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1、10申请公布号CN104245950A43申请公布日20141224CN104245950A21申请号201380006347022申请日20130122FERMBP1151520111025FERMBP1151320111025FERMBP1151420111025FERMBP1151220110420201202055620120202JP201224849020121112JPC12P19/02200601C07C35/16200601C12N1/21200601C12N15/0920060171申请人旭化成化学株式会社地址日本东京都72发明人小西一诚今津晋一74专利代理机构北京三友知识。
2、产权代理有限公司11127代理人丁香兰李洋54发明名称鲨肌醇的制造方法57摘要本发明的课题在于提供一种可采用一步法由葡萄糖等低成本且普遍存在的原料生产鲨肌醇的工业制造方法。进一步提供由该制造方法得到的新颖的鲨肌醇衍生物。鲨肌醇利用保有肌醇1磷酸合成酶基因、肌醇单磷酸酶基因、肌肉肌醇脱氢酶基因和鲨肌醇脱氢酶基因的转化微生物通过一个步骤由葡萄糖进行发酵生产。通过该发酵还提供与葡萄糖等糖类结合的鲨肌醇衍生物。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日2014072386PCT国际申请的申请数据PCT/JP2013/0511982013012287PCT国际申请的公布数据WO2013/115012。
3、JA2013080883生物保藏信息51INTCL权利要求书2页说明书22页序列表13页附图6页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书22页序列表13页附图6页10申请公布号CN104245950ACN104245950A1/2页21一种鲨肌醇和鲨肌醇衍生物的制造方法，其包括下述工序1准备转化微生物的工序，该转化微生物保有肌醇1磷酸合成酶基因、肌醇单磷酸酶基因、肌肉肌醇脱氢酶基因和鲨肌醇脱氢酶基因；和2在适于所述微生物的生长和/或维持的条件下，使该微生物与葡萄糖或具有葡萄糖单元的二糖类或者多糖类进行接触的工序。2如权利要求1所述的制造方法，其中，所述鲨肌醇衍生物为。
4、下述结构式所表示的化合物化13如权利要求1或2所述的制造方法，其特征在于，所述转化微生物具有对功能性肌醇单磷酸酶的过剩生产或肌醇单磷酸酶的活化进行诱导的基因重组或变异。4如权利要求13的任一项所述的制造方法，其特征在于，所述转化微生物来源于不具有肌肉肌醇同化能力的微生物。5如权利要求14的任一项所述的制造方法，其中，所述转化微生物来源于选自由大肠杆菌、芽胞杆菌属细菌、棒状杆菌属细菌、发酵单胞菌属细菌组成的组中的细菌。6如权利要求35的任一项所述的制造方法，其中，所述肌醇单磷酸酶的过剩生产是通过对所述转化微生物进行以下操作而被诱导的A导入外来肌醇单磷酸酶基因；B增加内源性肌醇单磷酸酶基因的拷贝数。
5、；C在内源性肌醇单磷酸酶基因的调整区域导入变异、D利用高表达诱导性外来调整区域来置换内源性肌醇单磷酸酶基因的调整区域；或者E使内源性肌醇单磷酸酶基因的调整区域缺失。7如权利要求6所述的制造方法，其中，所述肌醇单磷酸酶的过剩生产是通过对所述转化微生物导入外来肌醇单磷酸酶基因而被诱导的。8如权利要求35的任一项所述的制造方法，其中，所述肌醇单磷酸酶的活化是通过对所述转化微生物进行以下操作而被诱导的F在内源性肌醇单磷酸酶基因中导入变异；G置换内源性肌醇单磷酸酶基因的一部分或全部；H使内源性肌醇单磷酸酶基因的一部分缺失；I使降低肌醇单磷酸酶活性的其它蛋白质减少；J使降低肌醇单磷酸酶活性的化合物的生成减。
6、少。9一种转化微生物，其保有肌醇1磷酸合成酶基因、肌醇单磷酸酶基因、肌肉肌醇脱权利要求书CN104245950A2/2页3氢酶基因和鲨肌醇脱氢酶基因。10如权利要求9所述的转化微生物，其特征在于，所述转化微生物进一步具有对功能性肌醇单磷酸酶的过剩生产或肌醇单磷酸酶的活化进行诱导的基因重组或变异。11如权利要求9或10所述的转化微生物，其特征在于，所述转化微生物来源于不具有肌肉肌醇同化能力的微生物。12如权利要求911的任一项所述的转化微生物，其中，所述转化微生物来源于选自由大肠杆菌、芽胞杆菌属细菌、棒状杆菌属细菌、发酵单胞菌属细菌组成的组中的细菌。13如权利要求1012的任一项所述的转化微生物。
