一种巨细胞病毒、风疹病毒联合检测试剂检测卡 【技术领域】
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种能同时检测巨细胞病毒(CMV)IgG抗体、风疹病毒(RV)IgG抗体的联合检测卡。
背景技术
巨细胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)亦称细胞包涵体病毒，由于感染的细胞肿大，并具有巨大的核内包涵体，故名。巨细胞病毒在人群中感染非常广泛，我国成人感染率达95％以上，通常呈隐性感染，多数感染者无临床症状，但在一定条件下侵袭多个器官和系统可产生严重疾病。病毒可侵入肺、肝、肾、唾液腺、乳腺其他腺体，以及多核白细胞和淋巴细胞，可长期或间隙地自唾液、乳汗血液、尿液、精液、子宫分泌物多处排出病毒。通常可通过口腔，生殖道，胎盘，输血或器官移植等多途径传播。机体的细胞免疫功能对巨细胞病毒感染的发生和发展起重要作用，细胞免疫缺陷者，可导致严重的和长期的巨细胞病毒感染，并使机体的细胞免疫进一步受到抑制，如杀伤性T细胞活力下降，自然杀伤性细胞功能减低等。
风疹病毒(Rubella Virus，RV)呈不规则球形，50～70毫微米，病毒内核为正链单股核糖核酸(RNA)与1个核衣壳蛋白(C)，3个囊膜蛋白，对人体均有抗原性。人群通常易感染风疹病毒，传染源为风疹病患者，出疹前1周至出疹后5天均有传染性，孕妇感染可通过垂直传播，传给胚胎或胎儿，往往导致早产、流产、死胎或胎儿畸形，故对风疹抗体检测对优生优育有着很重要的意义。
巨细胞病毒和风疹病毒感染的实验室诊断常采用聚合酶链式反应(PCR)、酶联免疫吸附法(ELISA)、胶体金免疫层析(GICA)等方法。
聚合酶链式反应具有灵敏度极高的特点，直接检测病原体基因，不能判定人群抗体水平，且容易出现假阳性。
酶联免疫吸附法检测的是抗体，具有灵敏度高、特异性强的特点，常检测IgM和IgG抗体。但是酶联免疫吸附法需要设备，操作复杂，耗时较长，价格昂贵，不适用于快速诊断。
目前，国内不少医院的实验室已将孕妇巨细胞病毒和风疹病毒感染筛查作为常规项目，可能有些欠成熟。其中多数实验室将早孕血清IgM抗体单项指标作为孕妇巨细胞病毒和风疹病毒感染的指标，仅从方法学角度即存在问题，因IgM抗体的检测影响因素较多，主要是易出现假阳性，且抗体产生最早，一经感染，快速产生，在感染初期抗感染起作用，但维持时间短，消失快。
本专利之所以采取测定巨细胞病毒IgG抗体的方法，是因为与测定巨细胞病毒IgM抗体相比，巨细胞病毒IgG抗体可终身持续存在，而巨细胞病毒IgM抗体仅与急性感染有关，因而孕妇巨细胞病毒原发性感染最可靠的诊断方法是妊娠期巨细胞病毒特异性IgG抗体发生阳转。同样，孕妇在妊娠前对风疹已存在的免疫力，即已存在的特异性IgG抗体，能够非常有效地保护妊娠期发生再次风疹病毒的感染。因此，育龄妇女孕前应检查风疹病毒抗体，如果是阴性，应接种风疹病毒减毒疫苗，这样也就无须进行妊娠期风疹感染的监测。
【发明内容】
本发明目的是提供一种使用快捷方便、安全、适应于临床的需要且能同时检测巨细胞病毒和风疹病毒的巨细胞病毒、风疹病毒联合检测卡，本发明还提供了一种巨细胞病毒、风疹病毒联合检测卡的制备方法，通过本制备方法制得的检测卡具有特异性强和灵敏度高的特点。
