新型内切-β-1，4-葡聚糖酶 新型内切-β-1，4-葡聚糖酶 本发明涉及一种呈内切-β-1，4-葡聚糖酶活性的酶，该酶属糖基水解酶家族9并与地衣芽孢杆菌家族9的内切-β-1，4-葡聚糖酶至少有75％的同源，本发明还涉及编码此种内切-β-1，4-葡聚糖酶的分离多核苷酸分子以及此酶在洗涤剂、造纸和纸浆、石油钻探、石油提取、酒和果汁、食品成分、动物饲料或纺织品工业中的应用。发明背景
纤维素是由β-1，4葡糖苷键连接的葡萄糖多聚体。纤维素链形成许多分子内和分子间的氢键，这导致了不溶性纤维素微纤维的形成。从纤维素到葡萄糖的微生物水解涉及以下三种主要种类的纤维素酶：(I)内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)，它随机切割整条纤维素分子的β-1，4葡糖苷键；(ii)纤维二糖水解酶(EC3.2.1.91)，它从非还原端消化纤维素，释放纤维二糖；以及(iii)β-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)，它水解纤维二糖和低分子量纤维糊精，从而释放葡萄糖。
纤维素酶由许多微生物所产生并经常以多种形式出现。对纤维素酶促降解的经济学重要性的认识促进了对可工业化应用的微生物纤维素酶的广泛搜寻。结果有许多纤维素酶的酶促特性和一级结构已得到研究。以催化结构域氨基酸序列的疏水簇分析结果为基础，这些纤维素酶已被分为不同的糖基水解酶家族；真菌和细菌糖基水解酶已被划分成35个家族(Henrissat等(1991)、(1993))。大部分纤维素酶由纤维素结合结构域(CBD)和催化结构域(CAD)组成，它们之间由富脯氨酸和疏水氨基酸残基的接头分隔。纤维素地另一分类法也已建立，该方法基于它们CBD的相似性(Gilkes等(1991))，给出了糖基水解酶的5个家族(I-V)。
纤维素酶由许多微生物合成，包括真菌、放线菌、粘细菌和真细菌，也可由植物合成。特别是多种特性的内切-β-1，4-葡聚糖酶已得到鉴定。许多细菌内切葡聚糖酶已在文献中有所描述(Henrissat(1993)；Gilbert等，(1993))。
纤维素水解酶的一个重要工业用途是用于处理纸浆，如改善滤水或再生纸的脱墨。纤维素水解酶的另一重要工业用途是处理纤维素纺织品或织物，如作为洗涤剂组合物或织物柔顺剂组合物的成分，用于新织物(成衣)的生物上光，及用于达到含纤维素织物的石洗外观，尤其是粗斜纹棉布。有关这些处理的许多方法也已在文献中提出，如GB-A-1 368 599、EP-A-0 307 564和EP-A-0 435 876、WO91/17243、WO91/10732、WO91/17244、PCT/DK95/000108如PCT/DK95/000132。
对于提供新纤维素酶或酶制品的需要总是存在的，这些纤维素酶和酶制品可用于需要纤维素酶，优选内切-β-1，4-葡聚糖酶(EC3.2.1.4)活性的应用中。
本发明的目的是提供新型酶和酶组合物，它们在弱酸性到碱性条件下具有真正的纤维素分解活性，并且在纸浆加工、纺织品处理、洗衣过程、提取过程或动物饲养中的性能有所改进；优选此新的性能良好的内切葡聚糖酶是通过重组技术可高产的或是通过重组技术高产的。发明概述
本发明人已经发现了具真正纤维素水解活性的新酶，即内切-β-1，4-葡聚糖酶(按酶的命名法分类为EC3.2.1.4)，此酶是地衣芽孢杆菌内在的，属于糖基水解酶第九家族，发明人还成功克隆和表达了编码此酶的DNA序列。
因此，本发明第一方面涉及呈现内切-β-1，4-葡聚糖酶活性(EC3.2.1.4)的酶，它选自以下多肽：(a)SEQ ID NO：1第76-1455位DNA序列编码的多肽；(b)在表达DNA序列的条件下培养含SEQID NO：1之序列的细胞而产生的多肽；(c)含有与SEQ ID NO：2多肽的第26-485位氨基酸序列具至少75％同一性的序列的内切-β-1，4-葡聚糖酶，所述多肽含有由SEQ ID NO：2的第26-485位氨基酸序列所衍生的氨基酸序列，其同一性通过GCG程序包提供的GAP程序确定，用如下设置：GAP产生罚分为3.0，GAP延伸罚分为0.1；和(d)由可得自大肠杆菌DSM12805内质粒中的内切葡聚糖编码部分DNA序列编码的多肽。如同Henrissat等人所定义的，本发明的酶经鉴定属于糖基水解酶第九家族。
本发明第二方面涉及编码呈内切-β-1，4-葡聚糖酶活性的酶催化活性结构域的分离多核苷酸分子，优选DNA分子，该分子选自：a)含SEQ ID NO：1第76-1455位核苷酸序列的多核苷酸分子，b)a)的物种类似物；c)所编码多肽与SEQ ID NO：2第26-485位氨基酸具至少75％同一性的多核苷酸分子，和d)a)或b)的简并核苷酸序列；优选在中度严谨条件下能与变性双链DNA探针杂交的多核苷酸分子，其中的探针可以是含SEQ ID NO：1第76-1455位所示序列的DNA探针，或含SEQ ID NO：1第76-1455位的亚序列、长度至少约为100个碱基对的DNA探针。
含编码本发明内切葡聚糖之DNA序列的质粒pSJ1678已被转化入大肠杆菌菌株，该菌株由本发明人按用于专利程序的微生物保藏国际公认的布达佩斯条约保藏于Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1b，D-38124Braunschweig，德意志联邦共和国，保藏日1999年5月14日，保藏号DSM12805。
本发明的第三、四和五方面是提供了含DNA区段的表达载体，该DNA区段是例如，本发明的多核苷酸分子；含所述DNA区段或表达载体的细胞；以及生产呈纤维素水解活性的酶的方法，该方法包括在允许酶产生的条件下培养细胞并从培养物中回收此酶。
本发明的另一方面提供了呈纤维素水解活性的分离酶，其特征在于(I)无同源杂质和(ii)酶由上述方法产生。
此外，本发明涉及本发明的这些酶或酶制品在工业应用中的用途，诸如木质纸浆的处理或生物质的降解。
本发明还涉及大肠杆菌菌株DSM12805或所说大肠杆菌菌株任何突变体的分离的基本上纯的生物培养物，其中含克隆入大肠杆菌DMS12805中质粒pSJ1678的内切葡聚糖编码DNA序列，该DSM12805来自地衣芽孢杆菌菌株。
由于对CMC具高比活性(内切葡聚糖酶)，且与大部分其它内切葡聚糖酶相反，本发明的酶能降解高度结晶的纤维素，所以本发明的内切葡聚糖酶在许多工业应用中是有益的。此外，此酶最适温度是60℃，在pH5.5-9.5之间完全有活性。因此，本发明的酶可方便地用于总生物质降解中，其中通常需要纤维二糖水解酶(其对CMC具有很少的活性)和内切葡聚糖酶。发明详述
此处所用术语“糖基水解酶家族”可参见文献Henrissat，B.“基于氨基酸序列相似性进行的糖基水解酶分类”生化杂志(Biochem.J.)280：309-316(1991)；Henrissat，B.，Bairoch，A.“基于氨基酸序列相似性进行的糖基水解酶分类中的新家族”生化杂志(Biochem.J.)293：781-788(1993)；Henrissat，B.，Bairoch，A.“更新基于序列的糖基水解酶分类”生化杂志316：695-696(1996)；以及Davies，G.，Henrissat，B.“糖基水解酶的结构和机制”结构3：853-859(1995)；所有上述文献均收编于此作为参考。
术语“功能性酶促特性”用于此处是指呈一种或多种催化活性的多肽的物理和化学特性。功能性酶促特性的例子是酶活性、酶促比活性、与最大活性相比的相对酶活性(作为pH或温度的函数检测)、稳定性(酶活随时间的降解)、DSC融化温度、N-末端氨基酸序列、分子量(通常在SDS-PAGE上检查)、等电点(pI)。
在本篇上下文中，术语“表达载体”指含目的多肽编码区段及与其可操作相连提供其转录的额外区段的线性或环状DNA分子。这些额外区段可能包括启动子和终止子序列，并可选择性地包括一个或多个复制起点、一个或多个选择标记、增强子、聚腺苷酸化信号，等等。表达载体通常来源于质粒或病毒DNA，或可包括二者的元件在内。本发明的表达载体可以是任何便于进行重组DNA操作的表达载体，载体的选择常决定于它将引入的宿主细胞。因而，该载体可为自主复制型载体，即作为一染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体的复制，如质粒。或者，载体可以是这样一种形式，当将其引入宿主细胞时，可以整合入宿主细胞基因组中并与其整合入的染色体一起复制。