7、，其中，所述肌醇单磷酸酶的过剩生产是通过对所述转化微生物进行以下操作而被诱导的A导入外来肌醇单磷酸酶基因；B增加内源性肌醇单磷酸酶基因的拷贝数；C在内源性肌醇单磷酸酶基因的调整区域导入变异；D利用高表达诱导性外来调整区域来置换内源性肌醇单磷酸酶基因的调整区域；或者E使内源性肌醇单磷酸酶基因的调整区域缺失。14如权利要求13所述的转化微生物，其中，所述肌醇单磷酸酶的过剩生产是通过对所述转化微生物导入外来肌醇单磷酸酶基因而被诱导的。15如权利要求1012的任一项所述的转化微生物，其中，所述肌醇单磷酸酶的活化是通过对所述转化微生物进行以下操作而被诱导的F在内源性肌醇单磷酸酶基因中导入变异；G置换内源。
8、性肌醇单磷酸酶基因的一部分或全部；H使内源性肌醇单磷酸酶基因的一部分缺失；I使降低肌醇单磷酸酶活性的其它蛋白质减少；J使降低肌醇单磷酸酶活性的化合物的生成减少。16下述结构式所表示的化合物化217一种鲨肌醇的制造方法，其特征在于，利用能够催化糖苷键的水解反应的酶将权利要求16所述的化合物分解，生成鲨肌醇。18一种组合物，其包含鲨肌醇与权利要求16所述的化合物。权利要求书CN104245950A1/22页4鲨肌醇的制造方法技术领域0001本发明涉及基因重组技术在鲨肌醇的制造中的应用。特别涉及可采用一步法由葡萄糖等普遍存在的原料生产鲨肌醇的转化体以及利用该转化体的鲨肌醇的工业制造方法。本发明还涉及。
9、利用上述转化体生产得到的鲨肌醇衍生物及其制造方法、以及来自该衍生物的鲨肌醇的制造方法。背景技术0002鲨肌醇SCYLLOINOSITOL；顺1,3,5反2,4,6环己六醇为肌醇的光学惰性异构体之一，是自古以来在动物和植物中发现的化合物。但是，到了近年，鲨肌醇所具有的各种生理活性引起了人们的注意。0003例如，非专利文献1报告了鲨肌醇具有淀粉样蛋白聚集抑制作用，该作用暗示鲨肌醇在阿兹海默氏病治疗中的潜在的有用性。此外，专利文献1请求保护以鲨肌醇为有效成分的血糖值降低剂。从而存在对鲨肌醇进行工业生产的明确的必要性。0004在传统的生产方法中，是从植物体提取鲨肌醇或以肌肉肌醇为原料进行该化合物的化学。
10、合成非专利文献2和3、专利文献2等。但是，近年来研究了利用天然型微生物或微生物来源的酶更有效地进行鲨肌醇的生产的方法。0005专利文献3中公开了下述方法利用含有肌肉肌醇的培养基对属于农杆菌属的微生物进行培养，在培养液中生成肌醇空间异构体；或者使属于农杆菌属的微生物的菌体或菌体处理物作用于肌肉肌醇，生成肌醇空间异构体。通过这些异构体化，肌肉肌醇被转换为鲨肌醇、手性肌醇CHIROINOSITOL为D体和L体的混合物和新肌醇NEOINOSITOL的混合物。0006在专利文献4中记载了使假单胞菌SPAB10064株FERMP18330或醋酸杆菌SPAB10253株FERMP18868作用于肌肉肌醇，将。
11、肌肉肌醇转换为鲨肌醇单酮SCYLLOINOSOSE的内容。进一步尝试了通过将由此生成的鲨肌醇单酮利用硼氢化钠进行还原来合成鲨肌醇，但利用该还原处理实质上仅生成了与肌肉肌醇即，向原料的逆向反应的混合物的形式的鲨肌醇。因而，在专利文献4所记载的鲨肌醇的制造方法中，需要反复进行利用肌肉肌醇的微生物向鲨肌醇单酮的转换与利用硼氢化钠的还原处理来逐渐增加鲨肌醇的含量。0007专利文献5中公开了一种鲨肌醇的制造方法，在该制造方法中，使用肌肉肌醇作为原料，在将由肌肉肌醇生成鲨肌醇单酮的肌肉肌醇2脱氢酶EC11118、将鲨肌醇单酮立体选择性地还原为鲨肌醇的鲨肌醇脱氢酶、以及NAD或NADP混合得到的溶液中进行将。
12、肌肉肌醇转换为鲨肌醇的酶转换反应。该文献中，由肌肉肌醇向鲨肌醇的转换以产率基准计为31。0008从而，上述任一文献均涉及的是以肌肉肌醇为起始原料来生产鲨肌醇的方法，对于鲨肌醇的从头生物合成、也即由葡萄糖等普遍存在的原料直接地且利用一步法来生产鲨肌醇的方法却并未教导。说明书CN104245950A2/22页50009特别是，肌肉肌醇本身本来就是极为有用且贵重的生理活性物质。即，肌肉肌醇对多数高等动物来说为必不可缺的物质，因而其作为营养食品、饲料、药品等成分广泛使用。例如，已知肌肉肌醇在脂肪、胆固醇类的代谢中发挥出重要的作用，在高胆固醇血症等的预防、治疗中是特别有效的。0010因而，实际上，目前就。
