木素标准液用量与两波长处吸光度关系曲线，其线性关系方程分别为 A520 木素＝ ε520 木素 c 木素 +N1 木素， A570 木素＝ ε570 木素 c 木素 +N2 木素；通过测定不同葡萄糖含量 3， 5- 二硝基水杨酸溶液在波长 520nm 和 570nm 处吸光度值，得到葡萄糖标准液用量与两波长处吸光度关系曲线图，其线性方程分别为 A520 葡萄糖＝ ε520 葡萄糖 c 葡萄糖 +N1 葡萄糖， A570 葡萄糖＝ ε570 葡萄糖 c 葡萄糖 +N2 葡萄糖，得到差示信号 S0 ＝ K2(A520 木素 +A520 葡萄糖 )-K1(A570 木素 +A570 葡萄糖 ) ＝ (ε570 木素 ε520 葡萄糖 -ε570 葡萄糖 ε520 木素 )c 葡萄糖 +N0 ；第六步、双波长测定黑液中还原糖含量计算公式的确定，通过计算得到各编号葡萄糖溶液差示信号值 S1，作图得到差示信号 S1 与葡萄糖浓度关系标准曲线，由标准曲线线性计算公式可以近似得到差示信号与葡萄糖含量关系式： S1 ＝ ε1c 葡萄糖 +N1，测定一组即含葡萄糖又含木素的 DNS 溶液 520nm 和 570nm 处吸光度值，并计算出各编号溶液差示信号值 S2，得到混合液差示信号与葡萄糖标准溶液关系曲线，得计算公式 S2 ＝ ε2c 葡萄糖 +N2，取校正系数 k ＝ ε2/ε1，经校正后差示信号与葡萄糖关系式为 S ＝ k·S2 ＝ εc 葡萄糖 +N，则可计算得到还原糖含量与差示信号间计算公式；第七步、黑液中还原糖含量测定，将黑液调 pH 值至 5，加入适量 pH4.8 醋酸 - 醋酸钠缓冲液，离心去除其中不溶物，取离心清液，稀释适当倍数，取其中 5ml 于预先加入 5ml pH4.8 醋酸 - 醋酸钠缓冲液， 3ml3， 5- 二硝基水杨酸溶液的比色管中，煮沸 5min 后迅速冷却后用去离子水定容至 25ml。以 3ml3， 5- 二硝基水杨酸溶液定容至 25ml 溶液为参比，测定溶液 520nm 及 570nm 处吸光度值，根据计算公式得到黑液中还原糖含量；其中，酒石酸钾钠溶液是由 182g 酒石酸钾钠溶于 500ml 去离子水配制而成的；吡啶 - 醋酸 - 水的体系组成为吡啶∶醋酸∶水的体积比为 9 ∶ 1 ∶ 4 ； N 为常数，分别为 N、 N0、 N1、 N2、 N1 木素、 N2 木素、 N1 葡萄糖、 N2 葡萄糖。

