用于快速检测杂色曲霉素的生物传感器及其组装方法 【技术领域】
本发明属于生物传感器领域，涉及一种用于快速检测杂色曲霉素的生物传感器及其组装方法。
背景技术
杂色曲霉素(Sterigmatocystin，ST)是一种致癌致畸的真菌毒素，是黄曲霉毒素(Aflatoxin，AFT)的合成前体，二者结构相似，都是由双呋喃环与氧杂蒽醌连接组成。ST是国际癌症研究机构划分的2B类致癌物质，与肺癌、肝癌、胃癌密切相关，是粮食、饲草、玉米、小麦、花生等谷物中的主要真菌污染源。在我国，恶性肿瘤高发区大部分是由于粮食和谷物中ST的污染，然而，人们对ST的急慢性毒性认识却比较少，因此测定ST的含量具有重要的意义。目前，测定ST的方法主要有薄层层析法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、液质联用法(LC-MS)、气质联用法(GC-MS)和偶联质谱法(Tandem MS)等(Turner NW，Subrahmanyam S，Piletsky SA.Analytical methods fordetermination of mycotoxins：A review.Anal Chim Acta 2009；632：168-180.)。这些方法各有其特点，但有的需要使用昂贵的仪器，有的操作繁琐，有的样品前处理麻烦；此外，由于ST发荧光的强度远不如黄曲霉毒素，而使用衍生化的方法则容易引入较大的误差，灵敏准确的检测通常需要使用质谱检测器，从而难于实现实际样品中ST含量的快速检测。
酶生物传感器是一种较好的替代方法，具有检测速度快，操作简单等特点，已报道的酶生物传感器法，如在发明人的中国专利ZL 200410028018.9中，提供了利用黄曲霉毒素解毒酶修饰电极制备生物传感器检测杂色曲霉素，其检测线为10ng/mL，响应时间为2min。但该类生物传感器仍有待改进，提高其灵敏度、稳定性和重现性等。
【发明内容】
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种可用于实际样品中杂色曲霉素含量快速检测的生物传感器。该生物传感器灵敏度更高，稳定性和重现性更好，响应时间更快，并且可快速用于实际样品中ST检测的生物传感器及其组装方法。
本发明所述的一种用于快速检测杂色曲霉素的生物传感器，包括基底电极以及组装在基底电极上的反应层，所述的反应层包括：聚合物膜，由电聚合在基底电极上的聚邻苯二胺构成；该聚合物膜修饰在所述基底电极上；电子传递体，为有机分子或高分子电子传递体；壳聚糖凝胶，由壳聚糖溶液制成；以及6-甲氧基双呋喃香豆素氧化酶；其中，由活化后的单壁碳纳米管均匀分散在壳聚糖溶液中形成电子传递体-壳聚糖凝胶混合膜；所述6-甲氧基双呋喃香豆素氧化酶包埋固定在电子传递体-壳聚糖凝胶混合膜上，再组装在聚合物膜修饰的基底电极上，形成用于检测杂色曲霉素的生物传感器。
本发明优选的聚合物膜是聚邻苯二胺，邻苯二胺可以通过电聚合，有机合成等方法在很多导电基体上制得聚合薄膜，它即适合于在有机电解质中使用，也可以用于水性电解质溶液，具有较高的库伦效率和稳定性。
本发明所述的电子传递体可选用有机分子或高分子电子传递体。有机分子电子传递体主要有二茂铁及其衍生物、有机染料、醌及其衍生物、离子液体等；高分子电子传递体主要有碳纳米管、金属纳米颗粒、变价过渡金属离子型和有机氧化还原型等氧化还原聚合物等。本发明优选的电子传递体是活化后的单壁碳纳米管，可以采用强酸或强氧化剂进行活化处理。本发明中将单壁碳纳米管分散在壳聚糖溶液中，也可以选用溶胶凝胶(sol-gel)及其复合物、明矾以及一些其他具有成膜能力的化合物代替壳聚糖。