13、对肌肉肌醇工业规模的制造工艺提出了很多改良。例如，专利文献6中公开了可向菌体外分泌肌肉肌醇的假丝酵母属酵母的表达及其利用。专利文献7和8分别公开了在上述肌肉肌醇分泌性假丝酵母属酵母中导入可赋予针对葡萄糖代谢拮抗物质和抗生素的耐性的突变的内容。另外，在专利文献9、10和11中还分别公开了通过在具有肌肉肌醇生产能力的假丝酵母属酵母中导入可赋予针对叔胺、六氯环己烷和十六烷基三甲基铵盐的耐性的突变来提高肌肉肌醇的收率的内容。专利文献12中同样公开了在具有肌肉肌醇生产能力的假丝酵母属酵母中导入可赋予针对6卤代6脱氧葡萄糖的耐性的突变的内容。在专利文献13中还公开了在具有肌肉肌醇生产能力的假丝酵母属酵母中。
14、导入可赋予针对卤化乙酰甲酸的耐性的突变的内容。并且，除此之外，例如专利文献14中公开了下述内容在一系列的肌肉肌醇生物合成反应中，肌醇1磷酸合成酶承担控速反应，在这一恰当推论下，通过单独利用编码上述肌醇1磷酸合成酶的DNA对不具有肌肉肌醇分泌能力的假丝酵母属酵母进行转化，对该酵母赋予了肌肉肌醇生产能力；专利文献15中公开了通过将置于甘油3磷酸脱氢酶基因的启动子的调节下的编码肌醇1磷酸合成酶的DNA单独导入到酵母中来提高该酵母的肌肉肌醇生产率的内容。0011上述事实均表明，确立肌肉肌醇的有效且经济的生产方法本身在目前依然是重要的技术课题。因而，现有技术中不得不以贵重且昂贵的肌肉肌醇为原料的鲨肌醇制。
15、造方法的低效率性、不经济性一目了然。0012进一步地，在上述任一文献中均未公开或暗示鲨肌醇衍生物、特别是由糖类进行了衍生化的鲨肌醇。0013现有技术文献0014专利文献0015专利文献1日本特开2003160478号公报0016专利文献2西德专利公开公报第3,405,663号公报0017专利文献3日本特开平9140388号公报0018专利文献4日本特开2003102492号公报0019专利文献5日本特开2010187688号公报0020专利文献6日本特开平800258号公报0021专利文献7日本特开平838188号公报0022专利文献8日本特开平889262号公报0023专利文献9日本特开平9。
16、117295号公报0024专利文献10日本特开平1042860号公报0025专利文献11日本特开平1042882号公报0026专利文献12日本特开平1042883号公报0027专利文献13日本特开200041689公报0028专利文献14日本特开平9220093号公报说明书CN104245950A3/22页60029专利文献15日本特开平10271995号公报0030非专利文献0031非专利文献1THEJOURNALOFBIOLOGICALCHEMISTRY,VOL275,NO24,PP184951850220000032非专利文献2药学杂志,89卷,13021305页19690033非专利文。
17、献3LIEBIGSANNCHEM,866868页1985发明内容0034发明所要解决的课题0035因而，本发明的第一课题涉及一种可由葡萄糖等低成本且普遍存在的原料通过一步法生产鲨肌醇的工业制造方法。本发明人进一步在上述研究过程中首次发现了与糖类结合的本发明的鲨肌醇衍生物。该鲨肌醇衍生物与鲨肌醇本来所显示出的水溶性相比，也显示出了格外优异的水溶性。由于例如纤维素二糖D吡喃葡萄糖14D葡萄糖显示出了比葡萄糖低的溶解性，因而本发明的技术思想令人吃惊。从而，本发明的第二课题在于提供一种新颖的鲨肌醇衍生物。0036解决课题的手段0037如上所述，最近的研究中均主要涉及的是以肌肉肌醇为起始原料通过酶反应转。
18、换为鲨肌醇的方法。在上述任一现有文献中，均未成功构建宿主微生物细胞内的功能性鲨肌醇的从头的生物合成体系，也即未成功确立由葡萄糖等普遍存在的原料直接且以一步法进行鲨肌醇的发酵生产的方法。0038但是，本发明人发现，表达肌醇1磷酸合成酶基因、肌醇单磷酸酶基因、肌肉肌醇脱氢酶基因和鲨肌醇脱氢酶基因的转化体能够由葡萄糖直接地且以一个步骤进行鲨肌醇的发酵生产。本发明人进一步在这样的转化体的培养物中发现了新颖的鲨肌醇衍生物。0039因而，本发明的第一方面在于00401一种鲨肌醇和鲨肌醇衍生物的制造方法，其包括下述工序00411准备转化微生物的工序，该转化微生物保有肌醇1磷酸合成酶基因、肌醇单磷酸酶基因、肌。
19、肉肌醇脱氢酶基因和鲨肌醇脱氢酶基因；和00422在适于上述微生物的生长和/或维持的条件下，使该微生物与葡萄糖或具有葡萄糖单元的二糖类或者多糖类进行接触的工序。0043更特定地说，上述制造方法为使用转化体的鲨肌醇及其衍生物的制造方法，其特征在于，该转化体表达肌醇1磷酸合成酶基因、肌醇单磷酸酶基因、肌肉肌醇脱氢酶基因和鲨肌醇脱氢酶基因。0044上述1的培养物中生产的鲨肌醇衍生物为新颖的化合物，在该衍生物中，葡萄糖与鲨肌醇呈14键合。因而，本发明的一个方式为00452如上述1所述的制造方法，其中，上述鲨肌醇衍生物为下述结构式所表示的化合物0046化10047说明书CN104245950A4/22页7。