此处有关多肽或蛋白质表达时所用的术语“重组体表达”或“重组表达”是按本领域的标准定义限定的。蛋白质的重组表达通常是利用上文刚提到的表达载体进行的。
当用于多核苷酸分子时，术语“分离的”表示多核苷酸已脱离天然环境因而无其它外源或不希望有的编码序列，它处于适用于基因工程蛋白质生产系统的形式。这种分离分子是那些分离自其天然环境的分子，包括cDNA和基因组克隆。本发明的分离DNA分子不合通常与它们相关的其它基因，但可以包括诸如启动子和终止子之类的天然5′和3′非翻译区。相关区域的鉴定对本领域常规技术人员将是明显的(见例如Dynan和Tijan，自然316：774-78，1985)。术语“分离的多核苷酸”或者可称为“克隆的多核苷酸”。
当用于蛋白质/多肽时，术语“分离的”表明该蛋白质处于非其天然环境下的状态。在优选的形式中，该分离的蛋白质基本上不合其它蛋白质，尤其是无其它同源蛋白质(即“同源杂质”(见下文))。优选提供纯度高于40％的蛋白质，更优选提供纯度超过60％的蛋白质。
甚至更优选提供高度纯化形式的蛋白质，即用SDS-PAGE测定纯度高于80％，更优选纯度高于95％，还更优选纯度高于99％。
术语“分离的蛋白质/多肽”或者可称为“纯化的蛋白质/多肽”。
术语“同源杂质”意指来自最初得到本发明多肽的同源细胞的任何杂质(如除本发明多肽之外的其它多肽)。
此处所用与特定微生物来源相关的术语“获自”指由该特定来源产生的多核苷酸和/或多肽，或由已插入此来源的基因的细胞产生的多核苷酸和/或多肽。
当指DNA区段时，术语“可操作连接”表示各区段被连接在一起的方式使得它们所起作用与它们原预期目的一致，如转录起始于启动子，通过编码部分直到终止子。
术语“多核苷酸”表示以5′到3′末端阅读的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链多聚体。多核苷酸包括RNA和DNA，可分离自天然来源、体外合成或制备自天然和合成分子联合体。
术语“多核苷酸分子的互补物”是指与参照序列相比具互补碱基序列并反向的多核苷酸分子。例如，序列5′ATGCACGGG3′与5′CCCGTGCAT3′互补。
术语“简并核苷酸序列”是指包括一个或多个简并密码子(与编码多肽的参照多核苷酸分子相比)的核苷酸序列。简并密码子包括不同的核苷酸三联体，但编码相同的氨基酸残基(即，GAU和GAC三联体均编码天冬氨酸)。
术语“启动子”表示基因的一部分，它所包括的DNA序列可用于结合RNA聚合酶并起始转录。启动子序列通常，但并非总是，存在于基因的5′非编码区。
术语“分泌信号序列”表示编码多肽(“分泌肽”)的DNA序列，该多肽作为更大多肽的一个组分，可指导该更大多肽穿过合成它的细胞的分泌途径。在通过分泌途径的时候，该更大的肽通常被裂解去除了分泌肽。多核苷酸：
在本发明优选实施例中，本发明的分离多核苷酸在至少是中度严格条件下可与SEQ ID NO：1之相似大小区域或其互补序列杂交。
具体地说，本发明的多核苷酸在至少是中度严格条件下、优选如下详述的高度严格条件下可与下述变性双链DNA探针杂交：包含SEQID NO：1第76-1455位所示序列的酶的催化结构域全长编码序列的探针，或含SEQ ID NO：1至少长为约100个碱基对的亚序列的任何探针。测定中度或高度严格条件下核苷酸探针和同源DNA或RNA序列之间杂交情况的合适实验条件包括将含有需杂交之DNA片段或RNA的滤膜预浸泡于5×SSC(氯化钠/柠檬酸钠，Sambrook等，1989)10分钟，并于5×SSC、5×Denhardt’s溶液(Sambrook等，1989)、0.5％SDS和100μg/ml变性的超声处理鲑精DNA(Sambrook等，1989)的溶液中预杂交该滤膜，然后在含10ng/ml随机引发的(Feinberg，A.P.和Vogelstein，B.(1983)，分析生物化学(Anal.Biochem.)132：6-13)、32P-dCTP标记的(比活性高于1×109cpm/μg)探针的同样溶液中约45℃杂交12小时。滤膜随后在2×SSC、0.5％SDS中洗两次，每次30分钟，洗涤温度至少60℃(中度严格条件)，更优选至少65℃(中/高度严格条件)，还更优选至少70℃(高度严格条件)，更优选至少75℃(极高严格条件)。
用X-射线胶片检测在这些条件下与寡核苷酸探针能杂交上的分子。
如前面所提到的，本发明的分离多核苷酸包括DNA和RNA。分离DNA和RNA的方法在本领域是众所周知的。可用本领域已知方法从基因库或DNA文库中克隆编码目的基因的DNA和RNA。
随后用例如杂交或PCR方法鉴定和分离编码本发明具内切葡聚糖酶活性的多肽的多核苷酸。
本发明进一步提供了来自不同细菌菌株的多肽和多核苷酸对应物(直向同系物(ortholog)或共生同系物(paralog))。特别感兴趣的是来自革兰氏阳性嗜碱菌株，包括芽孢杆菌属菌株的内切葡聚糖酶多肽。
将本发明提供的信息和组合物与常规克隆技术相结合可克隆本发明具内切葡聚糖酶活性的多肽的物种同系物。例如，本发明的DNA序列可用来自表达该蛋白质的细胞类型的染色体DNA进行克隆。可用按此处公开序列设计的探针通过探测RNA印迹鉴别DNA的合适来源。随后从阳性细胞系的染色体DNA制备文库。编码具内切葡聚糖酶活性之多肽的本发明DNA序列可随后用各种方法分离，诸如用按本说明书和权利要求书中公开序列设计的探针进行探测，或用基于公开序列的一套或多套简并探针进行探测。本发明的DNA序列也可采用聚合酶链式反应或PCR(Mullis，美国专利号4,683,202)，用设计自本文公开序列的引物进行克隆。在另外的方法中，可用DNA文库转化或转染宿主细胞，并用针对内切葡聚糖酶的抗体(单克隆或多克隆抗体)检测目的DNA的表达，该内切葡聚糖酶克隆自地衣芽孢杆菌ATCC 14580，按材料和方法及实施例1和3中所述方法表达和纯化；或者可通过涉及有内切葡聚糖酶活性的多肽的活性测定检测目的DNA的表达。
克隆入大肠杆菌DSM12805内质粒pSJ1678中之DNA序列的内切葡聚糖酶编码部分和/或本发明的类似DNA序列可克隆自地衣芽孢杆菌菌株或上述另一或相关微生物，优选菌株ATCC14580，其产生具有内切葡聚糖酶活性的酶。
或者，序列类似物可通过以下方式构建：以可获自大肠杆菌菌株DSM12805质粒的DNA序列(被认为与所附的SEQ ID NO：1相同)为基础，如是其亚序列，和/或通过引入DNA序列所编码的内切葡聚糖酶氨基酸序列不变但与预计用于酶产生的宿主微生物密码子用法相一致的核苷酸取代，或通过引入可能导致不同氨基酸序列的核苷酸取代(即本发明的酶变体)。
或者，按照众所周知的步骤，通过使用以能获自大肠杆菌DSM12805中质粒的DNA序列为基础而制备的合成寡核苷酸探针，编码本发明内切葡聚糖酶的DNA可方便地克隆自合适的来源，诸如任何下述生物。
如何使用本发明序列来得到其它的相关序列：本文所公开涉及编码本发明内切-β-1，4-葡聚糖酶之多核苷酸序列的序列信息可用作工具来鉴别其它的同源内切葡聚糖酶。例如，可用聚合酶链式反应(PCR)扩增编码来自多种微生物来源，尤其是不同芽孢杆属物种的其它同源甘露聚糖酶的序列。
多肽：
SEQ ID NO：2中氨基酸第26-约485位的序列是催化活性结构域的成熟内切葡聚糖酶序列。此酶进一步包含与催化活性结构域可操作性连接并表示为相应于SEQ ID NO：2约第485-646位氨基酸序列的纤维素结合结构域(CBD)。本发明内切葡聚糖酶的CBD属于家族3b，参见下文。
