本发明涉及的是采用一种固化小鼠甲状腺球蛋白检测人血中抗甲状腺球蛋白抗体。 自身免疫性甲状腺病长期以来给人们带来了重大的危害,而在该病的诊断和治疗过程中,检测病人血液中存在的自身抗甲状腺球蛋白抗体至关重要。
目前对患该病者血液中存在的抗甲状腺球蛋白抗体的检测方法虽有许多,如用放射免疫法以人甲状腺球蛋白检测人血中的抗甲状腺球蛋白抗体,但要求人甲状腺球蛋白中不能污有其它种类的蛋白质成分,另外,同位素的半衰期也直接影响测定的结果,做同位素检测还需要有一定的设备;就大多数方法而言,都有费用成本高,受一定的条件限制等。
本发明的目的则是针对上述存在问题,设计了一种以固化小鼠甲状腺球蛋白用血凝法检测人血中的自身抗甲状腺球蛋白抗体。
本发明的技术解决方案:
一、小鼠甲状腺球蛋白(鼠TG)的分离制备:
用放血法处死小鼠,取甲状腺组织匀浆,加磷酸缓冲盐液(PBS.PH7.0-7.4、0.05N)离心,取上清,加硫酸铵到饱和度37%,留上清弃沉淀,在上清中加硫酸铵到饱和度42%,离心取沉淀,用PBS溶解,并透析后上到用PBS平衡好的葡聚糖凝胶(Sephadex-G200)柱上,取第一蛋白峰合并各管,并浓缩即为小鼠TG。
二、固化绵羊红血球制备:
1、采用新鲜绵羊血加到生理盐水中(用肝素抗凝)。
2、离心取羊血球,用PH7.0-7.4、PBS洗三次。
3、于0℃-4℃将洗净的血球缓慢滴加到0.15%戊二醛(用PBS配制)中,使溶液中血球浓度为5%,并不停搅拌2小时。
4、离心取已固化好地血球,用0.15MNaCL洗8次。
5、血球悬于含0.1%NaN的PBS中,于0℃-4℃存放备用。
三、小鼠甲状腺球蛋白致敏固化羊红血球:
1、取固化羊红血球,用0.15MNaCL洗一次后,以PBS配成0.5%的红细胞悬液。
2、以0.15MNaCL配0.005%鞣酸液。
3、取1.2两液等体积于35℃-37℃混合搅拌10分钟。
4、用PBS洗三次,悬于0.15MNaCL液中,细胞浓度为1%。
5、将4液与等量小鼠甲状腺球蛋白液(含蛋白0.1mg/ml生理盐水),于35℃-37℃混合10分钟。
6、用0.1%明胶PBS洗一次后,悬成0.5%细胞悬液,即可应用。
四、检测人血中的抗甲状腺球蛋白抗体:
用96孔有机玻璃血凝板,每孔加入0.2ml生理盐水,于第一排孔中加入人血清0.2ml,依次倍比稀释,最后两排孔为控制对照,每孔中加入固化小鼠甲状腺球蛋白血球0.2ml于微量振荡器上振荡20-30分钟后静置4小时看结果:结果判断:孔成为一小红点者为阴性,铺开者为阳性,最终人血中抗甲状腺球蛋白抗体的量,可以从倍比稀释的最大稀释度的阳性孔来确定。
实例一
取昆明种小白鼠100只,放血处死后取甲状腺组织,匀浆后加PBS离心,取上清,经37%和42%饱和度硫酸铵间的沉淀,并经Sephadex-G200柱分离取第一个蛋白峰获小鼠甲状腺球蛋白51.3mg;采绵羊血20ml加到100ml生理盐水中(含肝素抗凝),血球经PH7.2、PBS洗三次后用0.15%戊二醛250ml固定后,以0.15MNaCL洗8次;将血球于0.1%NaN3、PBS50ml中4℃存放备用。取制备的固化血球压积0.5ml加到100ml、PBS中,加等体积0.005%鞣酸液37℃混合10分钟,再用PBS洗三次,悬血球于100ml生理盐水中,加100ml小鼠甲状腺球蛋白液(0.1mg/ml),于37℃混合10分钟,以0.1%明胶PBS洗一次后,悬成0.5%细胞液;分别取正常人血清和桥本氏甲状腺病患者血清以固化小鼠甲状腺球蛋白血球做血凝反应,正常人血清为阴性,而桥本氏甲状腺病者血清为强阳性,所制固化鼠TG血球放4℃两个月后再用来检测血清,结果不变。
实例二
取昆明种小白鼠300只以本法制小鼠甲状腺球蛋白163.5mg,制取固化血球压积5ml,分别取小鼠甲状腺球蛋白5mg和固化血球压积0.25ml,制得固化小鼠甲状腺球蛋白血球使用液50ml,取本试剂检测桥本氏甲状腺病患者血清,有强阴性反应,表明此血清中有抗甲状腺球蛋白抗体存在,试剂放置2.5月后重复测试,结果不变。
本发明与现有技术相比具有如下优点:
1、检测病人血清中抗甲状腺球蛋白抗体的成本大为降低。
2、不需特殊设备条件,在我国乡卫生院可开展此项检测。
3、由于利用了不同种属间相同作用的分子和相同或相似的结构这一原理,因而在检测中大大降低了假阳性反应。