20、0048进一步令人吃惊的是，通过增强这样的转化体的肌醇单磷酸酶活性，鲨肌醇生产能力大幅提高。此外，令人预想不到的是，利用该转化体主要生产的是鲨肌醇，肌肉肌醇的生产极少。在本申请优先权日以前的任一现有文献中均未公开或暗示为了该目的而增强肌醇单磷酸酶活性的内容。因而，本发明的第二方面在于00493如上述1或2所述的制造方法，其特征在于，上述转化微生物具有对功能性肌醇单磷酸酶的过剩生产或肌醇单磷酸酶的活化进行诱导的基因重组或变异。0050对于以大肠杆菌为代表的原核微生物来说，由于其迅速的生长能力以及发酵管理的容易性，因而从工业发酵生产的方面考虑是极富魅力的，同时从应用基因重组技术时的实际成绩、可靠的。
21、安全性的方面考虑也具有优点。此外，对于不具有从葡萄糖经肌肉肌醇来生物合成鲨肌醇的通路的多数原核微生物来说，通过使用与基因重组技术联合的合成生物学方法，具有容易调节鲨肌醇生产率的优点。特别是大肠杆菌等原核微生物宿主不具有对作为鲨肌醇生物合成通路中间体的肌肉肌醇的同化能力分解能力，因而更容易应用合成生物学的方法。0051因而，本发明的适宜方式为00524如上述13的任一项所述的制造方法，其特征在于，上述转化微生物来源于不具有肌肉肌醇同化能力的微生物；以及00535如上述14的任一项所述的制造方法，其中，上述转化微生物来源于选自由大肠杆菌、芽胞杆菌属细菌、棒状杆菌属细菌、发酵单胞菌属细菌组成的组中的。
22、细菌。0054关于上述3的适宜方式，无论宿主微生物是否具有内源性肌醇单磷酸酶活性，均可通过肌醇单磷酸酶在该细胞内的过剩生产来增强该细胞的肌醇单磷酸酶活性。可应用各种公知的技术使肌醇单磷酸酶在细胞中过剩生产。因而，本发明包括下式方式00556如上述35的任一项所述的制造方法，其中，上述肌醇单磷酸酶的过剩生产是通过对上述转化微生物进行下述操作而被诱导的0056A导入外来肌醇单磷酸酶基因；0057B增加内源性肌醇单磷酸酶基因的拷贝数；0058C在内源性肌醇单磷酸酶基因的调整区域导入变异；0059D利用高表达诱导性外来调整区域来置换内源性肌醇单磷酸酶基因的调整区域；或者0060E使内源性肌醇单磷酸酶基。
23、因的调整区域缺失；以及00617如上述6所述的制造方法，其中，上述肌醇单磷酸酶的过剩生产是通过对上述转化微生物导入外来肌醇单磷酸酶基因而被诱导的。0062此外，在宿主细胞具有内源性肌醇单磷酸酶基因的情况下，也可利用下述方式来说明书CN104245950A5/22页8增强该细胞的肌醇单磷酸酶活性。因而，本发明包括下述方式00638如上述35的任一项所述的制造方法，其中，上述肌醇单磷酸酶的活化是通过对上述转化微生物进行以下操作而被诱导的0064F在内源性肌醇单磷酸酶基因中导入变异；0065G置换内源性肌醇单磷酸酶基因的一部分或全部；0066H使内源性肌醇单磷酸酶基因的一部分缺失；0067I使降低肌。
24、醇单磷酸酶活性的其它蛋白质减少；0068J使降低肌醇单磷酸酶活性的化合物的生成减少。0069此外，本发明还谋求用于上述鲨肌醇及其衍生物的制造方法的转化体。因而，本发明的另一方面在于00709一种转化微生物，其保有肌醇1磷酸合成酶基因、肌醇单磷酸酶基因、肌肉肌醇脱氢酶基因和鲨肌醇脱氢酶基因。0071此外，本发明第二方面中记载的事项和方式也适用于本发明上述9的转化体。因而它们包括下述方式007210如上述9所述的转化微生物，其特征在于，上述转化微生物进一步具有对功能性肌醇单磷酸酶的过剩生产或肌醇单磷酸酶的活化进行诱导的基因重组或变异；007311如上述9或10所述的转化微生物，其特征在于，上述转化。
25、微生物来源于不具有肌肉肌醇同化能力的微生物；007412如上述911的任一项所述的转化微生物，其中，上述转化微生物来源于选自大肠杆菌、芽胞杆菌属细菌、棒状杆菌属细菌、发酵单胞菌属细菌组成的组中的细菌；007513如上述1012的任一项所述的转化微生物，其中，上述肌醇单磷酸酶的过剩生产是通过对上述转化微生物进行下述操作而被诱导的0076A导入外来肌醇单磷酸酶基因；0077B增加内源性肌醇单磷酸酶基因的拷贝数；0078C在内源性肌醇单磷酸酶基因的调整区域导入变异；0079D利用高表达诱导性外来调整区域来置换内源性肌醇单磷酸酶基因的调整区域；或者0080E使内源性肌醇单磷酸酶基因的调整区域缺失；00。