说明书

一种测定制浆黑液还原糖含量的方法
    技术领域本发明涉及造纸废水的处理及黑液资源综合利用技术领域，具体是利用双波长分光光度法测定黑液中还原糖工艺，主要应用于造纸废水处理及黑液综合利用过程中碳水化合物总量及降解后单糖的含量的测定。
     背景技术分光光度法具有操作简便，快速，灵敏度高，耗时短等特点，因此在还原糖的分析中占据相当重要的地位。其原理在于利用还原糖的还原末端与氧化剂发生反应产生高灵敏性发色基团或消耗带有发色基团的氧化剂而达到检测目的。已报道的方法有传统的 Somogyi-Nelson 法， DNS 法，铁氰化物和 BCA 法，以及新涌现的 MBTH 法，甲胺法。DNS 法是目前采用较多的方法，它是利用 DNS 在高温条件下与还原糖的还原末端反应生成有色复合物进行还原糖定量的。
     制浆蒸煮黑液中的固形物组成比较复杂，一般有机物含量占 70％左右，无机物为 30％左右。有机物中木素含量占 40％左右，挥发性有机酸占 8％～ 17％，同时还含有一定量的半纤维素、以及少量悬浮在溶液中的小纤维等。在研究中，常将半纤维素及小纤维降解成还原性单糖，然后对其进行研究。而测定黑液中还原糖含量都很难排除其他物质的干扰，尤其是黑液中的木素的干扰。
     双波长分光光度法具有准确度和精密度好，灵敏度高，多组分同时测定等优点，因此，本研究对双波长分光光度法对黑液中还原糖进行测试方法进行探索。
     发明内容
     采用 DNS(3， 5- 二硝基水杨酸 ) 双波长分光光度法测定制浆黑液中还原糖的含量是该发明的主要探讨内容。制浆黑液中由于木素的存在，对还原糖含量的测定产生一定干扰。双波长分光光度法能排除黑液中木素对还原糖含量测定的影响。通过对木素 DNS 溶液及葡萄糖 DNS 溶液紫外 - 可见特定波长区域吸收谱图的分析，结合木素和葡萄糖各波长处吸光度值与浓度比例系数的对比值，确定了测试适宜波长为 520nm 和 570nm。在作图分析及计算基础得到黑液中还原糖含量测定计算公式。对酶解后黑液中还原糖含量测定，发现该方法能反映酶解过程中黑液中还原糖含量变化；测定加入葡萄糖的酶解后黑液中还原糖含量，发现该方法具有较好的稳定性，测定结果比较理想。
     具体操作方法如下：
     第一步、 DNS(3， 5- 二硝基水杨酸 ) 溶液配制，称取 6.3g 3， 5- 二硝基水杨酸和 -1 262ml 2mol·l 氢氧化钠溶液加入酒石酸钾钠热溶液中 (182g 酒石酸钾钠溶于 500ml 去离子水 )，再加 5g 结晶酚和 5g 亚硫酸钠搅拌溶解，冷却后定容至 1000ml，储存于棕色瓶，放置 72h 后使用；
     第二步、木素的提取，取一定量的碱法蒸煮黑液，用稀硫酸调节溶液至 pH6，离心分离，取上层液体，再用稀硫酸调至 pH 3，再离心分离，取出沉淀物，并用稀硫酸洗涤，然后离心，重复操作 2 ～ 3 次，取离心后沉淀物置于 80℃真空干燥箱烘干，用研钵研碎，制得粗木素；
     第三步、木素的提纯
     将粗木素溶于 140ml 吡啶 - 醋酸 - 水 ( 体积比 9 ∶ 1 ∶ 4) 体系中，用 180ml CHCl3 萃取，静置 4h 分层后摇荡，再次分层后，分出下层溶有木素的有机层。上层溶液中加入 150ml CHCl3 再次萃取，摇荡后静置，待分层后分离出下层的有机层。合并两次萃取液，在旋转真空蒸发器中浓缩至大约 100ml，移至 1000ml 无水乙醚中，在搅动下沉淀出木素来，将沉淀出的木素用乙醚洗涤，至无吡啶味为止。置于 P2O5 的真空干燥器中干燥，得到浅灰色精制木素；
     第四步、葡萄糖及木素标准溶液配制
     准确称取 1.0000g 分析纯葡萄糖，溶解于 pH 4.8 的 HAc-NaAc 缓冲液中，然后用 pH 4.8 的 HAc-NaAc 缓冲液定容至 1L，即得 1g/l 葡萄糖标准溶液 (Glc 标准溶液 ) ；准确称取 5.0000g 提纯后木素，溶解于 100ml DNS 溶液中，然后用去离子水定容至 500ml，得木素标准溶液；
     第五步、放大系数的确定
     在该实验中，木素作为干扰相，在双波长测试中要消除其干扰，就要确定差示信号计算公式中 K2 ∶ K1 ＝ ε520 木素∶ ε570 木素。测定不同木素含量 DNS 溶液在波长 520nm 和 570nm 处吸光度值，得到木素标准液用量与两波长处吸光度关系曲线。木素 520nm 处吸光度标准曲线与木素 570nm 处吸光度标准曲线线性关系方程可近似取 A520 木素＝ ε520 木素 c 木素 +N1 A570 木素＝ ε570 木素 c 木素 +N2 木素， (N1 木素、 N2 木素为常数 )，同时可以近似取两方程系数为木素木素，吸光度值与木素含量的比例系数，则有 K2 ∶ K1 ＝ ε570 木素∶ ε520 木素；同时测得不同葡萄糖含量 DNS 溶液在波长 520nm 和 570nm 处吸光度值，得到葡萄糖准液用量与两波长处吸光度关系曲线图。由标准曲线图及线性关系公式可以看出，葡萄糖含量与其在两波长下的吸光度值也有较好的线性相关性；由两线性方程可近似取 A520 葡萄糖＝ ε520 葡萄糖 c 葡萄糖 +N1 葡萄糖， A570 (N1 葡萄糖、 N2 葡萄糖为常数 )。则差示信号 S0 ＝ K2(A520 木素 +A520 葡葡萄糖＝ ε570 葡萄糖 c 葡萄糖 +N2 葡萄糖，萄糖 )-K1(A570 木素 +A570 葡萄糖 ) ＝ (ε570 木素 ε520 葡萄糖 -ε570 葡萄糖 ε520 木素 )c 葡萄糖 +N0(N0 为常数 ) ；
     第六步、双波长测定黑液中还原糖含量计算公式确定
     通过计算得到各编号葡萄糖溶液差示信号值 S1，作图得到差示信号 S1 与葡萄糖浓度关系标准曲线。由标准曲线线性计算公式可以近似得到差示信号与葡萄糖含量关系式： S1 ＝ ε1c 葡萄糖 +N1(N1 为常数 )。测试一组即含葡萄糖又含木素的 DNS 溶液 520nm 和 570nm 处吸光度值，并计算出各编号溶液差示信号值 S2，得到混合液差示信号与葡萄糖标准溶液关系曲线，得计算公式 S2 ＝ ε2c 葡萄糖 +N2(N2 为常数 )。所以取校正系数 k ＝ ε2/ε1，则经校正后差示信号与葡糖关系式为 S ＝ k·S2 ＝ εc 葡萄糖 +N(N 为常数 )。则可计算得到还原糖含量与差示信号间计算公式；
     第七步、黑液中还原糖含量测定
     将黑液调 pH 值至 5 左右，加入适量 pH4.8HAc-NaAc 缓冲液，离心去除其中不溶物，取离心清液，稀释适当倍数，取其中 5ml 于预先加入 5ml pH4.8HAc-NaAc 缓冲液， 3mlDNS 溶液的比色管中，煮沸 5min 后迅速冷却后用去离子水定容至 25ml。以 3mlDNS 溶液定容至 25ml 溶液为参比，测定溶液 520nm 及 570nm 处吸光度值，根据计算公式得到黑液中还原糖含量。附图说明图 1、木素吸光度标准曲线，可以根据此标准曲线得到双波长计算的比例系数，其中横坐标为木素标准溶液用量 ( 单位： ml)，纵坐标为吸光度值。
     图 2、葡萄糖吸光度标准曲线，可以根据该标准曲线，计算出双波长计算公式所用差示信号值，其中横坐标为葡萄糖标准溶液用量 ( 单位： ml)，纵坐标为吸光度值。
     图 3、葡萄糖溶液差示信号标准曲线。
     图 4、混合溶液差示信号标准曲线，根据两曲线对比可以确定计算公式中校正系数，其中，纵坐标为差示信号值，横坐标为葡萄糖标准溶液用量 ( 单位： ml)。
     图 5、不同用量复合酶酶解后黑液中还原糖含量。横坐标为酶用量 ( 单位： ml) ；纵坐标为酶解后还原糖量 ( 单位： g·l-1)。
     具体实施方式
     下面结合实施例对本发明作进一步说明。
     实施案例 1.
     用本方法对酶解后黑液中还原糖进行测定。
     具体操作方法如下：
     第一步、 DNS(3， 5- 二硝基水杨酸 ) 溶液配制：
     称取 6.3g DNS 和 262ml 2mol·l-1NaOH 溶液加入酒石酸钾钠热溶液中 (182g 酒石酸钾钠溶于 500ml 去离子水 )，再加 5g 结晶酚和 5g 亚硫酸钠搅拌溶解。冷却后定容至 1000ml，储存于棕色瓶，放置 72h 后使用；
     第二步、木素的提取：
     取一定量的碱法蒸煮黑液，用稀硫酸调节溶液至 pH 6，离心分离，取上层液体，再用稀硫酸调至 pH 3，再离心分离，取出沉淀物，并用稀硫酸洗涤，然后离心，重复操作 2 ～ 3 次，取离心后沉淀物置于 80℃真空干燥箱烘干，用研钵研碎，制得粗木素；
     第三步、木素的提纯：
     将粗木素溶于 140ml 吡啶 - 醋酸 - 水 ( 体积比 9 ∶ 1 ∶ 4) 体系中，用 180ml CHCl3 萃取，静置 4h 分层后摇荡，再次分层后，分出下层溶有木素的有机层。上层溶液中加入 150ml CHCl3 再次萃取，摇荡后静置，待分层后分离出下层的有机层。合并两次萃取液，在旋转真空蒸发器中浓缩至大约 100ml，移至 1000ml 无水乙醚中，在搅动下沉淀出木素来，将沉淀出的木素用乙醚洗涤，至无吡啶味为止。置于 P2O5 的真空干燥器中干燥，得到浅灰色精制木素；
     第四步、葡萄糖及木素标准溶液配制：
     准确称取 1.0000g 分析纯葡萄糖，溶解于 pH 4.8 的 HAc-NaAc 缓冲液中，然后用 pH 4.8 的 HAc-NaAc 缓冲液定容至 1L，即得 1g/l 葡萄糖标准溶液 (Glc 标准溶液 ) ；准确称取 5.0000g 提纯后木素，溶解于 100ml DNS 溶液中，然后用去离子水定容至 500ml，得木素标准溶液；
     第五步、放大系数的确定：
     在该实验中，木素作为干扰相，在双波长测试中要消除其干扰，就要确定差示信号计算公式中 K2 ∶ K1 ＝ ε520 木素∶ ε570 木素。测定不同木素含量 DNS 溶液在波长 520nm 和570nm 处吸光度值，得到木素标准液用量与两波长处吸光度关系曲线如图 1 所示。
     图 1 中两曲线为木素 520nm 处吸光度标准曲线与木素 570nm 处吸光度标准曲线。由图 1 两标准曲线及线性关系公式可以看出，木素含量与其在两波长下的吸光度值有较好的线性相关性；由两线性方程可近似取 A520 木素＝ 0.5338c 木素 +N1 木素， A570 木素＝ 0.3288c 木素 +N2 (N1 木素、 N2 木素为常数 )，同时可以近似取两方程系数为木素吸光度值与木素含量的比例木素，系数，则有 K2 ∶ K1 ＝ ε520 木素∶ ε570 木素＝ 0.5338 ∶ 0.3288，故取 K2 ＝ 5.338， K1 ＝ 3.288。