本发明还提供与SEQ ID NO：2多肽基本同源的内切葡聚糖酶多肽及其物种同系物(直向同系物或共生同系物)。此处所用的术语“基本同源”表示多肽与SEQ ID NO：2中氨基酸第26-485位或26-646位的序列或者它们的直向同系物或共生同系物的序列同一性达75％，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％的多肽。这些多肽将更优选与SEQ ID NO：2的氨基酸第26-646位所示序列或它的直向同系物或共生同系物至少具95％相同的多肽，最优选具98％或更大相同的多肽。序列相同百分率是用常规方法，通过本领域已知的计算机程序进行测定的，诸如GCG程序包(Wisconsin Package的程序手册，第8版，1994年8月，遗传计算机组，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)提供的GAP，该程序包公开于Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)，分子生物学杂志，48，443-453，在此全文引用作为参考。GAP与以下设置一起用于多肽序列比较：GAP产生罚分3.0及GAP延伸罚分0.1。
通过相似方法测定多核苷酸分子的序列相同性，将以下设置的GAP用于DNA序列比对：GAP产生罚分5.0及GAP延伸罚分0.3。
基本同源的蛋白质和多肽其特征在于具有一个或多个氨基酸取代、删除或添加。这些改变优选影响较小的变换，即保守氨基酸取代(见表2)及其它不会严重影响蛋白质或多肽的折叠或活性的取代；小的删除，通常是1-约30个氨基酸的小删除；及小的氨基或羧基末端延伸，诸如氨基末端甲硫氨酸残基，长达约20-25个残基的小连接肽，或便于纯化的小延伸(亲和标记)，如多组氨酸束、蛋白A(Nilsson等，EMBO J.4：1075，1985；Nilsson等，酶学方法，198：3，1991)。通常参阅，Ford等人，蛋白质表达和纯化2：95-107，1991，在此引用作为参考)。编码亲和标记的DNA可从产品供应商处购买到(如，Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ；New England Biolabs，Beverly，MA)。
然而，即便上述的变化优选是影响较小的改变，这些改变也可以是影响较大的改变，如将长达300个氨基酸或更长的较大多肽作为氨基或羧基端延伸融合到具内切葡聚糖酶活性的本发明多肽上。表1保守氨基酸取代
碱性氨基酸： 精氨酸
赖氨酸
组氨酸
酸性氨基酸： 谷氨酸
天冬氨酸
极性氨基酸： 谷氨酰胺
天冬酰胺
疏水性氨基酸：亮氨酸
异亮氨酸
缬氨酸
芳香族氨基酸：苯丙氨酸
色氨酸
酪氨酸
小氨基酸： 甘氨酸
丙氨酸
丝氨酸
苏氨酸
甲硫氨酸
除20种基本氨基酸之外，也可用非基本氨基酸(如4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)取代本发明多肽的氨基酸残基。也可用有限数量的非保守氨基酸、非遗传密码编码的氨基酸及非天然氨基酸取代氨基酸残基。“非天然氨基酸”已在蛋白质合成后被修饰，且/或在它们侧链上有不同于标准氨基酸侧链的化学结构。非天然氨基酸可以化学合成，或优选地购买得到，包括六氢吡啶羧酸、四氢噻唑羧酸、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸、及3，3-二甲基脯氨酸。
本发明之内切葡聚糖酶多肽中的必需氨基酸可按本领域已知步骤进行鉴别，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells，科学244：1081-1085，1989)。在后一技术中，在分子的每个残基位置处引入单个丙氨酸突变，检测所产生的突变分子的生物学活性(即内切葡聚糖酶活性)以鉴别对分子活性起关键作用的氨基酸残基。也可参阅，Hilton等，生物化学杂志271：4699-4708，1996。酶的活性位点或其它生物学相互作用也可通过对用诸如核磁共振、结晶学、电子衍射或光亲和标记之类技术测定的结构的物理分析连同假定接触位点氨基酸的突变进行测定。参阅，例如，de Vos等人，科学255：306-312，1992；Smith等人，分子生物学杂志224：899-904，1992；Wlodaver等人，FEBS Lett.309：59-64，1992。必需氨基酸的位置也可通过与本发明多肽相关多肽的同源性分析中推断。
可用已知的诱变、重组和/或重排方法及随后的相关筛选步骤进行多个氨基酸取代和检测，这些方法例如有Reidhaar-Olson和Sauer(科学241：53-57，1988)、Bowie和Sauer(美国国家科学院院报86：2152-2156，1989)、WO95/17413或WO95/22625所公开的技术。简要地说，这些作者公开了使多肽中两个或多个位置同时随机化，或进行不同突变的重组/重排(WO95/17413，WO95/22625)，随后从功能上选择多肽，然后将诱变多肽测序以测定每个位置可允许取代的范围。其它可用的方法包括噬菌体展示(如Lowman等，生物化学30：10832-10837，1991；Ladner等，美国专利号5,223,409；Huse，WIPO出版物WO92/06204)和定位诱变(Derbyshire等，基因46：145，1986；Ner等，DNA 7：127，1988)。
上面公开的诱变/重排方法可与大容量、自动筛选方法结合，以检测宿主细胞中克隆的诱变多肽的活性。编码活性多肽的诱变DNA分子可从宿主细胞中回收，并用现代设备迅速测序。这些方法可快速测定目的多肽中各个氨基酸残基的重要性，并可用于未知结构的多肽。
利用上述方法，本领域普通技术人员能鉴定和/或制备与SEQ IDNO：2之26-485位或26-646位残基基本同源并保留野生型蛋白质之内切葡聚糖活性的各种多肽。
除含催化结构域的酶核心外，本发明的内切葡聚糖酶还可包含纤维素结合结构域(CBD)，该纤维素结合结合域和该酶的酶核心(催化活性结构域)可操作连接。纤维素结合结构域(CBD)可作为所编码之酶的内在部分存在并于所附的SEQ ID NO：2中，或者可将另一来源的CBD引入内切葡聚糖酶中，从而产生酶杂合体。在本文中，术语“纤维素结合结构域”应按Peter Tomme等人[《不溶性碳水化合物的酶促降解》一书中，“纤维素结合结构域：分类和特性”，John N.Saddler和Michael H.Penner(编)，ACS Symposium Series，No.618，1996]的定义理解。这一定义将120种以上的纤维素结合结构域归为10个家族(I-X)，并证实在诸如纤维素酶(内切葡聚糖酶)、木糖聚酶、甘露聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰酯酶和壳多糖酶之类的多种酶中有CBD。在藻类如红藻Porphyra purpurea中也已找到了作为非水解性多糖结合蛋白质的CBD，参阅Tomme等人，出处同前。然而，大部分CBD是来自纤维素酶和木糖聚酶，CBD可存在于蛋白质的N和C末端或在其内部。参阅如WO90/00609和WO95/16782，本领域已知有酶杂合体的形式，通过将含有纤维素结合结构域的编码DNA至少一个片段、及通过或不通过连接子与之相连的内切葡聚糖酶编码DNA序列的DNA构建体转化宿主细胞，并培养此宿主细胞以表达融合基因，可制备酶杂合体。酶杂合体可用以下公式描述：
CBD-MR-X其中CBD是相应于至少为纤维素结合结构域的氨基酸序列的N-末端或C-末端区域；MR是中间区域(连接子)，可以是一个键，或一个短的连接基团，优选约2-100个碳原子长的，更优选2-40个碳原子长；MR或者优选约2-100个氨基酸长，更优选2-40个氨基酸长；而X是本发明第一或第二DNA序列所编码多肽的N-末端或C-末端区域。
在优选的实施方案中，本发明的分离多核苷酸分子包含编码纤维素结合结构域(CBD)的部分DNA序列。这样的部分DNA序列例子是相应于SEQ ID N0：1约第485-1941位核苷酸或克隆入大肠杆菌DSM12805内质粒pSJ1678中的DNA序列CBD编码部分的序列。本发明的分离多核苷酸分子可能包含编码连接区的另外部分核苷酸序列，此连接区有效连接分离多核苷酸分子所含核苷酸序列编码的酶的纤维素结合结构域(CBD)和催化活性结构域(CAD)。优选连接区由约2-120个氨基酸残基组成，尤其优选10-80个氨基酸残基。