26、8114如上述13所述的转化微生物，其中，上述肌醇单磷酸酶的过剩生产是通过对上述转化微生物导入外来肌醇单磷酸酶基因而被诱导的；以及008215如上述1012的任一项所述的转化微生物，其中，上述肌醇单磷酸酶的活化是通过对上述转化微生物进行下述操作而被诱导的0083F在内源性肌醇单磷酸酶基因中导入变异；0084G置换内源性肌醇单磷酸酶基因的一部分或全部；0085H使内源性肌醇单磷酸酶基因的一部分缺失0086I使降低肌醇单磷酸酶活性的其它蛋白质减少0087J使降低肌醇单磷酸酶活性的化合物的生成减少。0088本发明进一步的方面涉及一种新颖的鲨肌醇衍生物，该鲨肌醇衍生物被发现在上说明书CN1042459。
27、50A6/22页9述转化体的培养物中生产出。即，本发明还要求008916下述结构式所表示的化合物。0090化200910092本发明的鲨肌醇衍生物可通过能够催化糖苷键的水解反应的酶、例如葡糖苷酶EC32121分解，容易地生成葡萄糖与鲨肌醇。此外，本发明的鲨肌醇衍生物所显示出的高水溶性在这样的酶反应可以是有利的。因而，本发明进一步的其它方面为009317一种鲨肌醇的制造方法，其特征在于，利用能够催化糖苷键的水解反应的酶将上述16的化合物的分解，生成鲨肌醇。0094此外，本发明在于009518一种组合物，其包含鲨肌醇与上述16所述的化合物。0096发明的效果0097根据本发明，能够利用微生物培养技。
28、术有效实现鲨肌醇的工业生产。此外，本发明提供新颖的鲨肌醇衍生物。该衍生物的水溶性极高，因而在生产工序中可提高每批的生产浓度，在制造相关制品时的处理性优异。此外可提高鲨肌醇的工业生产率。附图说明0098图1示出了INO1基因的编码区域序列编号1。0099图2示出了SUHB基因的编码区域序列编号3。0100图3示出了IOLG基因的编码区域序列编号5。0101图4示出了IOLW基因的编码区域序列编号7。0102图5为本发明鲨肌醇衍生物的1HNMR光谱。图中箭头所示的峰为杂质来源的峰。0103图6为本发明鲨肌醇衍生物的13CNMR光谱。0104图7示出了本发明鲨肌醇衍生物利用葡糖苷酶纤维二糖酶进行分解。
29、的示例。具体实施方式0105本发明的第一课题是通过使保有肌醇1磷酸合成酶基因、肌醇单磷酸酶基因、肌肉肌醇脱氢酶基因和鲨肌醇脱氢酶基因的转化微生物在含有葡萄糖或具有葡萄糖单元的二糖类或者多糖类作为碳源的培养基内进行发酵、或者使该转化体与上述碳源接触而得到解决的。即，本发明的转化微生物具有可利用在该微生物内新构建的连续的生物合成通路通过对葡萄糖底物进行一个步骤的发酵而转换为鲨肌醇及其衍生物的能力。0106代表性地，将葡萄糖底物转换成本发明的鲨肌醇或同时生产出的鲨肌醇衍生说明书CN104245950A7/22页10物。下文中，也将这两者一起称为“本发明的鲨肌醇”的生物合成通路包括将葡萄糖底物转换成作。
30、为重要的中间体的肌肉肌醇的部分通路。0107具体地说，在为原核微生物宿主的情况下，可通过下述催化剂活性的表达而使该微生物内用于肌肉肌醇生物合成的部分通路发挥出功能。0108活性1由适当的碳源生成葡萄糖6磷酸的活性；0109活性2将葡萄糖6磷酸转换为肌肉肌醇1磷酸的活性、即肌醇1磷酸合成酶活性；和0110活性3以肌肉肌醇1磷酸为底物的磷酸酶活性。0111但是，由于作为活性1的生成物的葡萄糖6磷酸为微生物普遍产生的代谢中间体，因而不必特意对转化体赋予该活性。此外，对于活性3来说，就本发明人所知，大多数适于通过现有的基因重组方法进行工业生产的原核微生物宿主细胞表达内源性肌醇单磷酸酶、或者具有能够以肌。
31、肉肌醇1磷酸为底物的通用单磷酸酶活性。0112此外，若对活性2进行观察，则多为原核微生物不具有肌醇1磷酸合成酶基因的示例。并且，在肌肉肌醇生物合成反应中，认为肌醇1磷酸合成酶承担控速反应参照专利文献14和15。因而，为了在原核微生物宿主内构建功能性肌肉肌醇生物合成通路，认为在该细胞中导入外来性肌醇1磷酸合成酶基因是十分必要的。0113但是，在与本申请同时进行的日本国专利申请第2011248438号中，本发明人发现，通过增强导入了上述外来性肌醇1磷酸合成酶基因的转化体中的肌醇单磷酸酶活性，肌肉肌醇生产能力令人预想不到地大幅提高。更令人吃惊地发现如后述实施例所述，本发明的转化体通过增强该肌醇单磷酸。