     为确放大系数可用性，测得不同葡萄糖含量 DNS 溶液在波长 520nm 和 570nm 处吸光度值，得到葡萄糖准液用量与两波长处吸光度关系曲线如图 2 所示。
     由图 2 中两标准曲线及线性关系公式可以看出，葡萄糖含量与其在两波长下的吸光度值也有较好的线性相关性；由两线性方程可近似取 A520 葡萄糖＝ 0.2674c 葡萄糖 +N1 葡萄糖， A570 葡萄糖＝ 0.1280c 葡萄糖 +N2 葡萄糖， (N1 葡萄糖、 N2 葡萄糖为常数 )。则差示信号 S0 ＝ K2(A520 木素 +A520 葡萄糖 )-K1(A570 木素 +A570 葡萄糖 ) ＝ 0.1959c 葡萄糖 +N0(N0 为常数 )。
     通过计算得到各编号葡萄糖溶液差示信号值 S1，图 3 为差示信号 S1 与葡萄糖浓度关系标准曲线。由图 3 中线性计算公式可以近似得到差示信号与葡萄糖含量关系式： S1 ＝ 0.1958c 葡萄糖 +N1(N1 为常数 )。比较两差示信号 S0 与 S1，可以看出，二者与葡萄糖浓度比例系数相差很小，所以取 K2 ＝ 5.338， K1 ＝ 3.288 为放大系数比较合适。第六步、双波长测定黑液中还原糖含量计算公式确定：
     通过计算得到各编号葡萄糖溶液差示信号值 S1，图 3 为差示信号 S1 与葡萄糖浓度关系标准曲线。由图 3 中线性计算公式可以近似得到差示信号与葡萄糖含量关系式： S1 ＝ 0.1958c 葡萄糖 +N1(N1 为常数 )。比较两差示信号 S0 与 S1，可以看出，二者与葡萄糖浓度比例系数相差很小，所以取 K2 ＝ 5.338， K1 ＝ 3.288 为放大系数比较合适。
     由图 4 可以看出，在混合体系中，差示信号与葡萄糖用量的线性相关系数仍能大于 0.9900，所以双波长测定黑液中还原糖还是比较准确的。由图 4 中方程可以近似得到差示信号与葡萄糖含量关系式： S2 ＝ 0.1642c 葡萄糖 +N2(N2 为常数 )。与纯葡萄糖溶液差示信号方程 S1 ＝ 0.1958c 葡萄糖 +N1 比较，有一定差别，所以应予以校正。由于两方程比例系数比值约为 1.2，所以取校正系数 k ＝ 1.2，则经校正后差示信号与葡糖关系式为 S ＝ k·S2 ＝ 0.1970c 葡萄糖 +N(N 为常数 )。
     若某溶液在 520nm 处吸光度值为 A，在 570nm 处吸光度值为 B，则结合图 4 中差示信号与葡萄糖用量关系式，可以得到混合液中葡萄糖含量计算公式：
     其中 c 为待测溶液中还原糖浓度， g/L ；
     S 为 520nm 与 570nm 处吸光度值经计算得到差示信号， s ＝ K2×A-K1×B ；
     K2， K1 为差示信号放大系数，分别 K2 ＝ 5.338， K1 ＝ 3.288 ；
     k 为校正系数， 1.2 ；
     M 为溶液稀释倍数， M 应取适当值，是 A、 B 介于 0.3 ～ 0.7。
     第七步、酶解后黑液中还原糖含量测定：
     将蒸煮黑液用硫酸调 pH 至 5 左右，然后加入含复合酶 pH4.8HAc-NaAc 缓冲液 50mL，于 50℃恒温水浴摇床中 6h，取出后进行沸水浴灭酶处理，离心去除其中不溶物，取离
     心清液，稀释适当倍数，取其中 5ml 于预先加入 5ml pH4.8HAc-NaAc 缓冲液， 3mlDNS 溶液的比色管中，煮沸 5min 后迅速冷却后用去离子水定容至 25ml。以 3mlDNS 溶液定容至 25ml 溶液为参比，测定溶液 520nm 及 570nm 处吸光度值，根据计算公式得到黑液中还原糖含量。酶解后黑液中还原糖含量与酶用量关系图，如图 5 所示。从图 5 可以看出，用双波长法测得黑液中还原糖含量基本反映了酶解过程中还原糖含量变化趋势，有一定的可靠性。
     实施案例 2.
     用本方法对酶解后黑液平行样进行测试。
     具体操作方法如下：
     第一步、 DNS(3， 5- 二硝基水杨酸 ) 溶液配制：
     称取 6.3g DNS 和 262ml 2mol·l-1NaOH 溶液加入酒石酸钾钠热溶液中 (182g 酒石酸钾钠溶于 500ml 去离子水 )，再加 5g 结晶酚和 5g 亚硫酸钠搅拌溶解。冷却后定容至 1000ml，储存于棕色瓶，放置 72h 后使用；
     第二步、木素的提取：
     取一定量的碱法蒸煮黑液，用稀硫酸调节溶液至 pH 6，离心分离，取上层液体，再用稀硫酸调至 pH 3，再离心分离，取出沉淀物，并用稀硫酸洗涤，然后离心，重复操作 2 ～ 3 次，取离心后沉淀物置于 80℃真空干燥箱烘干，用研钵研碎，制得粗木素；第三步、木素的提纯：
     将粗木素溶于 140ml 吡啶 - 醋酸 - 水 ( 体积比 9 ∶ 1 ∶ 4) 体系中，用 180ml CHCl3 萃取，静置 4h 分层后摇荡，再次分层后，分出下层溶有木素的有机层。上层溶液中加入 150ml CHCl3 再次萃取，摇荡后静置，待分层后分离出下层的有机层。合并两次萃取液，在旋转真空蒸发器中浓缩至大约 100ml，移至 1000ml 无水乙醚中，在搅动下沉淀出木素来，将沉淀出的木素用乙醚洗涤，至无吡啶味为止。置于 P2O5 的真空干燥器中干燥，得到浅灰色精制木素；
     第四步、葡萄糖及木素标准溶液配制：
     准确称取 1.0000g 分析纯葡萄糖，溶解于 pH 4.8 的 HAc-NaAc 缓冲液中，然后用 pH 4.8 的 HAc-NaAc 缓冲液定容至 1L，即得 1g/l 葡萄糖标准溶液 (Glc 标准溶液 ) ；准确称取 5.0000g 提纯后木素，溶解于 100ml DNS 溶液中，然后用去离子水定容至 500ml，得木素标准溶液；
     第五步、放大系数的确定：
     在该实验中，木素作为干扰相，在双波长测试中要消除其干扰，就要确定差示信号计算公式中 K2 ∶ K1 ＝ ε520 木素∶ ε570 木素。测定不同木素含量 DNS 溶液在波长 520nm 和 570nm 处吸光度值，得到木素标准液用量与两波长处吸光度关系曲线如图 1 所示。
     图 1 中两曲线为木素 520nm 处吸光度标准曲线与木素 570nm 处吸光度标准曲线。由图 1 两标准曲线及线性关系公式可以看出，木素含量与其在两波长下的吸光度值有较好的线性相关性；由两线性方程可近似取 A520 木素＝ 0.5338c 木素 +N1 木素， A570 木素＝ 0.3288c 木素 +N2 (N1 木素、 N2 木素为常数 )，同时可以近似取两方程系数为木素吸光度值与木素含量的比例木素，系数，则有 K2 ∶ K1 ＝ ε520 木素∶ ε570 木素＝ 0.5338 ∶ 0.3288，故取 K2 ＝ 5.338， K1 ＝ 3.288。
     为确放大系数可用性，测得不同葡萄糖含量 DNS 溶液在波长 520nm 和 570nm 处吸光度值，得到葡萄糖准液用量与两波长处吸光度关系曲线如图 2 所示。
     由图 2 中两标准曲线及线性关系公式可以看出，葡萄糖含量与其在两波长下的吸
     光度值也有较好的线性相关性；由两线性方程可近似取 A520 葡萄糖＝ 0.2674c 葡萄糖 +N1 葡萄糖， A570 葡萄糖＝ 0.1280c 葡萄糖 +N2 葡萄糖， (N1 葡萄糖、 N2 葡萄糖为常数 )。则差示信号 S0 ＝ K2(A520 木素 +A520 葡萄糖 )-K1(A570 木素 +A570 葡萄糖 ) ＝ 0.1959c 葡萄糖 +N0(N0 为常数 )。
     通过计算得到各编号葡萄糖溶液差示信号值 S1，图 3 为差示信号 S1 与葡萄糖浓度关系标准曲线。由图 3 中线性计算公式可以近似得到差示信号与葡萄糖含量关系式： S1 ＝ 0.1958c 葡萄糖 +N1(N1 为常数 )。比较两差示信号 S0 与 S1，可以看出，二者与葡萄糖浓度比例系数相差很小，所以取 K2 ＝ 5.338， K1 ＝ 3.288 为放大系数比较合适。
     第六步、双波长测定黑液中还原糖含量计算公式确定：
     通过计算得到各编号葡萄糖溶液差示信号值 S1，图 3 为差示信号 S1 与葡萄糖浓度关系标准曲线。由图 3 中线性计算公式可以近似得到差示信号与葡萄糖含量关系式： S1 ＝ 0.1958c 葡萄糖 +N1(N1 为常数 )。比较两差示信号 S0 与 S1，可以看出，二者与葡萄糖浓度比例系数相差很小，所以取 K2 ＝ 5.338， K1 ＝ 3.288 为放大系数比较合适。
     由图 4 可以看出，在混合体系中，差示信号与葡萄糖用量的线性相关系数仍能大于 0.9900，所以双波长测定黑液中还原糖还是比较准确的。由图 4 中方程可以近似得到差示信号与葡萄糖含量关系式： S2 ＝ 0.1642c 葡萄糖 +N2(N2 为常数 )。与纯葡萄糖溶液差示信号方程 S1 ＝ 0.1958c 葡萄糖 +N1 比较，有一定差别，所以应予以校正。由于两方程比例系数比值约为 1.2，所以取校正系数 k ＝ 1.2，则经校正后差示信号与葡糖关系式为 S ＝ k·S2 ＝ 0.1970c 葡萄糖 +N(N 为常数 )。
     若某溶液在 520nm 处吸光度值为 A，在 570nm 处吸光度值为 B，则结合图 4 中差示信号与葡萄糖用量关系式，可以得到混合液中葡萄糖含量计算公式：其中 c 为待测溶液中还原糖浓度， g/L ；
     S 为 520nm 与 570nm 处吸光度值经计算得到差示信号， s ＝ K2×A-K1×B ；
     K2， K1 为差示信号放大系数，分别 K2 ＝ 5.338， K1 ＝ 3.288 ；
     k 为校正系数， 1.2 ；
     M 为溶液稀释倍数， M 应取适当值，是 A、 B 介于 0.3 ～ 0.7。
     第七步、酶解黑液平行样还原糖含量测定：
     为了检测该方法的可靠性，选择一组复合酶用量为 8ml 离心清液，向各试样中分别加入相同量葡萄糖，稀释适当倍数，取其中 5ml 于预先加入 5ml pH4.8HAc-NaAc 缓冲液， 3mlDNS 溶液的比色管中，煮沸 5min 后迅速冷却后用去离子水定容至 25ml。以 3mlDNS 溶液定容至 25ml 溶液为参比，测定溶液 520nm 及 570nm 处吸光度值，根据计算公式得到黑液中还原糖含量。所得结果见表 1。
     表 1、不同试样还原糖含量：依据加入量，可以计算得到还原糖浓度应为 12g/L，经计算这六组葡萄糖浓度平均值为 12.0086g/L，数据方差为 0.001518，标准差为 0.038968。这说明该方法在测试时，稳定性比较好，所以用该方法测定黑液中还原糖有较高的准确性。