免疫交叉反应性
用于测定免疫交叉反应性的多克隆抗体，尤其是单特异性多克隆抗体可以利用提纯的纤维素分解酶制备。更具体地说，可以参照N.Axelsen等，定量免疫电泳指南，Blackwell科学出版社，1973，23章，或A.Johnstone和R.Thorpe，实用免疫化学，Blackwell科学出版社，1982(具体是27-31页)所述的程序，通过免疫兔子(或其他啮齿类动物)，得到针对本发明内切葡聚糖酶的抗血清。纯化的免疫球蛋白可以从抗血清获得，例如通过盐析((NH4)2SO4)，然后透析，并在如DEAE-Sephadex上进行离子交换层析。蛋白质的免疫化学鉴定可以利用Outcherlony双向扩散分析(O.Ouchterlony，实验免疫学手册(D.M.Weir编)，Blackwell科学出版社，1967，655-706页)，交叉免疫电泳(N.Axelsen等，出处同前，第3和4章)或火箭免疫电泳(N.Axelsen等，第2章)进行。微生物来源
为了本发明目的，本文中与某个特定来源联系使用的术语“得自”或“可得自”，意指该酶是由或者可以由这个特定来源或插入了来自这个来源的基因的细胞产生。
目前预计本发明的纤维素酶可以得自属芽孢杆菌属的菌株的革兰氏阳性细菌，尤其是地衣芽孢杆菌的菌株。
在一个优选实施方案中，本发明的纤维素酶得自地衣芽孢杆菌菌株ATCC14580。目前预计编码本发明酶的同源酶的DNA序列可以得自芽孢杆菌属的其他菌株。
能够从中得到本发明内切-β-1，4-葡聚糖酶的地衣芽孢杆菌菌株的分离培养物可以从美国典型培养物保藏中心(ATCC)以保藏号ATCC14580公开获得。
另外，含有编码本发明内切葡聚糖酶的DNA序列的质粒pSJ1678已被转化到一个大肠杆菌菌株中，以保藏号DSM12805进行了保藏。
重组表达载体
含有编码本发明所述酶的DNA构建体的重组载体可以是能够方便地进行重组DNA操作的任何载体，载体的选择经常取决于它将要导入的宿主细胞。因此，载体可以是一种自主复制的载体，即以染色体外实体存在、复制独立于染色体复制过程的载体，例如质粒。或者，载体可以是这样一种类型，当它被导入宿主细胞中时，将会部分或全部整合到宿主细胞基因组中，并与其整合入的染色体一起复制。
载体优选是一种表达载体，其中编码本发明酶的DNA序列可操纵地连接了该DNA转录所需的附加片段。一般来说，表达载体来源于质粒或病毒DNA，或者可以含有两者的成分。术语“可操纵地连接”表明各片段的排列方式能使其功能与它们的预期用途一致，例如，使转录在启动子内起始并持续在编码酶的DNA序列内进行。
启动子可以是在所选宿主细胞内显示转录活性的任何DNA序列，并可以来自编码宿主细胞同源或异源蛋白质的基因。
适用于细菌宿主细胞的启动子的例子包括嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖源淀粉酶基因的启动子，地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因的启动子，解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因的启动子，枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因的启动子，或者短小芽孢杆菌木糖苷酶基因的启动子，或者噬菌体λPR或PL启动子，或大肠杆菌lac，trp或tac启动子。
在必要时，编码本发明酶的DNA序列也可以可操纵地连接合适的终止子。
本发明的重组载体还可以再含有使载体能在所选宿主细胞中复制的DNA序列。
载体也可以含有选择性标记，例如，其产物可补偿宿主细胞缺陷的基因，或者编码例如卡那霉素、氯霉素、红霉素、四环素、壮观霉素等抗生素抗性的基因，或者编码重金属或除草剂抗性的基因。
为了使本发明的酶进入宿主细胞的分泌途径，可以在重组载体中提供分泌信号序列(也称为前导序列，前体序列或前序列)。分泌信号序列以正确阅读框加接在编码该酶的DNA序列上。分泌信号序列通常置于编码酶的DNA序列的5’端。它可以是正常情况下就与该酶相关联的或者可以来自编码另一种分泌蛋白质的基因。
将编码本发明酶的DNA序列、启动子和任选的终止子和/或分泌信号序列分别连接，或者通过合适的PCR扩增方案组合这些序列，并将它们插入含有复制或整合必需信息的合适载体中的步骤，是本领域技术人员熟知的(参见例如，Sambrook等，出处同前)。
宿主细胞
导入宿主细胞的克隆DNA分子可以是该选定宿主细胞的同源或异源序列。如果是宿主细胞的同源序列，即是宿主细胞天然产生的，一般将它可操纵连接另外的启动子序列，或者，如果可行，连接另外的分泌信号序列和/或终止子序列，而不处于其天然环境中。术语“同源”意指包括编码所选宿主生物天然酶的DNA序列。术语“异源”意指包括天然情况下宿主细胞不表达的DNA序列。因此，该DNA序列可以来源于另一种生物体，或者可以是合成序列。
本发明的克隆DNA分子或者重组载体被导入的宿主细胞可以是能够生产所述酶的任何细胞，包括细菌、酵母、真菌和高等真核细胞。
经过培养能产生本发明酶的细菌宿主细胞的例子是革兰氏阳性细菌，如芽孢杆菌属的菌株，例如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌；或乳杆菌属(Lactobacillus)的菌株；或链球菌属(Streptococcus)的菌株；或链霉菌属的菌株，如浅青紫链霉菌或鼠灰链霉菌；或革兰氏阴性细菌，如大肠杆菌的菌株。
细菌的转化可以通过原生质体转化、电穿孔、接合或用感受态细胞依照已知方式进行(参见Sambrook等，出处同前)。
当在细菌如大肠杆菌中表达酶时，该酶可以保留在细胞质中，通常以不溶性颗粒存在(称为包涵体)，或者可以被细菌分泌序列引导到壁膜间隙。前一种情况下，裂解细胞，收集颗粒并变性，随后稀释变性剂使酶重新折叠。后一种情况下，通过在例如超声破碎或渗透压休克破碎细胞以释放壁膜间隙成分后，再回收酶，即可以从壁膜间隙收集酶。
当在如芽孢杆菌或链霉菌属的菌株等革兰氏阳性细菌中表达该酶时，酶可以保留在细胞质中，或者被细菌分泌序列引导到胞外培养基中。
培养中能产生本发明酶的真菌宿主细胞例子是如曲霉属或镰孢属菌株，尤其是泡盛曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉和尖镰孢，以及木霉属菌株，优选Trichoderma harzianum、Trichoderma reesei和绿色木霉。
真菌细胞可通过以下过程转化，包括原生质体形成和原生质体转化，以及随后以实质上已知的方式再生细胞壁。以曲霉属菌株作为宿主细胞可见于EP238023(Novo Nordisk A/S)，其内容在此收编作为参考。
培养中能产生本发明酶的真菌宿主细胞例子是如汉逊氏酵母属菌株、克鲁维酵母属菌株，尤其是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)和马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marcianus)；毕赤氏酵母属菌株；酵母属菌株，尤其是卡尔酵母、酿酒酵母、克鲁弗酵母和葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)；裂殖酵母属菌株，尤其是粟酒裂殖酵母和Yarrowia sp.菌株，尤其是Yarrowia lipolytica。
培养中能产生本发明酶的植物来源宿主细胞例子是如Solanumtuberosum或Nicotiana tabacum的植物细胞。生产纤维素分解酶的方法
本发明提供了一种生产本发明的分离酶的方法，其中，在允许该酶产生的条件下，培养已转化了编码该酶的DNA序列的合适宿主细胞，并从培养物中回收得到的酶。