32、酶活性，可极大量且占优势地进行鲨肌醇的生产，而几乎不生产肌肉肌醇，不仅如此，还生产出实质量的本发明的鲨肌醇衍生物。因而，在本发明的转化体中除了导入上述的外来性肌醇1磷酸合成酶基因以外，优选还导入诱导功能性肌醇单磷酸酶的过剩生产或肌醇单磷酸酶的活化的基因重组或变异。0114例如，无论宿主微生物是否具有内源性肌醇单磷酸酶活性，通过在转化微生物细胞内过剩生产肌醇单磷酸酶，均可增强该转化微生物的肌醇单磷酸酶活性。可适宜地通过在该转化微生物中导入外来性肌醇单磷酸酶基因来诱导肌醇单磷酸酶的过剩生产，但并不限定于此。需要说明的是，在本说明书中，使用“外来”或“外来性”这一术语表示的是，在转化前的宿主微生物不。
33、具有要由本发明导入的基因的情况下；在实质上不表达由该基因编码的酶的情况下；以及该酶的氨基酸序列由不同的基因编码、但在转化后不表达相匹配的内源性酶活性的情况下，向宿主中导入基于本发明的基因或核酸序列。0115接下来，对于本发明的转化体、即具有可对葡萄糖底物进行转换直至为鲨肌醇或同时生产的鲨肌醇衍生物的连续生物合成通路的转化微生物赋予下述催化剂活性。0116活性4将肌肉肌醇转换为2酮肌肉肌醇肌肉肌醇单酮；2,3,4,5,6五羟基环己烷1酮的酶活性；和0117活性5将2酮肌肉肌醇转换为鲨肌醇的酶活性。0118作为具有上述活性4的酶，例如可以举出在NAD的存在下对肌肉肌醇进行氧化的肌肉肌醇脱氢酶酶编号。
34、EC11118。另外，作为具有上述活性5的酶，例如可以举出在NADP的存在下对鲨肌醇进行氧化的鲨肌醇脱氢酶。即，可用于本发明的鲨肌醇脱氢酶例如可在NADPH的存在下将2酮肌肉肌醇转换为鲨肌醇。这些酶的详细内容如下述。说明书CN104245950A108/22页110119本发明的转化体可使用各种宿主微生物细胞来制作。特别是在以原核微生物为宿主时，由于能够在该宿主细胞内新构建本发明的鲨肌醇的生物合成通路即，无现有的内源性通路的影响，因而在合成生物学方法的应用中是极富魅力的。所示例出的原核微生物为埃希氏菌、假单胞菌、芽胞杆菌、地芽胞杆菌、甲烷单胞菌、甲基芽孢杆菌、嗜甲基菌、精朊杆菌、甲基球菌、棒状。
35、杆菌、短杆菌、发酵单胞菌和李斯特氏菌属的细菌。在工业发酵生产中适宜的原核微生物的非限定性示例包括大肠杆菌、芽胞杆菌属细菌、棒状杆菌属细菌、发酵单胞菌属细菌。大肠杆菌由于其迅速的生长能力和发酵管理的容易性的原因，为特别优选的宿主微生物的示例。此外，能够作为本发明的宿主细胞使用的细胞株可以为通常含义下的野生型，或者也可以为营养要求性变异株、抗生素耐性变异株。进一步地，能够作为本发明的宿主细胞使用的细胞株可以已经被转化从而使之具有与上述变异相关的各种标记基因。这些变异或基因能够提供对于本发明转化体的制作维持管理有益的性质。也优选通过使用对于氯霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、四环素等抗生素显示出耐性的菌株。
36、来简便地进行本发明鲨肌醇的生产。0120如上所述，本发明的转化体应该具有的鲨肌醇生物合成通路包括用于将葡萄糖底物转换成作为重要的中间体的肌肉肌醇的部分通路。进一步地，如上所述，由于肌醇1磷酸合成酶被认为在肌肉肌醇的生物合成中承担控速反应，因而在本发明的转化体中，作为第一生物活性，要求表达肌醇1磷酸合成酶。特别是由于原核微生物中不具有肌醇1磷酸合成酶基因的示例较多，因而通常将外来性肌醇1磷酸合成酶基因可表达地导入到本发明的转化体的细胞内。肌醇1磷酸合成酶基因为已知的例如，基因库登录号NOSAB032073、AF056325、AF071103、AF078915、AF120146、AF207640、。
37、AF284065、BC111160、L23520、U32511，它们均可使用。特别是酵母来源的INO1基因序列编号1是广为人知的肌醇1磷酸合成酶基因的示例，也能够在本发明中适当地使用。但是，能够在本发明转化体的制作中使用的肌醇1磷酸合成酶基因并不限于酵母来源的基因，其可来源于其它真核微生物或此外的生物、也可以为人工合成的基因，只要在上述宿主微生物细胞内能够实质性地表达肌醇1磷酸合成酶活性即可。0121从而，对于能够用于本发明目的的肌醇1磷酸合成酶基因，只要在上述转化微生物内能够实质性地表达肌醇1磷酸合成酶活性，可以具有能够在自然界发生的全部变异、或者具有人工导入的变异和修饰。例如，已知在编码特。