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1、(10)申请公布号 CN 101963578 A (43)申请公布日 2011.02.02 CN 101963578 A *CN101963578A* (21)申请号 201010279985.8 (22)申请日 2010.09.11 G01N 21/31(2006.01) G01N 1/28(2006.01) G01N 1/34(2006.01) G01J 3/427(2006.01) (71)申请人大连工业大学地址 116034 辽宁省大连市甘井子区轻工苑 1 号 (72)发明人鲁杰杨瑞丰卜令习 (74)专利代理机构大连东方专利代理有限责任公司 21212 代理人毕进 (5。

2、4) 发明名称一种测定制浆黑液还原糖含量的方法 (57) 摘要本发明提供一种采用 3， 5- 二硝基水杨酸双波长分光光度法测定制浆黑液中还原糖含量的方法。本发明能排除黑液中木素对还原糖含量测定的影响。通过对木素与葡萄糖在3， 5-二硝基水杨酸溶液中紫外 - 可见特定波长区域吸收谱图的分析，结合木素和葡萄糖各波长处吸光度值与浓度比例系数的对比值，确定了测试适宜波长。通过对木素 DNS 溶液在 520nm 和 570nm 吸光度值与木素浓度关系曲线，确定双波长差示信号放大系数。木素葡萄糖溶液差示信号与浓度之间比例系数与未加木素的葡萄糖溶液比例系数之间校正系数为。