如本文中的定义，分离的多肽(例如酶)是基本不合其它多肽的多肽，例如经SDS-PAGE测定，至少约20％纯，优选至少约40％纯，更优选约60％纯，甚至更优选约80％纯，最优选约90％纯，最最优选约95％纯。
术语“分离多肽”也可称为“纯化多肽”。
当将含有编码该酶的DNA序列的表达载体转化到异源宿主细胞中时，就有可能异源重组生产本发明的酶。
由此，有可能制备出很纯的或单组分的纤维素分解组合物，其特征在于不含同源杂质。
本文中，同源杂质是指来源于最初获得本发明酶的同源细胞的任何杂质(例如本发明酶之外的其它多肽)。
本发明中，同源宿主细胞可以是地衣芽孢杆菌的菌株。
用于培养转化宿主细胞的培养基可以是适于所选宿主细胞生长的任何常规培养基。表达的纤维素分解酶可以方便地分泌到培养基中，并可以通过熟知的程序从中回收，包括通过离心或过滤将细胞从培养基中分离出来，用盐(例如硫酸铵)沉淀培养基中的蛋白质成分，随后进行如离子交换层析、亲和层析等层析。酶组合物
更进一步，本发明涉及含有上述具内切葡聚糖酶活性的酶的酶组合物。
本发明的酶组合物除包含本发明的内切葡聚糖酶之外，还可以含有一或多种其它酶类，例如半纤维素酶如木聚糖酶和甘露聚糖酶，其他纤维素酶或内切-β-1，4-葡聚糖酶组分，壳多糖酶、脂肪酶、酯酶、果胶酶、角质酶、肌醇六磷酸酶、氧化还原酶(过氧化物酶、卤过氧化物酶(haloperoxidase)、氧化酶、漆酶)、蛋白酶、淀粉酶、还原酶、酚氧化酶、木质素酶(ligninase)、支链淀粉酶、果胶裂解酶、木糖葡聚糖酶(xyloglucanase)、果胶乙酰酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、果胶裂解酶、果胶甲酯酶、纤维二糖水解酶、转谷氨酰胺酶(transglutaminase)；或它们的混合物。
酶组合物可以依照本领域已知方法制备，可以是液态或干燥组合物形式。例如，酶组合物可以是颗粒或微粒形式。包含在组合物中的酶可以用本领域已知方法稳定化。
内切葡聚糖酶在许多工业和应用领域中都有潜在的用途。以下给出了本发明酶组合物的优选用途的例子。本发明酶组合物的剂量和它的其它使用条件可以依据本领域已知方法确定。
本发明的酶组合物可以用于下列目的中的至少一种。酶
在本发明优选的实施方案中，内切葡聚糖酶在pH4-11的范围内，优选在pH5.5-10.5范围内呈现活性。用途生物质的降解
本发明的酶或酶组合物可方便地应用如下：
-用于去壳，即在机械鼓室中去壳前用可部分降解富胶质新生组织层的水解酶预处理，从而有利于节约能源。
-用于纤维分离(精制或打浆)，即在精制或打浆前用水解酶处理含纤维素纤维的材料，由于酶在纤维表面的水解作用导致能量消耗的减少。
-用于纤维改性，即纤维特性的改善，其中需要纤维壁上的局部水解，要求渗入较深的酶(如为了使粗纤维更富弹性)。
-用于排水：用水解酶处理纸浆可提高造纸中纸浆的排水能力。使用本发明的酶或酶组合物可能更有效，如导致精细部分中紧密水合的微纤维束较大程度的松开，该紧密微纤维束通过封闭纤维之间和造纸机器中金属网的空洞空间限制了排水速率。
木素纤维质纸浆的处理参见WO93/08275、WO91/02839和WO92/03608。在洗涤剂工业中的用途
在纺织品和衣服的家常或工业化清洗所用的洗涤剂组合物中，本发明的酶和酶组合物是有用的，它还可用于织物的机器处理过程，包括在用含本发明酶或酶制品的洗涤溶液机器清洗过程循环中处理织物。
通常，本发明的洗涤剂组合物包含常规成分，诸如表面活性剂(阴离子的、非离子的、两性离子的、兼性离子的)、助洗剂及其它成分，参见此处收编作为参考的WO97/01629。纺织品上的应用
在另一实施方案中，本发明涉及在生物抛光过程中本发明内切葡聚糖酶的使用。生物抛光是一种对纱表面进行的特殊处理，它改善了织物的手感和外观性质，而没有丧失织物的可湿度。生物抛光的最重要作用可描述为减少绒毛和起球、增加光彩/光泽、改善织物的手感、提高持久的柔软性及改变水吸收能力。生物抛光通常在针织和机织织物制造的湿加工中进行。湿加工包括如下步骤：如脱浆、擦洗、漂白、清洗、染色/印刷和成型。在各步中，织物多少要经机械作用。大体上，针织或机织好织物后，织物加工至脱浆阶段，随后是擦洗阶段，等等。脱浆是去除纺织品上浆料的过程。在上织布机上编织前，为了提高其抗张强度，通常将经线涂上浆粉或浆粉衍生物。编织后，所涂浆料必须在织物进一步加工前去除，以保证均匀和耐洗的效果。已知为了完成生物抛光作用，需要将纤维水解和机械作用联合起来。还已知用纤维素酶处理和常规柔顺剂处理相结合能达到“超柔软的”效果。预计将本发明的内切葡聚糖酶用于纤维质织物生物抛光中是有利的，如可达到更彻底的抛光效果。应用文献如WO93/20278所述方法可进行生物抛光。石洗
为了提供染色织物，尤其是粗斜纹棉布或牛仔裤中的“石洗”外观(颜色局部磨损)，已知可用磨光的石头洗涤由这些织物做成的粗斜纹棉布或牛仔裤以达到预期的织物局部颜色较浅的效果，或可用酶促方法，尤其是纤维水解酶处理织物。使用本发明内切葡聚糖酶的处理可如US 4832864所公开的单独进行，也可与较传统工艺少量的浮石一起进行处理，或与WO95/09225所公布的珍珠岩一起进行处理。CMC单位的测定
在60℃用pH7.5的0.1M Mops缓冲液测定CMC单位。保温20分钟，用PHAB测定还原糖的形成。1个CMC单位相当于每分钟形成1微摩尔葡萄糖相等物。CMC(羧甲基纤维素7L来自Hercules)终浓度为0.75％，DS0.7。材料和方法菌株：
地衣芽孢杆菌ATCC14580。
枯草芽孢杆菌PL 2306。该菌株是具断裂的apr和npr基因的枯草芽孢杆菌DN 1885(Diderichsen等，(1990))，这种断裂发生于已知枯草芽孢杆菌纤维素酶基因的转录单位内，产生了纤维素酶阴性细胞。基本上如A.L.Sonenshein等人(1993)所述进行这种基因破坏。
按Yasbin等人(1975)所述方法制备和转化感受态细胞。质粒
pSJ1678。公布于国际专利申请WO94/19454中。
pMOL 944：
该质粒是pUB110的衍生物，基本上包含使该质粒能在枯草芽孢杆菌内增殖的元件、卡那霉素抗性基因，并有克隆自地衣芽孢杆菌ATCC14580的amyL基因的强启动子和信号肽。该信号肽包含一个SacII位点，使其便于克隆与信号肽融合的蛋白质成熟部分的编码DNA。这就导致前蛋白质的表达，该蛋白质被导向细胞外部。
该质粒用普通基因工程方法构建而成，简述如下。pMOL944的构建：
用单切点酶Nci I消化pUB110质粒(Mckenzie，T.等人，1986)。将扩增自质粒pDN1981(Jorgensen等人，1990)上之amyL启动子的PCR片段用Nci I消化，并插入Nci I消化的pUB110中，产生了质粒pSJ2624。
所用的两个PCR引物具以下序列：#LWN5494 5′-GTCGCCGGGGCGGCCGCTATCAATTGGTAACTGTATCTCAGC-3′#LWN5495 5′-GTCGCCCGGGAGCTCTGATCAGGTACCAAGCTTGTCGACCTGCAGAA
TGAGGCAGCAAGAAGAT-3′
引物#LWN5494向质粒中插入了一个Not I位点。
质粒pSJ2624随后用Sac I和Not I消化，且用Sac I和Not I消化扩增自pDN1981上的amyL启动子的新PCR片段，将该DNA片段插入SacI-Not I消化的pSJ2624，从而产生质粒pSJ2670。
该克隆步骤导致用方向相反的同一启动子替换了原amyL启动子。用于PCR扩增的两个引物具以下序列：#LWN5938 5′-GTCGGCGGCCGCTGATCACGTACCAAGCTTGTCGACCTGCAGAATGAGGCAGCAAGAAGAT-3′#LWN5939 5′-GTCGGAGCTCTATCAATTGGTAACTGTATCTCAGC-3′