38、定氨基酸的各种密码子中存在冗余密码子REDUNDANCY。因此，在本发明中也可利用最终可翻译成相同氨基酸的代替密码子。即，由于基因编码的简并，因而编码某一特定氨基酸时可使用2个以上的密码子，因此氨基酸序列可利用任意的1组类似的DNA低聚核苷酸进行编码得到。虽然仅该组唯一的成员与天然型酶的基因序列相同，但即使是不匹配的DNA低聚核苷酸，在适当的严谨条件下例如，3XSSC、68杂交、2XSSC、01SDS和68清洗也能够与天然型序列杂交，能够对编码天然型序列的DNA进行鉴定、分离，进一步还可将这样的基因用于本发明中。特别是已知大部分生物优选使用特定密码子最佳密码子的子集GENE,VOL105,PP。
39、6172,1991等，因而根据宿主微生物进行“密码子最佳化”是有用的。0122并且，在本发明的转化体的制作中，也可通过将肌醇1磷酸合成酶基因以“表达盒”的形式导入到宿主微生物细胞内来更稳定地得到高水平的肌醇1磷酸合成酶活性，这对本领域技术人员来说是可以理解的。在本说明书中，“表达盒”是指含有与表达对象的核说明书CN104245950A119/22页12酸或表达对象的基因功能性结合的对于转录和翻译进行调节的核酸序列的核苷酸。代表性地，本发明的表达盒以功能性结合的状态在编码序列的5上游含有启动子序列、在3下游含有终止子序列、根据情况进一步含有通常的调节元件，在这样的情况下，表达对象的核酸或表达对象。
40、的基因被可表达地导入到宿主微生物中。0123关于启动子，不论是结构性启动子还是调节启动子，均被定义为使RNA聚合酶与DNA结合、引发RNA合成的DNA序列。强启动子是指高频引发MRNA合成的启动子，也适于用于本发明的转化体制作中。可根据该宿主细胞的性质等使用LAC系、TRP系、TAC或TRC系、噬菌体的主要操纵子和启动子区域、FD包覆蛋白质的调节区域、针对糖酵解系酶例如，3磷酸甘油酸激酶、甘油醛3磷酸脱氢酶、谷氨酸脱羧酶A、丝氨酸羟甲基转移酶的启动子等。除了启动子和终止子序列以外，可作为其它调节元件的示例举出的序列为选择标记、扩增信号、复制起点等。适宜的调节序列例如记载于“GENEEXPRES。
41、SIONTECHNOLOGYMETHODSINENZYMOLOGY185”,ACADEMICPRESS1990中。0124上述说明的表达盒嵌入到例如由质粒、噬菌体、转座子、IS元件、噬粒、粘粒、或者线状或环状DNA等构成的载体中，使其插入到宿主微生物中。优选质粒和噬菌体。这些载体在宿主微生物中可自体复制，也可通过染色体复制。适宜的质粒例如为大肠杆菌的PLG338、PACYC184、PBR322、PUC18、PUC19、PKC30、PREP4、PHS1、PKK2233、PDHE192、PHS2、PPLC236、PMBL24、PLG200、PUR290、PINIII113B1、GT11或PBDCI。
42、；杆菌的PUB110、PC194或PBD214；棒状杆菌属的PSA77或PAJ667等。除它们以外，能够使用的质粒等还记载于“CLONINGVECTORS”,ELSEVIER,1985中。表达盒向载体中的导入可通过包括利用适当的限制酶切割、克隆化以及连接的惯用方法进行。0125在构建出上述那样的具有表达盒的载体后，作为将该载体导入到宿主微生物中时能够适用的方法，例如使用共沉淀、原生质体融合、电穿孔、逆转录病毒转染等惯用的克隆化法和转染法。它们的示例记载于“分子生物学的最新实验计划CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY”，FAUSUBEL等，PUBLWILEYINT。
43、ERSCIENCE，NEWYORK，1997；或SAMBROOK等，“分子克隆实验室手册”，第2版，COLDSPRINGHARBORLABORATORY，COLDSPRINGHARBORLABORATORYPRESS，COLDSPRINGHARBOR，NY，1989中。0126接下来，本发明的转化体所应具有的第二生物活性为肌醇单磷酸酶活性。该肌醇单磷酸酶活性也被要求用于将葡萄糖底物转换为中间体肌肉肌醇。但是，如上所述，大多数适于通过现有的基因重组方法进行工业生产的原核微生物宿主细胞表达内源性肌醇单磷酸酶、或者具有能够以肌肉肌醇1磷酸为底物的通用单磷酸酶活性，因而多数情况下，不必特意在本发明的转。
44、化体中导入该酶活性。但是，进一步特别优选本发明的转化体表现出增强的肌醇单磷酸酶活性。也即，令人预想不到地发现，本发明的鲨肌醇生产性转化体通过增强该肌醇单磷酸酶活性，可极大量且占优势地进行鲨肌醇的生产、同时几乎不生产肌肉肌醇，不仅如此，还显著生产出鲨肌醇衍生物。因而，本发明的适宜方面包括在鲨肌醇生产性转化体内进行肌醇单磷酸酶的过剩生产。0127对于本发明中谋求的肌醇单磷酸酶，除了对肌醇1磷酸显示出高底物特异性以外，还显示出了可作用于广泛的底物的磷酸单酯水解酶活性，从而包括实质上能够水解肌醇1磷酸的蛋白质。作为代表性的肌醇单磷酸酶，例如已知有肌醇1单磷酸酶，大量生物来源的该基因SUHB基因在基因库。