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种巨细胞病毒、风疹病毒联合检测试剂检测卡，包括卡盖、卡底和试纸条，试纸条依次设有检测样本区、金标区、硝酸纤维素膜区和吸水区，其特征在于：所述硝酸纤维素膜区依次设有包被羊抗鼠IgG的质控线、包被巨细胞病毒抗原的检测线和包被风疹病毒抗原的检测线。
作为一种优化方案：
所述羊抗鼠IgG的质控线由浓度为1.5mg/ml的羊抗鼠IgG溶液在硝酸纤维素膜区画制而成，巨细胞病毒抗原检测线由浓度为0.1mg/ml的巨细胞病毒抗原溶液画制而成，风疹病毒抗原检测线由浓度为0.1mg/ml的风疹病毒抗溶液画制而成。
所述羊抗鼠IgG的质控线、巨细胞病毒抗原的检测线和风疹病毒抗原的检测线依次被标注字母“C”、“T1”和“T2”。
作为一种优化方案：
所述检测样本区为玻璃纤维层；所述金标区设有位于试纸条上表面的胶体金层，胶体金层的上表面设有保护层；所述吸水区域设有吸水纸，吸水纸上设有安装标志，安装标志与安装标示孔相对应。
作为一种优化方案：
所述卡盖上设有加样孔、观测孔和安装标示孔，卡底的内部设有放置试纸条的凹槽；所述试纸条上的检测加样区与卡盖上的加样孔相对应；试纸条上的金标区和硝酸纤维素区与卡盖上的观测孔相对应。
一种巨细胞病毒、风疹病毒联合检测试剂检测卡的制备方法，由卡盖、卡底和试纸条组装而成，试纸条依次设有检测样本区、金标区、硝酸纤维素膜区和吸水区，其特征在于：所述金标区设有胶体金层，胶体金层由氯金酸溶液、柠檬酸三钠溶液、碳酸钾溶液和抗人IgG单克隆抗体溶液制备而成。
作为一种优化方案：
所述胶体金层的制备过程如下：
A.取1～4％的氯金酸水溶液100ml，加热至沸腾，加入0.5～1％柠檬酸三钠溶液0.8ml，迅速混匀，继续煮沸10分钟，待溶液颜色由蓝经紫变酒红色后冷却至室温；
B.然后向步骤A中得到的溶液中加入1～3％的碳酸钾溶液100μl和1mg/ml的抗人IgG单克隆抗体溶液100μl，得到混合溶液；
C.将步骤B中的混合溶液放入离心管中，在‑6～2℃条件下，以12000转/分的转速离心50分钟；
D.将步骤C中离心后的溶液弃去上清液，取下层沉淀物备用；
E.将步骤D中的沉淀物用稀释液进行稀释，稀释液与离心前混合溶液的体积比为20∶1；
F.步骤E中稀释后得到的溶液均匀涂在试纸条玻璃纤维层上。
作为一种优化方案：
所述步骤A中氯金酸水溶液的浓度为1％，柠檬酸三钠溶液的浓度为1％；所述步骤B中碳酸钾溶液的浓度为2％。
作为一种优化方案：
所述步骤A中氯金酸水溶液的浓度为4％，柠檬酸三钠溶液的浓度为0.5％；所述步骤B中碳酸钾溶液的浓度为3％。
作为一种优化方案：
所述步骤A中氯金酸水溶液的浓度为2％，柠檬酸三钠溶液的浓度为0.8％；所述步骤B中碳酸钾溶液的浓度为1％。
本发明通过采用上述方案与现有技术相比，具有以下优点：
1.本发明所采用的技术方案，可以同时检测标本中巨细胞病毒IgG抗体、风疹病毒IgG抗体，且检测结果的总体符合率较高，推广应用前景广阔。
2.本发明检测的是IgG抗体，与测定IgM抗体相比，IgG抗体是可以终身携带的，而IgM抗体仅与急性感染有关，准确率高。
3.本发明所采用的技术方案，减少了许多繁琐的程序，方便、快捷、直观，检测结果的符合率在90％左右，与德国赛润ELISA classic巨细胞病毒IgG、风疹病毒IgG检测试剂所得结果相比，检测结果基本一致，甚至高于德国赛润ELISA的检测结果，但本发明不需特殊仪器也不需专业培训，按说明书即可完成操作，全过程只需30分钟，降低了使用成本，适合医院等基层单位。