质粒pSJ2670用限制酶Pst I和Bcl I消化，将扩增自编码碱性淀粉酶SP722(国际专利申请公布号WO95/26397，在此引用作为参考)的克隆DNA序列的PCR片段用Pst I和Bcl I消化后插入消化后的pSJ2670中，产生了质粒pMOL944。用于PCR扩增的引物具以下序列：#LWN7864 5′-AACAGCTGATCACGACTGATCTTTTAGCTTGGCAC-3′#LWN7901 5′-AACTGCAGCCGCGGCACATCATAATGGGACAAATGGG-3′
引物#LWN7901向质粒中插入了一个SacII位点。普通分子生物学方法：
除非另外指出，DNA操作和转化采用标准的分子生物学方法(Sambrook等，1989；Ausubel，F.M.等，1995；Harwood，C.R.等，1990)进行。
DNA操作使用的酶依照厂商的说明使用(如限制性内切酶、连接酶等可获自New England Biolabs，Inc.)。培养基：
TY(如Ausubel，F.M.等人，1995中所述)。
LB琼脂(如Ausubel，F.M.等人，1995中所述)。
LBPG是补充有0.5％葡萄糖和0.05M磷酸钾，pH7.0的LB琼脂。
BPX培养基描述于EP 0 506 780(WO91/09129)中。
以下实施例对本发明进行了进一步的说明。实施例1地衣芽孢杆菌内切-β-1，4-葡聚糖酶的克隆和表达基因组DNA制备：
地衣芽孢杆菌菌株ATCC 14580在ATCC(美国典型培养物保藏中心，美国)所描述的液体培养基3中增殖。于300rpm，37℃温育18小时后，收获细胞，用Pitcher等人(1989)所述方法分离基因组DNA。基因组文库构建：
用限制酶Sau3A部分消化地衣芽孢杆菌ATCC 14580基因组DNA，在0.7％的琼脂糖凝胶上电泳，按大小进行分级分离。通过在DEAE-纤维素纸上电泳分离大小为约2-7kb的片段(Dretzen等，(1981))。将分离的DNA片段连接到BamHI消化的pSJ 1678质粒DNA上。
连接DNA用于大肠杆菌SJ2的电穿孔中，将转化细胞涂布于含10mg/ml氯霉素和0.1％CMC(羧甲基纤维素钠，Aqualon，法国)的LB-琼脂平板上，平板在37℃保温18小时。通过菌落杂交鉴别阳性克隆
如上述方法构建于大肠杆菌中的DNA文库在含0.1％CMC(羧甲基纤维素钠，Aqualon，法国)和10μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上进行筛选，并于37℃温育过夜。培养后，将转化子影印到相同类型的平板上，继续在37℃培养新板约8小时或过夜。
原始平板用含1mg/ml刚果红(Congo Red)(SIGMA，USA)的水溶液25ml染色。中速振荡继续染色半小时，然后用1M NaCl洗涤平板15分钟两次。
黄色环出现于纤维素酶阳性克隆存在的位置，从影印平板上挑出这些纤维素阳性克隆并重划线于含0.1％CMC和9μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上，37℃保温过夜。阳性克隆的定性
以单菌落形式从再划线平板上获得内切葡聚糖酶阳性克隆，提取质粒。通过大肠杆菌SJ2的再转化证实其表型，用限制性酶消化对质粒进行定性。一个阳性克隆被命名为MB629-3。
使用Taq脱氧末端循环测序试剂盒(Perkin-Elmer，USA)并借助于引物步行法通过DNA测序鉴定内切葡聚糖酶基因，开始于pSJ1678质粒特有且在所克隆内切葡聚糖酶编码DNA片段两侧的引物。
按照Devereux等(1984)所述进行序列数据分析。该序列相当于SEQ ID NO：1所示DNA序列。
用由下述两个寡核苷酸组成的PCR引物对PCR扩增编码氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示之家族9内切-β-1，4-葡聚糖酶的本发明DNA序列(也称Cel9)。Cel9.B.lich.upper.PstI5′-CAT CAT TCT GCA GCC GCG GCA GCT TCT GCT GAA GAA TAT CCT C-3′Cel9.B.lich.lower.NotI5′-GCG AGA ATA GCG GCC GCT AGT AAC CGG GCT CAT GTC CG-3′下划线为PstI和NotI的限制性位点。
如上所述分离自地衣芽孢杆菌ATCC14580的染色体DNA用作模板，按制造商说明书用Amplitaq DNA聚合酶(Perkin Elmer)进行PCR反应。PCR反应进行于含dNTP各200μM、2.5个单位Amplitaq聚合酶(Perkin Elmer，Cetus，USA)和引物各100pmol的PCR缓冲液(10mMTris-HCl，pH8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl2，0.01％(w/v)明胶)中。
用DNA热循环仪(Landgraf，德国)进行PCR反应。94℃预变性1分钟，然后进行30个循环，每个循环为94℃变性30秒，60℃退火1分钟，72℃延伸2分钟。在0.7％的琼脂糖凝胶(NuSieve，FMC)上电泳分析5μl扩增产物。大小为2.0kb的DNA片段的出现表明基因区段得到正确扩增。PCR片段的亚克隆：
按制造商说明书用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen，USA)纯化上述产生的PCR产物之45μl等分试样。纯化的DNA洗脱于50μl pH8.5的10mM Tris-HCl中。用Pst I和Not I消化5μg pMOL944和25μl纯化的PCR片段，在0.8％的低熔点琼脂糖(SeaPlaque GTG，FMC)凝胶上进行电泳，将相关片段从胶上切下，按制造商说明书用QIA快速凝胶抽提试剂盒(Qiagen，USA)进行纯化。随后将分离的PCR DNA片段连接到经Pst I-Not I消化并纯化的pMOL944上。用0.5μg每种DNA片段、1UT4 DNA连接酶和T4 DNA连接酶缓冲液(Boehringer Mannheim，德国)16℃过夜完成连接。
连接混合物被用于转化感受态枯草芽孢杆菌PL 2306。将转化细胞铺于含10μg/ml卡那霉素的LBPG琼脂平板上。37℃温育18小时后将数个克隆重划线于新鲜平板上，培养于含10μg/ml卡那霉素的液体TY中，37℃温育过夜。第二天按制造商为枯草芽孢杆菌质粒制备推荐的方法，用Qiaprep Spin质粒小量制备试剂盒#27106从1ml细胞中分离质粒。此质粒DNA用作DNA测序的模板。
保留含本发明之内切-β-1，4-葡聚糖酶基因的克隆，命名为MB905。
将来自MB905的质粒引入地衣芽孢杆菌ATCC14580的衍生物中用于表达试验。此菌株称为MB924。通过将细胞在BP-X培养基中37℃，300rpm培养5天，克隆DNA序列表达于地衣芽孢杆菌中。上清液中的内切葡聚糖酶相应于SEQ ID NO：2的成熟蛋白质，即包含相应于SEQ IDNO：2第26-646位氨基酸的蛋白质序列。实施例2来自地衣芽孢杆菌之内切-β-1，4-葡聚糖酶的纯化和定性纯化
在500ml带两挡板的锥形瓶里将按实施例1得到的MB924于含10μg/ml卡那霉素的15×200ml BPX培养基中37℃，300rpm培养5天，得到2500ml培养液。用1倍体积的离子化水稀释培养液并用醋酸将培养液调节到pH7.5，然后，在搅拌中加入112.5ml阳离子试剂(C521 10％)和225ml阴离子试剂(A130 0.1％)形成絮凝。利用Sorval RC 3B离心机，在6℃，10,000rpm离心30分钟，分离絮凝过的材料。产生的上清液总体积为5000ml，其活性为120CMCU/ml。
利用Whatman GF/D和C号玻璃滤器澄清上清液，最后浓缩于截留分子量10kDa的滤器UF膜上。总体积1750ml，调节至pH8.0。
为了获得高度纯化的内切葡聚糖酶，最后一步进行Q-琼脂糖阴离子交换层析。将1750ml溶液上样于含50mmol Tris pH8.0缓冲液平衡好的Q-Sepharose(Pharmacia)的800ml柱中。内切葡聚糖酶结合并以0.5M NaCl梯度洗脱。95％以上的内切葡聚糖酶被浓缩。鉴定