3、k 1.2。本发明能反映酶解过程中黑液中还原糖含量变化；测定加入葡萄糖的酶解后黑液中还原糖含量，具有较好的稳定性，测定结果较理想。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书 1 页说明书 7 页附图 2 页 CN 101963579 A1/1 页 2 1. 一种测定制浆黑液还原糖含量的方法，其特征在于按以下步骤进行操作：第一步、 3， 5- 二硝基水杨酸溶液配制，称取 6.3g 3， 5- 二硝基水杨酸和 262ml2mol l-1 氢氧化钠溶液加入酒石酸钾钠热溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠搅拌溶解，冷却后。

4、定容至 1000ml，储存于棕色瓶，放置 72h 后使用；第二步、木素的提取，取一定量的碱法蒸煮黑液，用稀硫酸调节溶液至 pH6，离心分离，取上层液体，再用稀硫酸调至 pH 3，再离心分离，取出沉淀物，并用稀硫酸洗涤，然后离心，重复操作 2 3 次，取离心后沉淀物置于 80真空干燥箱烘干，用研钵研碎，制得粗木素；第三步、木素的提纯，将粗木素溶于 140ml 吡啶 - 醋酸 - 水体系中，用 180ml 氯仿萃取，静置4h分层后摇荡，再次分层后，分出下层溶有木素的有机层；上层溶液中加入150ml氯仿再次萃取，摇荡后静置，待分层后分离。

5、出下层的有机层；合并两次有机层萃取液，在旋转真空蒸发器中浓缩至95105ml，移至1000ml无水乙醚中，搅拌使析出沉淀，将沉淀用乙醚洗涤，至无吡啶味为止，置于 P2O5的真空干燥器中干燥，得到浅灰色精制木素；第四步、葡萄糖及木素标准溶液配制，定量称取分析纯葡萄糖，用 pH 4.8 的醋酸 - 醋酸钠缓冲液配制成 1g/L 葡萄糖标准溶液；准确称取精制木素，配制成 0.05g/ml 木素的 3， 5- 二硝基水杨酸溶液，然后用去离子水定容，得 0.01g/ml 木素标准溶液；第五步、放大系数的确定，通过测定不同木素含量 3， 5- 二硝基水杨。

6、酸溶液在波长 520nm 和 570nm 处吸光度值，得到木素标准液用量与两波长处吸光度关系曲线，其线性关系方程分别为 A520 木素 520 木素c木素+N1 木素， A570 木素 570 木素c木素+N2 木素；通过测定不同葡萄糖含量 3， 5- 二硝基水杨酸溶液在波长 520nm 和 570nm 处吸光度值，得到葡萄糖标准液用量与两波长处吸光度关系曲线图，其线性方程分别为 A520 葡萄糖 520 葡萄糖c葡萄糖+N1 葡萄糖， A570 葡萄糖 570 葡萄糖c葡萄糖+N2 葡萄糖，得到差示信号 S0 K2(A520 木素+A520 葡萄糖)-K1(A570 木素+。

7、A570 葡萄糖) (570 木素520 葡萄糖-570 葡萄糖520 木素)c葡萄糖+N0；第六步、双波长测定黑液中还原糖含量计算公式的确定，通过计算得到各编号葡萄糖溶液差示信号值 S1，作图得到差示信号 S1与葡萄糖浓度关系标准曲线，由标准曲线线性计算公式可以近似得到差示信号与葡萄糖含量关系式： S1 1c葡萄糖+N1，测定一组即含葡萄糖又含木素的 DNS 溶液 520nm 和 570nm 处吸光度值，并计算出各编号溶液差示信号值 S2，得到混合液差示信号与葡萄糖标准溶液关系曲线，得计算公式 S2 2c葡萄糖+N2，取校正系数 k 2/1，经校正后差示信号与。

8、葡萄糖关系式为 S kS2 c葡萄糖+N，则可计算得到还原糖含量与差示信号间计算公式；第七步、黑液中还原糖含量测定，将黑液调 pH 值至 5，加入适量 pH4.8 醋酸 - 醋酸钠缓冲液，离心去除其中不溶物，取离心清液，稀释适当倍数，取其中 5ml 于预先加入 5ml pH4.8 醋酸 - 醋酸钠缓冲液， 3ml3， 5- 二硝基水杨酸溶液的比色管中，煮沸 5min 后迅速冷却后用去离子水定容至 25ml。以 3ml3， 5- 二硝基水杨酸溶液定容至 25ml 溶液为参比，测定溶液 520nm 及 570nm 处吸光度值，根据计算公式得到黑液中还原糖含量；其。

9、中，酒石酸钾钠溶液是由 182g 酒石酸钾钠溶于 500ml 去离子水配制而成的；吡啶 - 醋酸 - 水的体系组成为吡啶醋酸水的体积比为 9 1 4 ； N 为常数，分别为 N、 N0、 N1、 N2、 N1 木素、 N2 木素、 N1 葡萄糖、 N2 葡萄糖。权利要求书 CN 101963578 A CN 101963579 A1/7 页 3 一种测定制浆黑液还原糖含量的方法技术领域 0001 本发明涉及造纸废水的处理及黑液资源综合利用技术领域，具体是利用双波长分光光度法测定黑液中还原糖工艺，主要应用于造纸废水处理及黑液综合利用过程中碳水化合物总量及降解后单糖的。

10、含量的测定。背景技术 0002 分光光度法具有操作简便，快速，灵敏度高，耗时短等特点，因此在还原糖的分析中占据相当重要的地位。其原理在于利用还原糖的还原末端与氧化剂发生反应产生高灵敏性发色基团或消耗带有发色基团的氧化剂而达到检测目的。已报道的方法有传统的 Somogyi-Nelson 法， DNS 法，铁氰化物和 BCA 法，以及新涌现的 MBTH 法，甲胺法。DNS 法是目前采用较多的方法，它是利用 DNS 在高温条件下与还原糖的还原末端反应生成有色复合物进行还原糖定量的。 0003 制浆蒸煮黑液中的固形物组成比较复杂，一般有机物含量占 70左右，无机物为 30。

11、左右。有机物中木素含量占40左右，挥发性有机酸占817，同时还含有一定量的半纤维素、以及少量悬浮在溶液中的小纤维等。在研究中，常将半纤维素及小纤维降解成还原性单糖，然后对其进行研究。而测定黑液中还原糖含量都很难排除其他物质的干扰，尤其是黑液中的木素的干扰。 0004 双波长分光光度法具有准确度和精密度好，灵敏度高，多组分同时测定等优点，因此，本研究对双波长分光光度法对黑液中还原糖进行测试方法进行探索。发明内容 0005 采用 DNS(3， 5- 二硝基水杨酸 ) 双波长分光光度法测定制浆黑液中还原糖的含量是该发明的主要探讨内容。制浆黑液中由于木素的存在，。

12、对还原糖含量的测定产生一定干扰。双波长分光光度法能排除黑液中木素对还原糖含量测定的影响。通过对木素 DNS 溶液及葡萄糖 DNS 溶液紫外 - 可见特定波长区域吸收谱图的分析，结合木素和葡萄糖各波长处吸光度值与浓度比例系数的对比值，确定了测试适宜波长为520nm和570nm。在作图分析及计算基础得到黑液中还原糖含量测定计算公式。对酶解后黑液中还原糖含量测定，发现该方法能反映酶解过程中黑液中还原糖含量变化；测定加入葡萄糖的酶解后黑液中还原糖含量，发现该方法具有较好的稳定性，测定结果比较理想。 0006 具体操作方法如下： 0007 第一步、 DNS(3， 5- 二硝。

