逆流聚焦电泳装置 本发明涉及一种用电泳法分离和分析(生物)化学系统的装置与方法。
近十几年来，电泳分离分析技术得到迅速的发展，它利用不同离子(带电粒子)在电场中具有不同的运动速度而形成不同的电泳区带，根据不同的分离模型及分离性能，可分为区带电泳、等速电泳和等电聚焦电泳，尤其是近几年来，有关毛细管区带电泳的文献急剧增长，1989年以来各大仪器公司争先推出各种型号的仪器，但是为了得到高的分辨率和分离速度，毛细管区带电泳必须在分离管两端施加数万伏的高压，进样量只能为纳升甚至亚纳升级，而要准确且自动化地把纳升级的样品注入毛细管都是一个很大的难题，而且进样量很小也导致检测浓度下限不理想，为了提高检测浓度的下限，必须找到可以现场浓缩的理想办法；样品区带在毛细管运动并逐渐移向检测窗口，使阵列化毛细管电泳的发展遇到检测系统过于复杂的困难。
本发明的目的旨在提供一种从原理上根本性地改变已有的各种电泳分析模式，实现分离样品按其有效电迁移率的大小而定位聚焦，具有区带自动浓缩聚焦，峰容量大，工作电压低，电泳通道短，分析速度快，适应范围广的逆流聚焦电泳装置。
本发明设有充满电泳溶液的电泳通道，长度方向坐标为x；设有与电泳通道并行而且在通道内相互接触地固相离子导电体，其长度方向与x相同；设有电泳溶液驱动器，电泳溶液驱动器的两端与电泳通道两端连接，驱动电泳通道的电泳溶液在x方向流动，流动方向与待测离子泳动方向相反(逆流)，其线速度vx与电泳溶液驱动离子朝x方向泳动的电场强度εx之比vx/εx为x的单调函数；设有正、负电极室，正、负电极室分别接电泳通道的两端并设置正、负电极，下、负电极连接直流电源，正、负电极室注入电解质溶液；通电后，电场εx驱动待测的阴离子向正电极方向泳动(以分离阴离子为例，下同)。
所说的电泳通道为液相导电体，例如，充满电泳溶液管道，沟道或利用毛细现象吸满电泳溶液的多孔介质(如纸条，凝胶或纤维素膜)。
所说的固相离子导电体，可呈带状，例如阳离子交换树脂带或离子交联高分子带。
固相离子导电体与电泳通道紧密接触，成为并行的导电体，两个导电体内的阳离子可越过两相交界面而流动。
逆流聚焦电泳是不同于区带电泳、等速电泳、等电聚焦的一种电泳新技术，它具有区带自动浓缩聚焦、峰容量大、工作电压低等显著特点，犹如等电聚焦；而分析速度之快及适用对象之广泛则如区带电泳。可用于无机物及有机物(大、小分子)的分离分析，在生化研究、临床检验以及食品、医药、环保等领域都有广泛的应用前景。
对本发明的逆流聚焦(Counter Flow Focusing，简称CFF)而言，待分离的i离子在电泳通道(x方向)作定向运动，在溶液流动状态下，其定向运动净速度vix为vix＝vx-εxuix，其中：vx为电泳溶液在x方向流动的线速度；εx为电泳溶液驱动离子朝x方向泳动的电场强度；uix为离子在x处的有效电迁移率。在不同电泳类型中，vix有不同结果。
对等电聚焦(IEF)而言，电泳溶液(或凝胶)不流动，故vx＝0，而所使用的电泳溶液是两性电解质溶液，其pH为x函数(形成pH梯度)，导致两性电解质的uix为x的函数，在等电点处uix＝0，所以vix＝0(可以聚焦)，该方法仅适用于蛋白质之类两性电解质的分离。
对区带电泳(ZE)而言，εx、uix均为与x无关的常数，所以vix与x无关，但与离子种类i有关，各区带以不同的速度恒速前进而最终完成分离，不能聚焦。区带在前进中因扩散，对流等原因而延长并导致稀释。
对等速电泳(ITP)而言，区带分离后自动调节各区带浓度和电场，使反比于该离子迁移率，各组分区带εxuix乘积恒定，因而vix与组份及x均无关。各区带衔接并等速前进，不能聚焦。
而本发明(逆流聚焦电泳，CFF)中无须形成pH梯度，uix虽为常数，但技术上利用上述特殊设计的电泳通道，实现了vx/εx为x单调函数，当vx/εx＝ui处，vix＝0，所以i离子能聚焦在相应的位置x处。分离浓缩聚焦三者同时实现，检测浓度下限降低，电泳通道大为缩短，工作电压大为下降，有利于实现通道阵列化。此外，由于无需梯度pH缓冲液，只要有效电迁移率ui有差异即可分离，故不限于蛋白质之类两性电解质的分离，应用范围广泛。