45、登录号NOSZP04619988、YP001451848等中说明书CN104245950A1210/22页13公布。特别是大肠杆菌来源的SUHB基因序列编号3AAC75586MG1655的使用在以大肠杆菌为宿主细胞的情况下较为便利。0128本发明的转化体所应具有的第3生物活性为肌肉肌醇脱氢酶活性。该酶代表性地通过以下反应在NAD的存在下将肌肉肌醇转换为2酮肌肉肌醇。0129化301300131各种肌肉肌醇脱氢酶基因为已知的、且可进行利用。例如，在日本特开平67158号公报中记载了在NAD的存在下可将肌肉肌醇转换为2酮肌肉肌醇的芽胞杆菌属细菌来源的酶EC11118及其编码化核酸序列。此外，在专利。
46、文献5中还公开了NAD非依赖性肌肉肌醇脱氢酶，该酶也可用于本发明的转化体的制作。特别是枯草杆菌NBRC13719株来源的IOLG基因下述序列编号5的使用较为便利。0132化401330134本发明的转化体所应具有的第4生物活性为鲨肌醇脱氢酶活性。该酶代表性地说明书CN104245950A1311/22页14通过下述反应在NADP的存在下将鲨肌醇转换为2酮肌肉肌醇，而在NADPH的存在下将2酮肌肉肌醇选择性地还原为鲨肌醇。在本发明的转化体内应用后者的反应。0135化501360137各种鲨肌醇脱氢酶基因为已知的、且可进行利用。在专利文献5中公开了大肠杆菌、醋酸杆菌属细菌、芽胞杆菌属细菌、农杆菌属。
47、细菌、黄单胞菌属细菌的鲨肌醇脱氢酶和相关的氨基酸序列。特别是枯草杆菌NBRC13719株来源的IOLW基因下述序列编号7的使用较为便利。0138化601390140本领域技术人员容易理解，在肌醇1磷酸合成酶基因中记载的变异、修饰和密码子最佳化以及表达盒、启动子等调节序列和质粒等以及基于此的转化的说明对于上述肌说明书CN104245950A1412/22页15醇单磷酸酶基因、肌肉肌醇脱氢酶基因和鲨肌醇脱氢酶基因也是全部适用的。因而，本发明的转化体保有包含编码肌醇1磷酸合成酶的核酸的表达盒、包含编码肌肉肌醇脱氢酶的核酸的表达盒、以及包含编码鲨肌醇脱氢酶的核酸的表达盒这3个表达盒，这种情况下，本发明。
48、的转化体中存在内源性肌醇单磷酸酶基因。本发明的适宜的转化体保有包含具有序列编号1所表示的核苷酸序列的核酸的表达盒、包含具有序列编号5所表示的核苷酸序列的核酸的表达盒、以及包含具有序列编号7所表示的核苷酸序列的核酸的表达盒。0141上述3个表达盒可以配置在1个载体上被转染至宿主微生物中。或者可以将配置有其中任意2个表达盒的载体与配置有剩下的表达盒的载体共转染至宿主微生物中，还可以将配置有各个表达盒的3个载体共转染至宿主微生物中。进一步地，也可以将上述3个表达盒之中的任意一个以上插入到宿主微生物的基因组中，剩下的表达盒以质粒的形式存在于该转化体内。例如，也可将配置有包含编码肌肉肌醇脱氢酶的核酸的表。
49、达盒和包含编码鲨肌醇脱氢酶的核酸的表达盒的质粒转染到通过在染色体上插入包含编码肌醇1磷酸合成酶的核酸INO1的表达盒而得到的大肠杆菌AKC017株于2011年10月25日以FERMP22180保藏于独立行政法人产品评价技术基础机构专利生物保藏中心。国际保藏编号FERMBP11513中。0142进一步地，如反复记载的那样，本发明的转化体特别优选显示出增强的肌醇单磷酸酶活性。因而，本发明的转化体除了保有上述3个表达盒以外，还优选保有包含编码肌醇单磷酸酶的核酸的表达盒。因而，作为更适宜的本发明的转化体，可以举出保有下述表达盒的转化体包含具有序列编号1所表示的核苷酸序列的核酸的表达盒、包含具有序列编号3所表示的核苷酸序列的核酸的表达盒、包含具有序列编号5所表示的核苷酸序列的核酸的表达盒、以及包含具有序列编号7所表示的核苷酸序列的核酸的表达盒。0143上述4个表达盒可以配置在1个载体上被转染至宿主微生物。或者可以将配置有其中任意2个以上的表达盒的载体与配置有剩下的表达盒的载体共转染至宿主微生物中，还可以将配置有各个表达盒的4个载体共转染至宿主微生物中。进一步地，也可以将上述4个表达盒中的任意之一以上插入到宿主微生物的基因组中，剩下的表达盒以质粒的形式存在于该转化体内。例如，也可将配置有包含编码肌肉肌醇脱氢酶的核酸的表达。