13、基水杨酸 ) 溶液配制，称取 6.3g 3， 5- 二硝基水杨酸和 262ml 2moll-1氢氧化钠溶液加入酒石酸钾钠热溶液中 (182g 酒石酸钾钠溶于 500ml 去离子水 )，再加 5g 结晶酚和 5g 亚硫酸钠搅拌溶解，冷却后定容至 1000ml，储存于棕色瓶，放置 72h 后使用； 0008 第二步、木素的提取，取一定量的碱法蒸煮黑液，用稀硫酸调节溶液至 pH6，离心分离，取上层液体，再用稀硫酸调至 pH 3，再离心分离，取出沉淀物，并用稀硫酸洗涤，然后离说明书 CN 101963578 A CN 101963579 A2/7 页 4 心。

14、，重复操作 2 3 次，取离心后沉淀物置于 80真空干燥箱烘干，用研钵研碎，制得粗木素； 0009 第三步、木素的提纯 0010 将粗木素溶于140ml吡啶-醋酸-水(体积比914)体系中，用180ml CHCl3萃取，静置 4h 分层后摇荡，再次分层后，分出下层溶有木素的有机层。上层溶液中加入 150ml CHCl3再次萃取，摇荡后静置，待分层后分离出下层的有机层。合并两次萃取液，在旋转真空蒸发器中浓缩至大约 100ml，移至 1000ml 无水乙醚中，在搅动下沉淀出木素来，将沉淀出的木素用乙醚洗涤，至无吡啶味为止。置于 P2O5的真空干燥器中干燥。

15、，得到浅灰色精制木素； 0011 第四步、葡萄糖及木素标准溶液配制 0012 准确称取1.0000g分析纯葡萄糖，溶解于pH 4.8的HAc-NaAc缓冲液中，然后用pH 4.8 的 HAc-NaAc 缓冲液定容至 1L，即得 1g/l 葡萄糖标准溶液 (Glc 标准溶液 ) ；准确称取 5.0000g提纯后木素，溶解于100ml DNS溶液中，然后用去离子水定容至500ml，得木素标准溶液； 0013 第五步、放大系数的确定 0014 在该实验中，木素作为干扰相，在双波长测试中要消除其干扰，就要确定差示信号计算公式中 K2 K1 520 木素 570 木素。。

16、测定不同木素含量 DNS 溶液在波长 520nm 和 570nm处吸光度值，得到木素标准液用量与两波长处吸光度关系曲线。木素520nm处吸光度标准曲线与木素 570nm 处吸光度标准曲线线性关系方程可近似取 A520 木素 520 木素c木素+N1 木素， A570 木素 570 木素c木素+N2 木素， (N1 木素、 N2 木素为常数 )，同时可以近似取两方程系数为木素吸光度值与木素含量的比例系数，则有 K2 K1 570 木素 520 木素；同时测得不同葡萄糖含量 DNS 溶液在波长 520nm 和 570nm 处吸光度值，得到葡萄糖准液用量与两波长处吸光度关系曲线图。

17、。由标准曲线图及线性关系公式可以看出，葡萄糖含量与其在两波长下的吸光度值也有较好的线性相关性；由两线性方程可近似取 A520 葡萄糖 520 葡萄糖c葡萄糖+N1 葡萄糖， A570 葡萄糖 570 葡萄糖c葡萄糖+N2 葡萄糖， (N1 葡萄糖、 N2 葡萄糖为常数 )。则差示信号 S0 K2(A520 木素+A520 葡萄糖)-K1(A570 木素+A570 葡萄糖) (570 木素520 葡萄糖-570 葡萄糖520 木素)c葡萄糖+N0(N0为常数 ) ； 0015 第六步、双波长测定黑液中还原糖含量计算公式确定 0016 通过计算得到各编号葡萄糖溶液差示信号值 S1，作。

18、图得到差示信号 S1与葡萄糖浓度关系标准曲线。由标准曲线线性计算公式可以近似得到差示信号与葡萄糖含量关系式： S1 1c葡萄糖+N1(N1为常数 )。测试一组即含葡萄糖又含木素的 DNS 溶液 520nm 和 570nm 处吸光度值，并计算出各编号溶液差示信号值 S2，得到混合液差示信号与葡萄糖标准溶液关系曲线，得计算公式 S2 2c葡萄糖+N2(N2为常数 )。所以取校正系数 k 2/1，则经校正后差示信号与葡糖关系式为 S kS2 c葡萄糖+N(N 为常数 )。则可计算得到还原糖含量与差示信号间计算公式； 0017 第七步、黑液中还原糖含量测定 0018 将黑液调 p。

19、H 值至 5 左右，加入适量 pH4.8HAc-NaAc 缓冲液，离心去除其中不溶物，取离心清液，稀释适当倍数，取其中 5ml 于预先加入 5ml pH4.8HAc-NaAc 缓冲液， 3mlDNS 溶液的比色管中，煮沸 5min 后迅速冷却后用去离子水定容至 25ml。以 3mlDNS 溶液定容至 25ml溶液为参比，测定溶液520nm及570nm处吸光度值，根据计算公式得到黑液中还原糖含量。说明书 CN 101963578 A CN 101963579 A3/7 页 5 附图说明 0019 图 1、木素吸光度标准曲线，可以根据此标准曲线得到双波长计算的比例系数。

20、，其中横坐标为木素标准溶液用量 ( 单位： ml)，纵坐标为吸光度值。 0020 图 2、葡萄糖吸光度标准曲线，可以根据该标准曲线，计算出双波长计算公式所用差示信号值，其中横坐标为葡萄糖标准溶液用量 ( 单位： ml)，纵坐标为吸光度值。 0021 图 3、葡萄糖溶液差示信号标准曲线。 0022 图 4、混合溶液差示信号标准曲线，根据两曲线对比可以确定计算公式中校正系数，其中，纵坐标为差示信号值，横坐标为葡萄糖标准溶液用量 ( 单位： ml)。 0023 图 5、不同用量复合酶酶解后黑液中还原糖含量。横坐标为酶用量 ( 单位： ml) ；纵坐标为酶解。

21、后还原糖量 ( 单位： gl-1)。具体实施方式 0024 下面结合实施例对本发明作进一步说明。 0025 实施案例 1. 0026 用本方法对酶解后黑液中还原糖进行测定。 0027 具体操作方法如下： 0028 第一步、 DNS(3， 5- 二硝基水杨酸 ) 溶液配制： 0029 称取 6.3g DNS 和 262ml 2moll-1NaOH 溶液加入酒石酸钾钠热溶液中 (182g 酒石酸钾钠溶于 500ml 去离子水 )，再加 5g 结晶酚和 5g 亚硫酸钠搅拌溶解。冷却后定容至 1000ml，储存于棕色瓶，放置 72h 后使用； 0030 第二步、木素的提取： 00。