下面结合附图和实施例对本发明进一步描述。
【附图说明】
附图1为本发明实施例中卡盖的结构示意图；
附图2为本发明实施例中卡底的结构示意图；
附图3为本发明实施例中试纸条的俯视结构示意图；
附图4为本发明实施例中试纸条的侧视结构示意图。
图中：1‑卡盖；11‑加样孔；12‑观测孔；13‑安装标示孔；2‑卡底；21‑凹槽；3‑试纸条；31‑检测样本区；32‑金标区；321‑胶体金层；322‑保护层；33‑硝酸纤维素膜区；331‑羊抗鼠的质控线；332‑巨细胞病毒抗原检测线；333‑风疹病毒抗原的检测线；34‑吸水区；341‑吸水纸；342‑安装标志。
【具体实施方式】
实施例1：如图1和图2所示，一种巨细胞病毒、风疹病毒联合检测试剂检测卡，包括卡盖1、卡底2和试纸条3，卡盖1上设有加样孔11、观测孔12和安装标示孔13，卡底2的内部设有放置试纸条3的凹槽21。试纸条3上的检测加样区31与卡盖1上的加样孔11相对应；试纸条3上的金标区32和硝酸纤维素区33与卡盖1上的观测孔12相对应。
如图和图4所示，试纸条3依次设有检测样本区31、金标区32、硝酸纤维素膜区33和吸水区34，检测样本区31为玻璃纤维层；金标区32设有位于试纸条3上表面的胶体金层321，胶体金层321的上表面设有保护层322；硝酸纤维素膜区33依次设有包被羊抗鼠IgG的质控线331、包被巨细胞病毒抗原的检测线332和包被风疹病毒抗原的检测线333；吸水区域34设有吸水纸341，吸水纸341上设有安装标志342，安装标志342与安装标示孔13相对应。
羊抗鼠IgG的质控线331的浓度为1.5mg/ml，即羊抗鼠IgG的质控线331是由浓度为1.5mg/ml的羊抗鼠IgG溶液在试纸条3上画出，巨细胞病毒抗原检测线332的浓度为0.1mg/ml，风疹病毒抗原检测线333的浓度为0.1mg/ml，同样，巨细胞病毒抗原检测线332和风疹病毒抗原检测线333，也是用同样的方法在试纸条3上画出。羊抗鼠IgG的质控线331、巨细胞病毒抗原的检测线332和风疹病毒抗原的检测线333依次被标注字母“C”、“T1”和“T2”。
本发明可以减少许多繁琐的程序，方便、快捷、直观，不需特殊仪器也不需专业培训，按说明书即可完成操作，全过程只需30分钟，降低了使用成本，适合医院等基层单位。
一种巨细胞病毒、风疹病毒联合检测试剂检测卡的制备方法，由上述的卡盖1、卡底2和试纸条3组装而成，试纸条3依次设有检测样本区31、金标区32、硝酸纤维素膜区33和吸水区34，金标区32设有胶体金层321，胶体金层321由氯金酸溶液、柠檬酸三钠溶液、碳酸钾溶液和抗人IgG单克隆抗体溶液制备而成。
胶体金层321的制备过程如下：
A.取100ml 1％的氯金酸水溶液，加热至沸腾，加入0.8ml的1％柠檬酸三钠溶液，迅速混匀，继续煮沸10分钟，待溶液颜色由蓝经紫变酒红色后冷却至室温；
B.然后向步骤A中得到的溶液中加入2％的碳酸钾溶液100μl和1mg/ml的抗人IgG单克隆抗体溶液100μl，得到混合溶液；
C.将步骤B中的混合溶液放入离心管中，在‑6～2℃条件下，以12000转/分的转速离心50分钟；
D.将步骤C中离心后的溶液弃去上清液，取下层沉淀物备用；
E.将步骤D中的沉淀物用稀释液进行稀释，稀释液与离心前混合溶液的体积比为20∶1；
F.步骤E中稀释后得到的溶液均匀涂在试纸条玻璃纤维层上。
