从植物叶片直接提取1，5二磷酸核酮糖方法.pdf

本发明关于提取1.5-二磷酸核酮糖（RuBP）方法，RuBP是羧化酶/加氢酶（Rubisco）地底物，Rubisco是植物进行RuBP光合作用的关键性酶，该酶具有双重催化功能：催化RuBP与CO2结合进行羧化反应，开启光合碳还原循环（即进行光合同化作用）;同时也催化RuBP与O2结合，进行加氧反应，从而启动光合碳氧循环（即进行光呼吸）。因此，RuBP是光合碳化代谢的必备生化试剂，RuBP属高能化合物，其含量88-98%，这种产品目前靠进口，价格昂贵。
    目前RuBP的制备均采用酶促合成法，此法需添加生化剂和酶制剂、成本高、手续繁冗、得率低。

    本发明根据叶片中的RuBP含量随光强上升而显著增加和RuBP钡盐的溶度积常数很小等特性，提供一种从植物叶片直接提取1.5-二磷酸核酮糖（RuBP）的方法，在制备过程中不需添加生化剂和酶制剂，可获RuBP钡盐或钠盐，含量在90%以上，符合生化试剂要求，其工艺简单、成本低、产量高。

    本方法首先采用以强光照处理新鲜植物叶片并迅速低温冷冻固定，将处理后的叶片破碎、酸浸取、钡盐沉淀、阴离子交换层析纯化等步骤。

    具体提取方法可这样进行：

    一、照光处理

    取新鲜植物叶片，胡罗卜叶片较理想，装入透明袋里，排除袋里内空气，充入高纯氮气，将袋口扎紧，置于50lx以上强光下照光约5-10分钟，使各叶片均能双面受到光照，随即于-40℃以下低温冷冻固定。

    二、将冰冻固定的植物叶片破碎，加入约两倍叶重的预冷至1℃左右的含8%三氯乙酸及5%甲酸的提取液，高速匀浆，双层尼龙布过滤，滤液于3000×g离心15分钟，弃去沉淀，每升上清液中加入150g用1mol HCl/L处理过的活性碳，搅拌均匀后于3000×g离心10分钟，弃去沉淀，每升上清液中加入饱和Ba（OH）2溶液，用饱和NaOH调至pH值为6.5，然后每升提取液中加入乙酸钡10g，无水乙醇300ml，均匀后低温静置约30分钟，3000×g离心15分钟，可获RuBP钡盐沉淀，整个过程应在4℃下进行。

    三、RuBP纯化

    用0.5mol HCl/L溶解含RuBP的钡盐沉淀，用5000×g离心沉降，收集上清液，调至pH值为3.5，过DEAE-纤维素柱或20×7（717）型阴离子交换树脂柱（10mmol NaCl/L+1mmol HCl/L溶液平衡），用3倍柱体积的平衡液洗柱后，再用0.1mmol HCl/L+0.01-0.2mol NaCl/L进行梯度洗脱，用磷试剂（4%钼酸铵∶1mol HCl/L∶70%HClO4∶水为5∶2∶1∶12，V/V）显色检测洗脱液，收集含RuBP的洗脱液（与磷试剂反应显淡黄色，然后再用酶法进一步鉴定，进行酶反应时，需将洗脱液用NaOH调至pH值为7.6左右），用饱和Ba（OH）2调至pH值为6.5，每升收集液中加入乙酸钡10g，无水乙醇300ml，于冰箱中静置2小时，以5000×g离心使其沉淀完全，收集沉淀，用80%乙醇洗涤3-4次，冰冻干燥即获RuBP二钡盐，整个纯化过程都在4℃下进行。RuBP二钡盐与等当量的Na2SO4在冷水中充分搅拌混合，于1500×g离心沉淀，将上清液冰冻干燥真空干燥，然后用无水甲醇∶丙酮为1∶4体积比的混合液洗涤，再用冰冻丙酮洗涤多次，冰冻真空干燥获得RuBP四钠盐。

    本方法所获得的产品RuBP四钠盐，经酶法分析，不稳定磷测定，波谱分析、纸层析分析，结果表明：有效含量在90%以上，符合生化试剂要求，不含无机磷及共轭双键的任何杂质，也不含R5P及Ru5P等糖磷酸酯。