22、31 取一定量的碱法蒸煮黑液，用稀硫酸调节溶液至 pH 6，离心分离，取上层液体，再用稀硫酸调至 pH 3，再离心分离，取出沉淀物，并用稀硫酸洗涤，然后离心，重复操作 2 3 次，取离心后沉淀物置于 80真空干燥箱烘干，用研钵研碎，制得粗木素； 0032 第三步、木素的提纯： 0033 将粗木素溶于140ml吡啶-醋酸-水(体积比914)体系中，用180ml CHCl3萃取，静置 4h 分层后摇荡，再次分层后，分出下层溶有木素的有机层。上层溶液中加入 150ml CHCl3再次萃取，摇荡后静置，待分层后分离出下层的有机层。合并两次萃取液，在旋转。

23、真空蒸发器中浓缩至大约 100ml，移至 1000ml 无水乙醚中，在搅动下沉淀出木素来，将沉淀出的木素用乙醚洗涤，至无吡啶味为止。置于 P2O5的真空干燥器中干燥，得到浅灰色精制木素； 0034 第四步、葡萄糖及木素标准溶液配制： 0035 准确称取1.0000g分析纯葡萄糖，溶解于pH 4.8的HAc-NaAc缓冲液中，然后用pH 4.8 的 HAc-NaAc 缓冲液定容至 1L，即得 1g/l 葡萄糖标准溶液 (Glc 标准溶液 ) ；准确称取 5.0000g提纯后木素，溶解于100ml DNS溶液中，然后用去离子水定容至500ml，得木素标准溶液；。

24、 0036 第五步、放大系数的确定： 0037 在该实验中，木素作为干扰相，在双波长测试中要消除其干扰，就要确定差示信号计算公式中 K2 K1 520 木素 570 木素。测定不同木素含量 DNS 溶液在波长 520nm 和说明书 CN 101963578 A CN 101963579 A4/7 页 6 570nm 处吸光度值，得到木素标准液用量与两波长处吸光度关系曲线如图 1 所示。 0038 图 1 中两曲线为木素 520nm 处吸光度标准曲线与木素 570nm 处吸光度标准曲线。由图 1 两标准曲线及线性关系公式可以看出，木素含量与其在两波长下的吸光度值有较好。

25、的线性相关性；由两线性方程可近似取 A520 木素 0.5338c木素+N1 木素， A570 木素 0.3288c木素+N2 木素， (N1 木素、 N2 木素为常数 )，同时可以近似取两方程系数为木素吸光度值与木素含量的比例系数，则有K2K1520木素570木素0.53380.3288，故取K25.338， K13.288。 0039 为确放大系数可用性，测得不同葡萄糖含量 DNS 溶液在波长 520nm 和 570nm 处吸光度值，得到葡萄糖准液用量与两波长处吸光度关系曲线如图 2 所示。 0040 由图 2 中两标准曲线及线性关系公式可以看出，葡萄糖含量与其在两波长。

26、下的吸光度值也有较好的线性相关性；由两线性方程可近似取 A520 葡萄糖 0.2674c 葡萄糖+N1 葡萄糖， A570 葡萄糖 0.1280c葡萄糖+N2 葡萄糖， (N1 葡萄糖、 N2 葡萄糖为常数 )。则差示信号 S0 K2(A520 木素+A520 葡萄糖)-K1(A570 木素+A570 葡萄糖) 0.1959c葡萄糖+N0(N0为常数 )。 0041 通过计算得到各编号葡萄糖溶液差示信号值 S1，图 3 为差示信号 S1与葡萄糖浓度关系标准曲线。由图 3 中线性计算公式可以近似得到差示信号与葡萄糖含量关系式： S1 0.1958c葡萄糖+N1(N1为常数 )。比较两。

27、差示信号 S0与 S1，可以看出，二者与葡萄糖浓度比例系数相差很小，所以取 K2 5.338， K1 3.288 为放大系数比较合适。 0042 第六步、双波长测定黑液中还原糖含量计算公式确定： 0043 通过计算得到各编号葡萄糖溶液差示信号值 S1，图 3 为差示信号 S1与葡萄糖浓度关系标准曲线。由图 3 中线性计算公式可以近似得到差示信号与葡萄糖含量关系式： S1 0.1958c葡萄糖+N1(N1为常数 )。比较两差示信号 S0与 S1，可以看出，二者与葡萄糖浓度比例系数相差很小，所以取 K2 5.338， K1 3.288 为放大系数比较合适。 0044 由图。

28、 4 可以看出，在混合体系中，差示信号与葡萄糖用量的线性相关系数仍能大于 0.9900，所以双波长测定黑液中还原糖还是比较准确的。由图 4 中方程可以近似得到差示信号与葡萄糖含量关系式： S2 0.1642c葡萄糖+N2(N2为常数 )。与纯葡萄糖溶液差示信号方程 S1 0.1958c葡萄糖+N1比较，有一定差别，所以应予以校正。由于两方程比例系数比值约为 1.2，所以取校正系数 k 1.2，则经校正后差示信号与葡糖关系式为 S kS2 0.1970c葡萄糖+N(N 为常数 )。 0045 若某溶液在 520nm 处吸光度值为 A，在 570nm 。

29、处吸光度值为 B，则结合图 4 中差示信号与葡萄糖用量关系式，可以得到混合液中葡萄糖含量计算公式： 0046 其中 c 为待测溶液中还原糖浓度， g/L ； 0047 S 为 520nm 与 570nm 处吸光度值经计算得到差示信号， s K2A-K1B ； 0048 K2， K1为差示信号放大系数，分别 K2 5.338， K1 3.288 ； 0049 k 为校正系数， 1.2 ； 0050 M 为溶液稀释倍数， M 应取适当值，是 A、 B 介于 0.3 0.7。 0051 第七步、酶解后黑液中还原糖含量测定： 0052 将蒸煮黑液用硫酸调 pH 至 5 左。

30、右，然后加入含复合酶 pH4.8HAc-NaAc 缓冲液 50mL，于 50恒温水浴摇床中 6h，取出后进行沸水浴灭酶处理，离心去除其中不溶物，取离说明书 CN 101963578 A CN 101963579 A5/7 页 7 心清液，稀释适当倍数，取其中 5ml 于预先加入 5ml pH4.8HAc-NaAc 缓冲液， 3mlDNS 溶液的比色管中，煮沸 5min 后迅速冷却后用去离子水定容至 25ml。以 3mlDNS 溶液定容至 25ml 溶液为参比，测定溶液 520nm 及 570nm 处吸光度值，根据计算公式得到黑液中还原糖含量。酶解后黑液中还原糖含。

31、量与酶用量关系图，如图 5 所示。从图 5 可以看出，用双波长法测得黑液中还原糖含量基本反映了酶解过程中还原糖含量变化趋势，有一定的可靠性。 0053 实施案例 2. 0054 用本方法对酶解后黑液平行样进行测试。 0055 具体操作方法如下： 0056 第一步、 DNS(3， 5- 二硝基水杨酸 ) 溶液配制： 0057 称取 6.3g DNS 和 262ml 2moll-1NaOH 溶液加入酒石酸钾钠热溶液中 (182g 酒石酸钾钠溶于 500ml 去离子水 )，再加 5g 结晶酚和 5g 亚硫酸钠搅拌溶解。冷却后定容至 1000ml，储存于棕色瓶，放置 72h 后使用。