使用方法：采取静脉血于干净未加抗凝剂的容器内，静置使血自然收缩，离心取血清检测；将检测卡放在台面上，平衡至室温15～30℃，滴加2滴血清80ul于加样孔11中，15～30分钟内观察检测结果。
其中，步骤E中的稀释液是通过下述方法配制而成的，稀释液的配制：取10mM的Tris、0.9％的NaCl、0.05％的PEG、5％的蔗糖、0.1％的NaN3；加入容量瓶，先加入纯水，轻摇使之溶解完全；再加入BSA，静置使之完全溶解，轻摇混匀；以纯水定容；用不锈钢过滤器以0.22um微孔膜做除菌过滤；以HCl将溶液的PH调节为7.4；放置2～8℃备用。
结果的判断标准：
a、阴性：阴性反应后，在标注有字母“C”的羊抗鼠的质控线331上形成一个红色沉积反应标记，在标注有字母“T1”的巨细胞病毒抗原的检测线332和标注有字母“T2”的风疹病毒抗原的检测线333上无反应标记出现，表明被测样品中无巨细胞病毒抗体，也无风疹病毒抗体；
b、阳性：
1、巨细胞病毒抗体阳性反应后，在标注有字母“C”的羊抗鼠的质控线331上形成一个红色沉积反应标记，同时在标注有字母“T1”的巨细胞病毒抗原的检测线332上形成一个红色沉积反应标记，表明被测样品中有巨细胞病毒抗体；
2、风疹病毒抗体阳性反应后，在标注有字母“C”的对照线上形成一个红色沉积反应标记，同时在标注有字母“T2”的风疹病毒抗原的检测线333上形成一个红色沉积反应标记，表明被测样品中有风疹病毒抗体；
3、巨细胞病毒抗体、风疹病毒抗体阳性反应后，在标注有字母“C”的羊抗鼠的质控线331上形成一个红色沉积反应标记，同时在标注有字母“T1”的巨细胞病毒抗原的检测线332和标注有字母“T2”的风疹病毒抗原的检测线333上各形成一个红色沉积反应标记，表明被测样品中既有巨细胞病毒抗体，又有风疹病毒抗体；
4、反应后，在标注有字母“C”的羊抗鼠的质控线331不显色，表明本次检测无效。
结果对比：
目前普遍使用的较先进的德国赛润ELISA检测方法，它对巨细胞病毒IgG和风疹病毒IgG这两种病毒IgG的阳性和阴性检测符合率分别是99.0％、99.2％和99.1％、98.9％，比现行的检测标准要高出很多。
用本发明所述的检测卡对1000例测试标本进行检测，检测结果如表一所示。
表一
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数据分析：本发明联合检测卡的阳性符合率为(856+84+41)÷(862+86+42)＝99％，阴性符合率为9÷10＝90.0％，通过检测结果的对比，本发明的检测结果基本达到德国赛润ELISA的检测水平，所以，可以判定本发明的特异性、灵敏度达到了现行的检测标准。
但与德国赛润ELISA的检测方法相比，德国赛润ELISA的检测方法反应时间较长，需要较好的仪器及与仪器配套的试剂盒，检测成本比较高；而本发明所述的联合检测卡操作简便、观察直观、快速、省时，不需特殊设备，可以作为检测血清中的巨细胞病毒IgG和风疹病毒IgG的重要方法，具有较好的发展前景，因此本发明的联合检测卡从综合方面看，具有较大的优越性。
实施例2：一种巨细胞病毒、风疹病毒联合检测试剂检测卡，其结构与实施例1的结构相同。
一种巨细胞病毒、风疹病毒联合检测试剂检测卡的制备方法由上述的卡盖1、卡底2和试纸条3组装而成，试纸条3依次设有检测样本区31、金标区32、硝酸纤维素膜区33和吸水区34，金标区32设有胶体金层321，胶体金层321由氯金酸溶液、柠檬酸三钠溶液、碳酸钾溶液和抗人IgG单克隆抗体溶液制备而成。