本发明所述的一种用于快速检测杂色曲霉素的生物传感器的组装方法，包括以下步骤：
A、将邻苯二胺单体通过电化学的方法聚合在基底电极表面，得到聚邻苯二胺聚合物膜修饰的基底电极；
B、将壳聚糖溶液制成壳聚糖凝胶；
C、将单壁碳纳米管活化处理后，加入到上述的壳聚糖溶液中混匀，即得单壁碳纳米管-壳聚糖混合液，备用；
D、制备6-甲氧基双呋喃香豆素氧化酶溶液，备用；
E、将6-甲氧基双呋喃香豆素氧化酶溶液与单壁碳纳米管-壳聚糖混合液混匀，滴加在聚邻苯二胺聚合物膜修饰的基底电极表面，4℃组装过夜，即得所述的生物传感器。
优选的制备方法包括以下步骤：
a、聚邻苯二胺修饰基底电极的制备：
清洗干净的基底电极在使用前先在H2SO4中进行电化学预处理，用循环伏安法进行扫描直到电极信号稳定为止；处理好的基底电极插入到氮气饱和的含0.01-0.05mol/L邻苯二胺的0.1-0.5mol/L H2SO4电聚合液中，以0.05-0.1V/s的扫速循环伏安电聚合30-60圈，即可在基底电极表面形成一层聚邻苯二胺膜；
b、壳聚糖溶液的制备：
用乙酸溶解壳聚糖粉末，使其浓度在0.1％-1.5％之间，充分溶解后滤去不溶杂质，调节壳聚糖溶液的pH值为5.5，置于4℃保存备用；
c、单壁碳纳米管-壳聚糖混合液的制备：
用强酸或强氧化剂活化单壁碳纳米管，洗至中性烘干后溶于步骤b所制得的壳聚糖溶液，超声分散，制得分散均匀的0.1mg/mL-2.5mg/mL的单壁碳纳米管-壳聚糖溶液；
d、6-甲氧基双呋喃香豆素氧化酶的制备：
将克隆有甲氧基双呋喃香豆素氧化酶地基因工程大肠杆菌诱导表达，收集菌体，超声破碎细胞后用亲和层析柱进行纯化，酶切融合蛋白得到单一的6-甲氧基双呋喃香豆素氧化酶；层析纯化酶切产物，收集色谱过程中的酶活性峰组分，浓缩后得6-甲氧基双呋喃香豆素氧化酶；配制成蛋白浓度为2mg/mL的酶液，备用；
e、6-甲氧基双呋喃香豆素氧化酶修饰的生物传感器的制备：
取步骤c中所制备的单壁碳纳米管-壳聚糖混合液滴加在步骤a中聚邻苯二胺修饰的基底电极上，室温下晾干成膜；然后再滴加步骤d中所制备的酶液，4℃组装过夜，即得6-甲氧基双呋喃香豆素氧化酶修饰的生物传感器。
本发明所述的生物传感器主要是利用6-甲氧基双呋喃香豆素氧化酶作为分子识别原件来检测杂色曲霉素(ST)，其原理是：ST在6-甲氧基双呋喃香豆素氧化酶的催化作用下发生氧化还原反应，随着电子的转移，产生可被检测的电信号。本发明所述的生物传感器，对于杂色曲霉素的检测是高特异性，高选择性和高灵敏性的，完全能满足实际样品中杂色曲霉素含量的检测。
与现有技术相比，本发明所述的生物传感器具有如下有益效果：
(1)利用本发明所述的生物传感器可实现对实际样品的快速检测，只需对实际样品进行简单的预处理，就可以实时在线监控，其响应时间快，小于10s，对ST响应更灵敏；
(2)本发明所述的生物传感器灵敏度更高，在0.1mol/L pH7.0的PBS检测体系中对ST检测的下限为3ng/mL，线性范围宽，为10ng/mL-310ng/mL；
(3)本发明所述的生物传感器具有很好的稳定性和重现性；抗干扰能力强，能够快速实现单个或批量样品的检测；检测实际样品的回收率为87.6-105.5％，检测速度快，稳定好，使用寿命长；
