一种胸腹水癌细胞快速检测蛋白芯片及其制备方法 【技术领域】
本发明属于生物医学技术领域，涉及一种蛋白芯片及其制备方法，特别是一种胸腹水癌细胞快速检测蛋白芯片及其制备方法。
背景技术
对胸腹水中癌细胞进行病理诊断是长期困扰病理学家的一个难题，特别是当胸腹水中间皮细胞增生明显时，在形态上常常与分化良好的癌细胞非常相似，极易混淆，给病理诊断带来了很大的困难，即使是具有丰富临床经验的病理学家也有可能出现误诊，这也是目前国际细胞病理学界的一个难题。
对于胸腹水中间皮细胞与癌细胞的鉴别，以往最为有效地解决方法是通过免疫组化染色区分间皮细胞和癌细胞。目前公知的检测鉴别方法有两种：一种是直接在细胞涂片上进行免疫组化染色，但是这种方法存在以下缺点，首先是由于细胞涂片不象组织切片那样具有可复制性，每一张细胞涂片上面的细胞成分及分布都不尽相同，因此不能保证每一张涂片上都有癌细胞，其次由于涂片范围广泛，抗体需要量较大，费用昂贵；再一种方法是细胞石蜡包埋法，即将胸腹水细胞离心收集后用琼脂糖或蛋青等包埋，然后制成石蜡块，利用石蜡切片进行免疫组化染色，进而对癌细胞及间皮细胞进行鉴别诊断，虽然这种方法诊断率较高，但其鉴别诊断的过程复杂，耗时较长，且同样存在免疫组化费用昂贵的问题。正因如此，目前这两种方法均未获得病理医师的普遍认可，故也未能在临床病理工作中得到推广使用。
专利号为03111532.2的申请文本曾披露了一种名称为《自动捕获、识别细胞生物芯片及其制备方法》的生物芯片技术，这种生物芯片虽然能够检测并自动捕获胸腹水中的癌细胞，在一定程度上具有鉴别胸腹水癌细胞与间皮细胞的作用，但是其芯片制备技术要求较高，芯片上的点样蛋白稳定性差，易于降解，运输、保存条件要求较高，而且点样蛋白一旦降解、失效，使用时便再也无法检测到胸腹水中的癌细胞，因此应用受到限制，难以在临床病理诊断中推广使用。
正是基于上述现有技术存在的问题，目前本领域迫切需要开发出一种稳定性好、高通量、省时、价廉的胸腹水癌细胞检测方法，以满足临床病理诊断工作的需要。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种能够快速准确地对胸腹水中的癌细胞与间皮细胞进行鉴别诊断的胸腹水癌细胞快速检测蛋白芯片及其制备方法，以解决目前胸腹水癌细胞病理诊断存在的难题。
本发明制品的技术方案是这样的：该胸腹水癌细胞快速检测蛋白芯片具有一个作为固体基质的玻片，在玻片表面不同位置处通过点阵方式结合分布有由多种类型胶体金标记的抗肿瘤抗原特异性抗体。其中，结合在玻片上的抗肿瘤抗原特异性抗体包括癌胚抗原(CEA)、糖类抗原(CA19-9)、糖类抗原(CA125)、上皮特异性抗原(ESA)和/或上皮膜抗原抗体(EMA)等；所说的玻片为醛基化处理的玻片。
用于制备该快速检测蛋白芯片的方法包括下述的制备步骤：
a、采用枸橼酸三钠还原法制备胶体金：取0.01％的HAuCl4(四氯金酸)水溶液100ml，加热煮沸后，加入1％枸橼酸三钠(Na3C6H5O7·2H2O)水溶液0.75～3ml，加热煮沸30分钟，制备出10～50nm粒径大小的胶体金颗粒；
b、胶体金标记抗体：将待标记蛋白质置入透析袋内后直接放入双蒸馏水中透析，然后4℃离心60分钟，取上清液，调整蛋白质浓度至1mg/ml即可用于标记；通过光电比色法确定标记蛋白最适稳定量为30～60μg/ml，调节金溶胶pH至6.0～9.0，在金溶胶中加入最适稳定量的蛋白质溶液，离心后将沉淀物溶于PEG2000缓冲液中，制成胶体金标记抗体；
c、在已准备好的醛基玻片上点样，点的大小为100～300um，两点之间间隔5～30mm，点好的芯片经水化烘干后用PBS(磷酸缓冲液)冲洗，再用1％的BSA(封闭液)封闭1小时，再用PBS冲洗，吹干后即制得胸腹水癌细胞快速检测蛋白芯片。
临床应用中，胸腹水脱落细胞悬液与芯片共孵育后，胸腹水中癌细胞会与芯片中相应特异性抗体结合，通过显微镜即可以观察到结合的癌细胞，从而达到快速检测、诊断癌性胸腹水的目的。与现有技术相比，本发明的优越性在于：作为一种胸腹水癌细胞快速检测蛋白芯片，它能够快速、准确地对胸腹水中癌细胞与间皮细胞进行鉴别诊断，同时因为蛋白是由胶体金标记，因此相比于以往的蛋白芯片，本蛋白芯片具有蛋白结合牢固、稳定性好、不易降解，适合室温运输和保存以及高通量、省时、价廉等特点，同时因为胶体金颗粒在普通光学显微镜下可见，因此通过观察胶体金颗粒可以确定标记蛋白的存在，具有自身对照作用。
【具体实施方式】
醛基化玻片制作胸腹水癌细胞快速检测蛋白芯片的实施例：
1、采用枸橼酸三钠还原法制备胶体金：取0.01％的HAuCl4水溶液100ml，加热煮沸后，搅动下加入1％的枸橼酸三钠水溶液1.25～2.5ml，加热煮沸30分钟，制备出10～50nm粒径大小的胶体金颗粒；
2、胶体金标记抗体：将待标记的蛋白质置入透析袋内后直接放入双蒸馏水中透析，然后在温度为4℃的条件离心60分钟，取上清液，调整蛋白质浓度至1mg/ml即可用于标记；通过光电比色法确定标记蛋白最适稳定量为40～50μg/ml，调节金溶胶pH至7.5～8.5，在金溶胶中加入最适稳定量的蛋白质溶液，离心60分钟，离心后将沉淀物溶于PEG2000缓冲液中，制成胶体金标记抗体；
3、在已准备好的醛基玻片上点样，点的大小为100～300um，两点之间间隔5～30mm，点好的芯片经水化烘干后用PBS冲洗，再用1％的BSA封闭1小时，继而再用PBS冲洗，吹干后即制得胸腹水癌细胞快速检测蛋白芯片。
本发明的使用方法包括以下步骤：
(1)细胞收集：3000转/分钟离心胸腹水脱落细胞5分钟，然后收集细胞，用PBS洗涤细胞3次，调整细胞浓度为2×107/L并重悬细胞；
(2)细胞孵育：将细胞悬液滴在芯片上，37℃湿盒中孵育30分钟；
(3)用PBS洗涤芯片3次，洗去未结合细胞；
(4)固定细胞：10％福尔马林固定细胞5分钟；
(5)显微镜观察：HE染色，镜下观察癌细胞形态。