纯酶在SDS-PAGE上为大小67kDa的单一条带，等电点约为5.6。
以摩尔消光系数171640(基于推断自序列的氨基酸组成)测定蛋白质浓度。pH活性曲线显示60℃时在pH6.0-9.2之间有超过50％的相对活性。pH7.5时最适温度是65℃。DSC显示pH6.2时熔点为77℃。
纯内切葡聚糖酶的N-末端测定为：EYPHNYALLQK。
纯内切葡聚糖酶包含属糖基水解酶家族9的催化结构域，该结构域相应于SEQ ID NO：2中约第26-485位的氨基酸序列，还有与催化结构域连接的纤维素结合结构域(CBD)，它由SEQ ID NO：2的约第486-644位氨基酸序列表示。该CBD属家族3b。
免疫学特性：在Danish公司DAKO，用常规技术制备抗高度纯化之内切-β-1，4-葡聚糖酶的兔多克隆单特异性血清。该血清在琼脂糖凝胶上与本发明的内切葡聚糖酶形成了清楚的单一沉淀物。参考文献Ausubel，F.M.等编“分子生物学最新方法”。John Wiley和Sons，1995。Axelsen，N.，等：定量免疫电泳手册，Blackwell科学出版社，1973，第23章。Denman，S.等：与reesei木霉纤维生物水解酶II同源的Neocallumastix patriarum纤维素酶cDNA(celA)的鉴定。应用环境微生物学(1996)，62(6)，1889-1896。Damude，H.G.等：纤维菌属内切葡聚糖酶A的底物特异性：家族6之内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶基本差异，生化杂志(1996)，315(2)，467-72。Devereux等，(1984)核酸研究12，387-395。Diderichsen，B.，Wedsted，U.，Hedegaard，L.，Jensen，B.R.，Sjoholm，C.(1990)编码□-乙酰乳酸脱羧酶，一种来自短小芽孢杆菌的外切酶的aldB的克隆，细菌学杂志，172，4315-4321。Dretzen，G.，Bellard，M.，Sassone-Corsi，P.，Chambon，P.(1981)一种从琼脂糖和丙烯酰胺凝胶上回收DNA片段的可信方法。分析生物化学，112，295-298。Feinberg，A.P.和Vogelstein，B.(1983)分析生物化学132：6-13。Gilbert，H.J.和Vogelstein，B.(1993)遗传微生物杂志139：187-194。Gilkes，N.R.，Henrissat，B.，Kilburn，D.G.，Miller Jr.，R.C.和Warren，R.A.J.：微生物β-1，4-葡聚糖酶中的结构域；序列保守性，功能和酶家族。微生物学研究55(1991)，305-315。Harwood，C.R.，和Cutting，S.M.(编)“芽孢杆菌分子生物学方法”，John Wiley和Sons，1990。Henrissat，B.1991。基于氨基酸序列相似性的糖基水解酶分类。生物化学杂志，280：309-316。Henrissat，B.，和A.Bairoch.1993.基于氨基酸序列相似性之糖基水解酶分类中的新家族。生物化学杂志，293：781-788。Johnstone，A.和R.Thorpe，实用免疫生化，Blackwell科学出版社，1982(第27-31页)。Jorgensen，P.L.等，1990，基因，96，P.37-41。Leatherbarrow，R.J.(1992)Grafit版本3.0，Erithacus软件有限公司。Staines，英国。Lever，M.(1972)用于碳水化合物比色测定的新反应。生物化学分析，47，273-279。Mckenzie，T.等，1986，质粒15：93-103。O.Ouchterlony，实验免疫学手册(D.M.Weir，编)，Blackwellscientific Publications，1967，655-706页。Pitcher，D.G.，Saunders，N.A.，Owen，R.J.(1989).用硫氰酸胍快速提取细菌基因组DNA。应用微生物学通讯，8：151-156.Quillet，L.等：编码来自苦参水浸液的β-1，4-葡聚糖酶的基因：通过来自放射菌之结合结构域和催化结构域水平转移而独立获取的证据，基因(1995)，158(1)，23-9。Sambrook等(1989)分子克隆，实验室手册，Cold Spring Harborlab.，Cold Spring Harbor，NY.编辑：A.L.Sonenshein，J.A.Hoch和Richard Losick(1993)芽孢杆菌及其它革兰氏阳性细菌，美国微生物学，第618页。Yasbin，R.E.，Wilson，G.A.和Young，F.E.(1975)枯草芽孢杆菌溶原菌株中的转化和转染：感受态细胞中原噬菌体选择性诱导的证据。细菌学杂志，121：296-304。序列表<110>NOVO NORDISK A/S<120>NOVEL ENDO-BETA-1，4-GLUCANASES<130>seq<140><141><160>2<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1941<212>DNA<213>地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)<400>1atgaaagcgc tttgtttggc wcttttagtg atcttctcta tgagcatagc gtcgttttca 60gaaaagaccc gtgcagcttc tgctgaagaa tatcctcata attatgctga actgctgcaa 120aagtctttgt tattttatga agcacagcgc tcgggaagac ttccggaaaa cagccggctg 180aattggagag gagactccgg gcttgaggac ggaaaagacg ttggcctcga tttaacggga 240gggtggtatg atgccggcga ccacgtgaag ttcggtctgc cgatggctta ttctgccgca 300atcctgtcat ggtcggtcta tgagtaccga gatgcctaca aagaatcggg tcagcttgat 360gcggcgctgg acaatattaa atgggcgaca gactactttc ttaaagccca tacggctcct 420tatgaattgt ggggccaagt cggaaatggc gctctagacc acgcatggtg ggggccggcc 480gaagtaatgc cgatgaagcg ccctgcctat aagatcgatg ccggctgtcc ggggtcagac 540cttgctggtg gtacagccgc agcgctagca tcagcatcaa ttattttcaa gccgacagat 600tcttcttact ctgaaaaatt actggctcat gccaagcaat tgtatgattt tgccgaccgc 660taccgcggca aatattcaga ctgcattaca gacgcacagc aatattataa ttcgtggagc 720gggtataaag atgaactgac atggggagct gtctggctct acttggcaac agaagaacaa 780caatatttgg ataaagccct tgcttcggtc tcagattggg gcgatcccgc aaactggcct 840taccgctgga cgctttcctg ggatgacgtc acttacggag cacagctgct gctcgctcgt 900ctgacaaacg attcccgttt tgtcaaatct gtcgaacgca atcttgatta