(4)本发明所述的生物传感器使用起来省时、省力，检测速度快且操作简单方便，无须培训即可推广使用。
【附图说明】
图1为MDCO/CS-SWCNTs/POPD/Au修饰电极在含不同浓度ST的PBS中的循环伏安曲线；其中，图中曲线从a到c的变化对应ST的浓度分别是0ng/mL，10ng/mL，20ng/mL。
图2为计时电流法检测传感器对ST的响应；其中，图中内插图为响应电流与ST浓度的关系。
【具体实施方式】
实施例一：用于快速检测杂色曲霉素的生物传感器
本发明所述的用于快速检测实际样品中杂色曲霉素的生物传感器，包括金电极(Au)为基底电极以及组装在金电极上的反应层，所述的反应层包括聚合物膜，电子传递体，壳聚糖凝胶和6-甲氧基双呋喃香豆素氧化酶。首先在金电极上利用电化学的方法组装上一层聚合物膜，然后将电子传递体均匀分散在壳聚糖中，再将6-甲氧基双呋喃香豆素氧化酶包埋在电子传递体-壳聚糖的混合物中，所形成的电子传递体-6-甲氧基双呋喃香豆素氧化酶-壳聚糖杂合物组装在聚合物膜修饰的金电极上，形成了6-甲氧基双呋喃香豆素氧化酶修饰的生物传感器。
本实施例中，选择聚邻苯二胺作为聚合物膜组装在金电极上，所采用的电子传递体是活化后的单壁碳纳米管。单壁碳纳米管均匀分散在壳聚糖中形成单壁碳纳米管-壳聚糖混悬液，通过包埋法在混合膜中固定6-甲氧基双呋喃香豆素氧化酶，组装成对杂色曲霉素灵敏的酶生物传感器。
实施例二：用于检测杂色曲霉素的生物传感器的制备
(一)、材料的准备
(1)工作电极：选用金电极，内直径为2mm，购自上海辰华仪器公司。
(2)邻苯二胺(OPD)：化学纯，购自上海化学试剂有限公司。
(3)单壁碳纳米管(SWCNTs)：直径2nm，长度5～15μm，纯度95％，购自深圳纳米港。
(4)壳聚糖(CS)：85-90％的脱乙酰度，平均分子量为1×106g/mol，购自浙江澳兴生物科技有限公司。
(二)、聚邻苯二胺修饰金电极的制备
将金电极在由7体积98％的H2SO4和3体积30％H2O2组成的溶液中浸泡30分钟，用双蒸水冲洗干净，再依次用粒径为1.0μm、0.3μm和0.05μm的氧化铝粉末打磨至镜面，清洗干净后晾干备用。金电极在使用前先在H2SO4中进行电化学预处理，循环伏安法进行扫描直到电极信号稳定为止。处理好的金电极插入到氮气饱和的含0.01-0.05mol/L邻苯二胺的0.1-0.5mol/L H2SO4电聚合液中，以0.05-0.1V/s的扫速循环伏安电聚合30-60圈，即可在金电极表面形成一层聚邻苯二胺膜，记为POPD/Au。
(三)壳聚糖溶液的制备
将适量的壳聚糖粉末溶于乙酸溶液中，配置成0.1％-1.5％的壳聚糖溶液，充分溶解后，调节壳聚糖溶液的pH值为5.5，置于4℃保存备用。
(四)单壁碳纳米管-壳聚糖混合液的制备
单壁碳纳米管在使用前先进行纯化处理，用强酸或强氧化剂使其活化，洗至中性烘干后溶于步骤三所制得的壳聚糖溶液，超声分散，制得分散均匀的0.1mg/mL-2.5mg/mL的单壁碳纳米管-壳聚糖溶液。
(五)6-甲氧基双呋喃香豆素氧化酶的制备