胶体金层321的制备过程如下：
A.取100ml4％的氯金酸水溶液，加热至沸腾，加入0.8ml 0.5％柠檬酸三钠溶液，迅速混匀，继续煮沸10分钟，待溶液颜色由蓝经紫变酒红色后冷却至室温；
B.然后向步骤A中得到的溶液中加入3％的碳酸钾溶液100μl和1mg/ml的抗人IgG单克隆抗体溶液100μl，得到混合溶液；
C.将步骤B中的混合溶液放入离心管中，在‑6～2℃条件下，以12000转/分的转速离心50分钟；
D.将步骤C中离心后的溶液弃去上清液，取下层沉淀物备用；
E.将步骤D中的沉淀物用稀释液进行稀释，稀释液与离心前混合溶液的体积比为20∶1；
F.步骤E中稀释后得到的溶液均匀涂在试纸条玻璃纤维层上。
本实施例中胶体金层的制备方法以及结果的判断标准与实施例1相同，不同之处在于，在胶体金层的制备过程中所述步骤A中氯金酸水溶液的浓度为4％，柠檬酸三钠溶液的浓度为0.5％；所述步骤B中碳酸钾溶液的浓度为3％。
同样，用本发明所述的检测卡对1000例测试标本进行检测，检测结果如表二所示。
表二
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用实施例1同样的分析方法，检测的结果显示，本实施例所述的本发明检测卡同样具有高灵敏性和高特异性。
实施例3：一种巨细胞病毒、风疹病毒联合检测试剂检测卡，其结构与实施例1的结构相同。
一种巨细胞病毒、风疹病毒联合检测试剂检测卡的制备方法由上述的卡盖1、卡底2和试纸条3组装而成，试纸条3依次设有检测样本区31、金标区32、硝酸纤维素膜区33和吸水区34，金标区32设有胶体金层321，胶体金层321由氯金酸溶液、柠檬酸三钠溶液、碳酸钾溶液和抗人IgG单克隆抗体溶液制备而成。
胶体金层321的制备过程如下：
A.取100ml2％的氯金酸水溶液，加热至沸腾，加入0.8ml 0.8％柠檬酸三钠溶液，迅速混匀，继续煮沸10分钟，待溶液颜色由蓝经紫变酒红色后冷却至室温；
B.然后向步骤A中得到的溶液中加入1％的碳酸钾溶液100μl和1mg/ml的抗人IgG单克隆抗体溶液100μl，得到混合溶液；
C.将步骤B中的混合溶液放入离心管中，在‑6～2℃条件下，以12000转/分的转速离心50分钟；
D.将步骤C中离心后的溶液弃去上清液，取下层沉淀物备用；
E.将步骤D中的沉淀物用稀释液进行稀释，稀释液与离心前混合溶液的体积比为20∶1；
F.步骤E中稀释后得到的溶液均匀涂在试纸条玻璃纤维层上。
本实施例中胶体金层的制备方法以及结果的判断标准与实施例1相同，不同之处在于，在胶体金层的制备过程中所述步骤A中氯金酸水溶液的浓度为2％，柠檬酸三钠溶液的浓度为0.8％；所述步骤B中碳酸钾溶液的浓度为1％。
同样，也用本发明所述的检测卡对1000例测试标本进行检测，检测结果如表三所示。
表三
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检测和分析方法与实施例1、实施例2相同，检测的结果显示，本发明所述检测卡具有高灵敏性和高特异性。
综上所述，本发明所述的检测卡在制备过程中，只要氯金酸水溶液、柠檬酸三钠溶液、碳酸钾溶液的浓度在合理的范围值内，本发明所述的检测卡便具有较高的灵敏性和特异性，符合检测标准；此外，由于本发明自身的结构特点，使本发明具有操作简便、观察直观、快速、省时，不需特殊设备等优点。