ttggtcgaca 960ggctacagtc ataatggaag catagaacgg atcacgtata cgccgggcgg tttggcctgg 1020cttgagcagt ggggatcatt gcgatacgct tcgaatgccg cttttctcgc tttcgtttat 1080tccgattggg tggatacaga aaaagcgaaa agatatcggg attttgctgt tcggcaaacg 1140gagtatatgc taggagataa tccgcagcag cgaagctttg tcgttggata cggtaaaaat 1200ccgccgaaac atccgcatca ccgtacagca cacggttcat gggccaatca gatgaatgtg 1260cctgaaaacc atcgccatac cctatacggc gcattagtcg gcggtccggg aagggacgat 1320tcgtaccgag atgacataac agattatgcg tcaaacgaag ttgcgatcga ttataatgcc 1380gcttttaccg gcaacgtagc gaaaatgttt cagctgttcg ggaaaggcca tgttccgctg 1440cctgattttc cggagaagga aacacctgag gacgaatatt ttgcagaggc atcaatcaac 1500agctccggaa acagctatac tgaaatccgg gcgcagctca ataaccgttc gggatggccg 1560gcaaagaaaa ccgatcaatt gtctttccgc tactacgttg acttgacgga agctgtagaa 1620gcgggatatt ccgccgaaga tataaaagtc acagccggct ataacgaagg ggcctcggta 1680tcagagctga agccgcatga cgcttcaaag cacatttact atacagaagt cagcttcagc 1740ggggttttga tttatccagg cggtcaatcc gcccataaaa aagaagtgca gttccgcctt 1800tcggcaccag acggaacgtc tttttggaac ccggaaaatg accactctta tcagggtctg 1860tcacatgcgc ttctgaagac gcggtatatt cctgtttatg atgatggacg gctcgttttc 1920ggacatgagc ccggttacta g 1941<210>2<211>646<212>PRT<213>地衣芽孢杆菌<400>2Met Lys Ala Leu Cys Leu Ala Leu Leu Val Ile Phe Ser Met Ser Ile 1 5 10 15Ala Ser Phe Ser Glu Lys Thr Arg Ala Ala Ser Ala Glu Glu Tyr Pro
20 25 30His Asn Tyr Ala Glu Leu Leu Gln Lys Ser Leu Leu Phe Tyr Glu Ala
35 40 45Gln Arg Ser Gly Arg Leu Pro Glu Asn Ser Arg Leu Asn Trp Arg Gly
50 55 60Asp Ser Gly Leu Glu Asp Gly Lys Asp Val Gly Leu Asp Leu Thr Gly 65 70 75 80Gly Trp Tyr Asp Ala Gly Asp His Val Lys Phe Gly Leu Pro Met Ala
85 90 95Tyr Ser Ala Ala Ile Leu Ser Trp Ser Val Tyr Glu Tyr Arg Asp Ala
100 105 110Tyr Lys Glu Ser Gly Gln Leu Asp Ala Ala Leu Asp Asn Ile Lys Trp
115 120 125Ala Thr Asp Tyr Phe Leu Lys Ala His Thr Ala Pro Tyr Glu Leu Trp
130 135 140Gly Gln Val Gly Asn Gly Ala Leu Asp His Ala Trp Trp Gly Pro Ala145 150 155 160Glu Val Met Pro Met Lys Arg Pro Ala Tyr Lys Ile Asp Ala Gly Cys
165 170 175Pro Gly Ser Asp Leu Ala Gly Gly Thr Ala Ala Ala Leu Ala Ser Ala
180 185 190Ser Ile Ile Phe Lys Pro Thr Asp Ser Ser Tyr Ser Glu Lys Leu Leu
195 200 205Ala His Ala Lys Gln Leu Tyr Asp Phe Ala Asp Arg Tyr Arg Gly Lys
210 215 220Tyr Ser Asp Cys Ile Thr Asp Ala Gln Gln Tyr Tyr Asn Ser Trp Ser225 230 235 240Gly Tyr Lys Asp Glu Leu Thr Trp Gly Ala Val Trp Leu Tyr Leu Ala
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275 280 285Asp Val Thr Tyr Gly Ala Gln Leu Leu Leu Ala Arg Leu Thr Asn Asp
290 295 300Ser Arg Phe Val Lys Ser Val Glu Arg Asn Leu Asp Tyr Trp Ser Thr305 310 315 320Gly Tyr Ser His Asn Gly Ser Ile Glu Arg Ile Thr Tyr Thr Pro Gly
325 330 335Gly Leu Ala Trp Leu Glu Gln Trp Gly Ser Leu Arg Tyr Ala Ser Asn
340 345 350Ala Ala Phe Leu Ala Phe Val Tyr Ser Asp Trp Val Asp Thr Glu Lys
355 360 365Ala Lys Arg Tyr Arg Asp Phe Ala Val Arg Gln Thr Glu Tyr Met Leu
370 375 380Gly Asp Asn Pro Gln Gln Arg Ser Phe Val Val Gly Tyr Gly Lys Asn385 390 395 400Pro Pro Lys His Pro His His Arg Thr Ala His Gly Ser Trp Ala Asn
405 410 415Gln Met Asn Val Pro Glu Asn His Arg His Thr Leu Tyr Gly Ala Leu
420 425 430Val Gly Gly Pro Gly Arg Asp Asp Ser Tyr Arg Asp Asp Ile Thr Asp
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450 455 460Asn Val Ala Lys Met Phe Gln Leu Phe Gly Lys Gly His Val Pro Leu465 470 475 480Pro Asp Phe Pro Glu Lys Glu Thr Pro Glu Asp Glu Tyr Phe Ala Glu
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