将6-甲氧基双呋喃香豆素氧化酶(MDCO)基因的ORF(开放阅读框)克隆到含有融合标签MBP(麦芽糖结合蛋白)的pMAL-C2X载体(购自美国NEB)上，构建原核重组表达质粒pMAL-C2X-MDCO，将其导入大肠杆菌Rosetta(DE3)中(购自天津博美科生物科技有限公司)，即得重组甲氧基双呋喃香豆素氧化酶基因工程大肠杆菌(Rosetta(DE3)-C2X-MDCO)，用IPTG(异丙基硫代β-D-半乳糖苷)诱导，实现了MBP_MDCO融合蛋白的高效表达。收集菌体，超声破碎细胞后用填充有amylose介质的亲和层析柱(amylose购自北京NEB)进行纯化，收集洗脱峰。用Factor Xa酶切融合蛋白得到单一的MDCO(6-甲氧基双呋喃香豆素氧化酶)。酶切产物用PhenylSepharose 6 Fast Flow疏水柱层析进一步纯化(Phenyl Sepharose 6 Fast Flow疏水柱层析为瑞典Pharmacia公司产品，苯基琼脂糖疏水层析介质6Fast Flow型号)，采用盐浓度递减的连续线性梯度洗脱，洗脱A液为0.05mol/L PBS，pH 6.5，洗脱B液为0.05mol/L PBS，2mol/L(NH4)2SO4，pH 6.5，收集色谱过程中的酶活性峰组分，浓缩后得6-甲氧基双呋喃香豆素氧化酶(MDCO)。配制成蛋白浓度为2mg/mL的酶液，备用。
(六)6-甲氧基双呋喃香豆素氧化酶修饰的生物传感器的制备
取适量的步骤四中所制备的单壁碳纳米管-壳聚糖混合液滴加在步骤二中聚邻苯二胺修饰的金电极上，晾干成膜；然后再适量的滴加步骤五中所制备的酶液，4℃组装过夜，即得6-甲氧基双呋喃香豆素氧化酶修饰的生物传感器，记为MDCO/CS-SWCNTs/POPD/Au，电极使用前先在0.1M pH7.0的PBS中浸泡2min，不用时置于4℃干燥保存。
本实施例中，选用杂色曲霉素(ST)作为测试底物。
实施例三：MDCO/CS-SWCNTs/POPD/Au修饰电极对杂色曲霉素的电化学响应
将实施例二所制备的MDCO/CS-SWCNTs/POPD/Au修饰电极作为工作电极，与通用的对电极和任选的参比电极一起组成一个三电极系统。
本实施例中，选用Ag/AgCl电极(饱和KCl)为参比电极，Pt丝电极为对电极组成三电极系统，0.1mol/L pH7.0的PBS为电解支持液。
(一)、循环伏安法检测ST
采用CHI660C电化学工作站(上海辰华仪器公司)，利用三电极系统(参比电极：Ag/AgCl电极，对电极：Pt丝电极，工作电极：MDCO/CS-SWCNTs/POPD/Au修饰电极)，选择循环伏安扫描模式，设置电化学参数如下：
工作电位：-0.8V-+0.2V
扫描速率：100mV/s
静息时间：2s
设置好参数后，在0.1mol/L pH7.0的PBS中滴加不同浓度的ST，混匀后采用循环伏安法进行检测。如图1所示，在没有ST的电解质溶液中，MDCO/CS-SWCNTs/POPD/Au展现出一对准可逆的氧化还原峰，实现了MDCO在修饰电极上的直接电化学反应(曲线a)。随着ST浓度的增加(如曲线b＝10ng/mL ST，c＝20ng/mL ST)，MDCO修饰电极的还原峰电流增大，而氧化峰电流减小，氧化峰与还原峰电位基本保持不变，说明MDCO/CS-SWCNTs/POPD/Au对ST具有良好的电催化还原作用。
(二)、检测ST的电流-时间曲线
CHI660C电化学工作站选择电流-时间检测模式，采用三电极系统(参比电极：Ag/AgCl电极，对电极：Pt丝电极，工作电极：MDCO/CS-SWCNTs/POPD/Au修饰电极)，设置电化学参数如下：
检测电位：-0.4V
静息时间：2s
搅拌速度：50r/min