本发明与现有三大类电泳技术的比较可见下表：电泳技术名称 特点与功能 分离依据 与 应用范围能否现场浓缩， 聚焦？ 本 技 术 逆流 聚焦 电泳 (CFF)溶液流动与电迁移反向，特殊通道设计，使各离子的净速度vix与位置有关。各离子能分别聚焦在其净速度vix等于零的位置。依据有效离子迁移率差异而分离。应用范围与区带电泳同样广泛。聚焦并浓缩。电泳通道短。工作电压低。 现 有 技 术 等电 聚焦 电泳 (IEF)特殊缓冲介质，使pH与位置有关。能分离蛋白质之类，并聚焦在各自等电点的pH位置。依据等电点差异而分离，只能用于分析蛋白质之类。聚焦并浓缩。电泳通道短。 等速 电泳 (ITP)自动调节各区带电场，使反比于该离子迁移率。各区带衔接并等速前进。不能聚焦，峰容量不很大。依据有效离子迁移率差异而分离。不聚焦，可能浓缩或变稀。电泳通道长。 区带 电泳 (ZE)pH及电场均与位置无关，各离子区带以不同的速度恒速前进而最终完成分离，不能聚焦。依据有效离子迁移率差异而分离。应用范围广泛。不聚焦，不浓缩，随时间变稀。电泳通道长。
综上所述，本发明有如下优点：
1.自浓缩作用：聚焦后样品组分被限制在一个极短的区带之内，浓度可提高一个数量级，它与等电聚焦相同，而区带电泳不具备这种作用，等速电泳虽有一定浓缩作用，但区带组分浓度受前导电解质溶液控制不可能提高，由于它这一作用，逆流聚焦电泳的峰容量大。
2.区带自锐化：当i离子因扩散或对流偏离聚焦点时，在电场强度和逆向水流两种因素同时作用下会自动回到聚焦点。
3.电泳通道短(通常为数厘米)，工作电压低(一般为数百伏)，因而分离时间短，发热量小，仪器可小型化，价格低廉，使用安全。
4.到聚焦状态后，区带可长时间稳定不变(不移动)，便于对分离全过程进行监测；通道短而直，有利于多通道阵列式，可采用CCD摄象技术。
图1为本发明的结构示意图。
图2为固液两个导电体的结构示意图。
图3为溴酚兰与氨基黑的分离与聚焦效果。
以下结合实例对本发明做进一步的说明。
如图1所示，本发明包括电泳通道和与电泳通道并行而且在通道内相互接触的固相离子导电体(1)、电泳溶液驱动器(2)、电极室(3，4)、正负铂电极(5，6)和直流电源(7)。参见图2，电泳通道(L)为充满电泳溶液的通道，成为液相导电体，长度方向坐标为x；与电泳通道(L)并行而且在整个通道相互接触的固相离子导电体(S)其长度方向与x相同。固液两个导电体内有可移动的共同阳离子(例如Na+)，并可越过两相界面而流动，而待测的阴离子则不许进入固相离子导电体。作为实施例之一，固相阳离子导电体可选用一种阳离子交换树脂材料。
电泳通道的溶液受电渗力及通道两端的液体压差共同控制而流动(线速度为vx)，且带动溶液中的离子流动。流动方向与待测离子的泳动(电迁移)方向相反(逆流，利用电泳溶液驱动器例如泵或液压差形成系统等)。为了实现逆流聚焦原理要求的条件，即vx/εx为x单调函数，可有多种方案。作为实施例之一，可采用电泳通道(L，参见图2)横截面恒定，所以整个通道的任何位置的逆流线速度vx和液相导电率都恒定，而与x无关；而作为并联导电体之一的固相离子导电体的横截面(或导电率)为x坐标的单调函数，显然，通电时x方向形成两个导电体并联，所以在通电时，x方向形成的电场εx为x的函数，这就实现了vx/εx为x单调函数而满足了逆流聚焦原理要求的条件。
设某一待测离子i的有效电迁移率为ui，在通道的某一位置x处，vx/εx＝ui，因而i离子的净速度为零(vix＝vx-εxui＝0，)所以i离子聚焦在x处。ui不相同的离子则聚焦在不相同的x处。达到分离浓缩聚焦三者同步实现的效果。
电泳通道的材料可采用化学惰性绝缘材料，例如石英材料，玻璃，塑料等，通道长度为1～10cm，截面为10-7～10-2cm2，充满缓冲液。施加的直流电源电压仅数百伏，例如100～1000V。施加直流电源电压并控制溶液逆流后，各待测离子即逐步相互分离并依据其有效电迁移率ui的大小在不同的位置上聚焦。图3给出样品为溴酚兰与氨基黑混合物(各为7×10-7mol/l，注样体积为2×10-3cm3)的分离与聚焦效果，曲线a，b，c分别表示分离的初始状态、中间状态和最终聚焦状态。
本发明的检测方法与手段可利用已有的用于各种电泳的各种光学、电化学、质谱学等方法与手段进行。