32、； 0058 第二步、木素的提取： 0059 取一定量的碱法蒸煮黑液，用稀硫酸调节溶液至 pH 6，离心分离，取上层液体，再用稀硫酸调至 pH 3，再离心分离，取出沉淀物，并用稀硫酸洗涤，然后离心，重复操作 2 3 次，取离心后沉淀物置于 80真空干燥箱烘干，用研钵研碎，制得粗木素； 0060 第三步、木素的提纯： 0061 将粗木素溶于140ml吡啶-醋酸-水(体积比914)体系中，用180ml CHCl3萃取，静置 4h 分层后摇荡，再次分层后，分出下层溶有木素的有机层。上层溶液中加入 150ml CHCl3再次萃取，摇荡后静置，待分层。

33、后分离出下层的有机层。合并两次萃取液，在旋转真空蒸发器中浓缩至大约 100ml，移至 1000ml 无水乙醚中，在搅动下沉淀出木素来，将沉淀出的木素用乙醚洗涤，至无吡啶味为止。置于 P2O5的真空干燥器中干燥，得到浅灰色精制木素； 0062 第四步、葡萄糖及木素标准溶液配制： 0063 准确称取1.0000g分析纯葡萄糖，溶解于pH 4.8的HAc-NaAc缓冲液中，然后用pH 4.8 的 HAc-NaAc 缓冲液定容至 1L，即得 1g/l 葡萄糖标准溶液 (Glc 标准溶液 ) ；准确称取 5.0000g提纯后木素，溶解于100ml DNS溶液中，然后用。

34、去离子水定容至500ml，得木素标准溶液； 0064 第五步、放大系数的确定： 0065 在该实验中，木素作为干扰相，在双波长测试中要消除其干扰，就要确定差示信号计算公式中K2K1520木素570木素。测定不同木素含量DNS溶液在波长520nm和570nm 处吸光度值，得到木素标准液用量与两波长处吸光度关系曲线如图 1 所示。 0066 图 1 中两曲线为木素 520nm 处吸光度标准曲线与木素 570nm 处吸光度标准曲线。由图 1 两标准曲线及线性关系公式可以看出，木素含量与其在两波长下的吸光度值有较好的线性相关性；由两线性方程可近似取 A520 木素 0.。

35、5338c木素+N1 木素， A570 木素 0.3288c木素+N2 木素， (N1 木素、 N2 木素为常数 )，同时可以近似取两方程系数为木素吸光度值与木素含量的比例系数，则有K2K1520木素570木素0.53380.3288，故取K25.338， K13.288。 0067 为确放大系数可用性，测得不同葡萄糖含量 DNS 溶液在波长 520nm 和 570nm 处吸光度值，得到葡萄糖准液用量与两波长处吸光度关系曲线如图 2 所示。 0068 由图 2 中两标准曲线及线性关系公式可以看出，葡萄糖含量与其在两波长下的吸说明书 CN 101963578 A CN 10。

36、1963579 A6/7 页 8 光度值也有较好的线性相关性；由两线性方程可近似取 A520 葡萄糖 0.2674c 葡萄糖+N1 葡萄糖， A570 葡萄糖 0.1280c葡萄糖+N2 葡萄糖， (N1 葡萄糖、 N2 葡萄糖为常数 )。则差示信号 S0 K2(A520 木素+A520 葡萄糖)-K1(A570 木素+A570 葡萄糖) 0.1959c葡萄糖+N0(N0为常数 )。 0069 通过计算得到各编号葡萄糖溶液差示信号值 S1，图 3 为差示信号 S1与葡萄糖浓度关系标准曲线。由图 3 中线性计算公式可以近似得到差示信号与葡萄糖含量关系式： S1 0.1958c葡萄糖+。

37、N1(N1为常数 )。比较两差示信号 S0与 S1，可以看出，二者与葡萄糖浓度比例系数相差很小，所以取 K2 5.338， K1 3.288 为放大系数比较合适。 0070 第六步、双波长测定黑液中还原糖含量计算公式确定： 0071 通过计算得到各编号葡萄糖溶液差示信号值 S1，图 3 为差示信号 S1与葡萄糖浓度关系标准曲线。由图 3 中线性计算公式可以近似得到差示信号与葡萄糖含量关系式： S1 0.1958c葡萄糖+N1(N1为常数 )。比较两差示信号 S0与 S1，可以看出，二者与葡萄糖浓度比例系数相差很小，所以取 K2 5.338， K1 3.288 为放大系。

38、数比较合适。 0072 由图 4 可以看出，在混合体系中，差示信号与葡萄糖用量的线性相关系数仍能大于 0.9900，所以双波长测定黑液中还原糖还是比较准确的。由图 4 中方程可以近似得到差示信号与葡萄糖含量关系式： S2 0.1642c葡萄糖+N2(N2为常数 )。与纯葡萄糖溶液差示信号方程 S1 0.1958c葡萄糖+N1比较，有一定差别，所以应予以校正。由于两方程比例系数比值约为 1.2，所以取校正系数 k 1.2，则经校正后差示信号与葡糖关系式为 S kS2 0.1970c葡萄糖+N(N 为常数 )。 0073 若某溶液在 520nm 处吸光度值。

39、为 A，在 570nm 处吸光度值为 B，则结合图 4 中差示信号与葡萄糖用量关系式，可以得到混合液中葡萄糖含量计算公式： 0074 其中 c 为待测溶液中还原糖浓度， g/L ； 0075 S 为 520nm 与 570nm 处吸光度值经计算得到差示信号， s K2A-K1B ； 0076 K2， K1为差示信号放大系数，分别 K2 5.338， K1 3.288 ； 0077 k 为校正系数， 1.2 ； 0078 M 为溶液稀释倍数， M 应取适当值，是 A、 B 介于 0.3 0.7。 0079 第七步、酶解黑液平行样还原糖含量测定： 0080 为了检测。

40、该方法的可靠性，选择一组复合酶用量为 8ml 离心清液，向各试样中分别加入相同量葡萄糖，稀释适当倍数，取其中 5ml 于预先加入 5ml pH4.8HAc-NaAc 缓冲液， 3mlDNS 溶液的比色管中，煮沸 5min 后迅速冷却后用去离子水定容至 25ml。以 3mlDNS 溶液定容至 25ml 溶液为参比，测定溶液 520nm 及 570nm 处吸光度值，根据计算公式得到黑液中还原糖含量。所得结果见表 1。 0081 表 1、不同试样还原糖含量： 0082 说明书 CN 101963578 A CN 101963579 A7/7 页 9 0083 依据加入量。

41、，可以计算得到还原糖浓度应为 12g/L，经计算这六组葡萄糖浓度平均值为12.0086g/L，数据方差为0.001518，标准差为0.038968。这说明该方法在测试时，稳定性比较好，所以用该方法测定黑液中还原糖有较高的准确性。说明书 CN 101963578 A CN 101963579 A1/2 页 10 图 1 木素吸光度标准曲线图 2 葡萄糖吸光度标准曲线图 3 葡萄糖溶液差示信号标准曲线说明书附图 CN 101963578 A CN 101963579 A2/2 页 11 图 4 混合溶液差示信号标准曲线图 5 不同用量复合酶酶解后黑液中还原糖含量说明书附图 CN 101963578 A 。

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