待背景电流稳定后，往10mL 0.1mol/L pH7.0的PBS中等时间滴加ST，可以是不同浓度的ST，也可以是等浓度的ST，本发明优选的是每滴加一次，ST浓度变化为10ng/mL。由图2可见，随着ST浓度梯度变化，响应电流持续增大，该酶生物传感器响应迅速且灵敏，平均响应时间小于10s。酶电极的响应电流与ST浓度在10-310ng/mL范围内呈线性关系(图2插图)，线性回归方程为：I(μA)＝0.0389c(ng/ml)+2.5825(r＝0.997)，检出限为3ng/mL。
实施例四：酶电极的稳定性和重现性
将一支MDCO/CS-SWCNTs/POPD/Au修饰电极置于含20ng/mL ST的pH7.0PBS溶液中，连续循环伏安扫描100圈，峰形几乎保持不变，说明本发明的酶生物传感器具有很好的稳定性。用该生物传感器对20ng/mL ST重复测定11次，其电流响应的平均相对标准偏差(RSD)为3.9％，表明该电极具有很好的检测重复性。另外，同时制备7根酶修饰电极，相同条件下对20ng/mL ST的响应电流的RSD为4.4％。表明该修饰电极具有很好的制作重现性。电极不用时置于4℃的pH 7.0 PBS溶液上方保存，期间间歇性使用，4天后响应信号为初始值的95.5％，30天后仍能保持91％，本发明所述的生物传感器能够长时间使用。
实施例五：MDCO/CS-SWCNTs/POPD/Au修饰电极的抗干扰能力
采用计时电流法对MDCO/CS-SWCNTs/POPD/Au修饰电极的抗干扰能力进行研究，测试条件参数设置如实施例3(二)所示，在10mL含50ng/mL ST的0.1mol/L pH7.0的PBS中，分别滴加下列不同浓度的可能干扰物，分析其抗干扰能力。
分别滴加的干扰物的种类：
1000倍于ST浓度的PO43-、NO3-、柠檬酸根、果糖、葡萄糖；
500倍于ST浓度的EDTA、NH4+、草酸、α-乳糖、抗坏血酸；
100倍于ST浓度的甘氨酸、L-丝氨酸、尿酸、甲醇、油酸；
10倍于ST浓度的Fe3+、对硝基苯酚、乙酸。
测试效果：当控制相对误差不超过检测50ng/mL ST的电流响应值的±5％的情况下，1000倍的PO43-、NO3-、柠檬酸根、果糖、葡萄糖；500倍的EDTA、NH4+、草酸、α-乳糖、抗坏血酸；100倍的甘氨酸、L-丝氨酸、尿酸、甲醇、油酸；10倍的Fe3+、对硝基苯酚、乙酸等对测定不产生干扰。
实施例六：实际样品测定及回收率实验
将本发明所述的酶生物传感器用于实际样品测定以及检测其回收率，所述的实际样品可以是玉米、花生、大米、小麦等一系列农副产品和粮食作物，也可以是饲料、饮料、酱油、橄榄油、花生油等一系列可能含ST的产品。
本实施例中选用玉米样品进行检测。
玉米样品的处理：取1g优质玉米粉，加入不同浓度的ST，于5ml 80％的甲醇溶液中振荡萃取45min，离心(5000r/min，10min)，上清用0.1mol/L pH7.0的PBS按1∶5(V/V)稀释后检测。其他样品按照类似的方法，经过简单的预处理后即可检测。
循环伏安检测：测试条件参数设置如实施例三的(一)所示，对分别含10ng/nL，50ng/nL，100ng/nL，150ng/nL ST的玉米样品进行循环伏安检测，每个浓度的玉米样品均测量5次。测试结果如表一所示。
表一：玉米样品中ST含量的测定结果
如上表所示，所测得样品的相对标准偏差在2.8％～4.1％之间，加标回收率在87.6％～105.5％之间，平均回收率为95.8％。