免疫测定方法 本发明涉及用于检测二酰基肼化合物的免疫测定方法。
测定二酰基肼化合物的方法是已知的。例如高压液相色谱(HPLC)，气液色谱(GLC)，GC-质谱分析法，和HPLC-质谱分析法是目前存在的少数几个方法。但是，这些方法存在一些缺点。这些方法一般需要昂贵而复杂的仪器。另外，样品的制备和分析很长，需要对这些方法特殊训练过的化学家和技术人员。此外，这些现有的技术方法不能在同一步骤快速筛选类似物或代谢物或两者。另外，在检测之前一般需要分离个别化合物。所以，对于快速低耗测定如需要在田间测试或大量测试时这些方法是行不通的。
二酰基肼化合物的特殊作用是作为杀虫剂，具体是作为加速毛虫脱皮化合物(MAC)。和所有潜在的有害化学物质一样，这些杀虫剂受政府部门的控制。在得到调控性批准的过程中，根据联邦杀虫剂，杀真菌剂和杀鼠剂条例(FIFRA)登记规则，细则O要求需要对残留物分析，该分析要求对这些使用具有适当灵敏度的测定方法。另外，测定方法必须与二酰基肼杀虫剂的主要代谢产物有交叉反应性以便适用于FIFRA登记规则，细则N要求的代谢和环境影响研究。为了监测杀虫剂的用法可能也需要这些测定。
所以，需要一种二酰基肼测定方法，它具有足够的灵敏度和交叉反应性满足FIFRA规则，能快速筛选，使用简单而廉价。
本发明人已经开发了一种免疫化学测定，它足够灵敏，具有足够的交叉反应性以满足FIFRA规则的要求准予使用。此外，测定方法使用简单而廉价。
在本发明的第一个方面，提供了一个免疫原，包括：与载体物质偶联地下列通式的化合物其中R，R1，R2，R3和R4各自单独是，氢，(C1-C6)烷基和取代的(C1-C6)烷基，(C2-C6)链烯基和取代的(C2-C6)链烯基，(C1-C6)烷氧基，(C1-C6)羧基烷基，和卤原子。
在本发明的第二个方面，提供了测定二酰基肼或其衍生物的方法，包括步骤(A)提供含有未知量的二酰基肼的样品；(B)在存在固定化二酰基肼抗原时把样品与具有与二酰基肼抗原结合亲和力的抗体接触以便形成结合的和未结合的抗体-抗原复合物；(C)将未结合的抗体-抗原复合物与结合的抗体 抗原复合物分离；(D)用可检测的标记物标记结合抗体复合物；(E)使标记物发生可检测变化；和(F)测定样品中的二酰基肼。
在本发明的第三个方面，提供了测定二酰基肼或其衍生物的方法，包括步骤(A)提供含有未知量的二酰基肼的样品；(B)把样品与具有与二酰基肼抗原结合亲和力的固定化抗体接触以便形成固定化的抗体-抗原复合物；(C)将具有可检测标记物标记的二酰基肼抗原与未复合的固定化抗体接触形成标记的抗体-抗原复合物；(D)使标记发生可检测变化；和(E)测定样品中的二酰基肼。
在本发明的第四个方面，提供了测定二酰基肼的试剂盒，包括(A)具有与二酰基肼结合亲和力的抗体；(B)能够与抗体结合的标记；和(C)存在标记物时能产生可检测变化的底物。
图(1)描述了DEAE离子交换柱的一个蛋白质洗脱过程。
图(2)描述了RH2703的抑制曲线。
图(3)描述了RH2651的抑制曲线。
图(4)描述了RH5992的抑制曲线。
图(5)描述了RH0345的抑制曲线。
图(6)描述了RH2485的抑制曲线。
图(7)描述了在PBST和基质空白样品中得到的外部标准曲线。
图(8)描述了甘蓝样品20139-01的计算出的线性回归线。
图(9)描述了甘蓝样品20139-02的计算出的线性回归线。
图(10)描述了甘蓝样品20139-04的计算出的线性回归线。
图(11)描述了甘蓝样品20139-05的计算出的线性回归线。
图(12)描述了土壤样品151的计算出的线性回归线。
图(13)描述了土壤样品157的计算出的线性回归线。
图(14)描述了土壤样品175的计算出的线性回归线。
图(15)描述了土壤样品187的计算出的线性回归线。
图(16)a和b描述了一个直接测定曲线和直接测定标准曲线。
如本文所用，术语“抗原”被理解为能刺激抗体产生的任何物质。以类似的方式，术语“二酰基肼抗原”被理解为能刺激抗体产生的任何二酰基肼化合物，其中产生的抗体具有与二酰基肼和其衍生物的结合亲和力。同时术语“免疫原”被理解为包括用于诱导免疫应答的任何物质。免疫原一般由载体分子和另一个组分(半抗原)组成。
如本文所用，术语“测定”被理解为包括定性分析，即，鉴定样品中分析物的存在，以及定量分析，即，测定样品中分析物的量。它也被理解为包括标准和标准曲线的制备的术语，这样的制备是本领域熟知的。
如本文所用，术语“二酰基肼化合物”被理解为在它的范围内包括二酰基肼及其代谢物，合成类似物，环境降解物和由此起源的光化学降解物。
如本文所用，术语“IC50”定义为测得的吸光值减少到没有抑制剂存在时的吸光值的到一半所需要的抑制剂的浓度。这一确定是通过绘制剩余活性的百分数(％)相对抑制剂浓度的曲线完成的，其中剩余活性的百分数(％)由
％活性＝(A0-Ai/A0)×100给出，其中A0是没有抑制剂存在时测得的吸光值而Ai是抑制剂浓度为ith时测得的吸光值。从而抑制百分数由关系式100-(％活性)给出。
交叉反应性百分数由方程式：
％交叉反应性＝(IC50.5992/IC50.类似物)×100得到，其中IC50.5992是如上确定的RH5992的IC50浓度而IC50.类似物是类似物即，RH2703，RH2651和RH0345的IC50浓度。
以ng表示的灵敏度是从重复分析标准浓度的标准偏差的回归分析确定的抑制剂的浓度，如方程：
S＝(Yint/m)×V所述，其中S是以ng表示的灵敏度，Yint是吸光值单位表示的来自重复分析的标准偏差的回归线的Y-截距，m是每ng/ml吸光值单位的回归线的斜率而V是加到微滴平板的样品的体积，单位ml。
回收百分数由关系式：
％R＝(C0/Ca)×100计算，其中C0是观察(测定)到的浓度而Ca是实际(最大)浓度。
如上叙述，提供用于制备二酰基肼抗体的免疫原，通常，免疫原包括半抗原和载体分子。
半抗原通常是二酰基肼或其衍生物。在一个实施方案中，半抗原是苯甲酰基肼，该苯甲酰基肼化合物是上面通式(1)的化合物。
合适的(C1-C6)烷基的例子包括，但不限于，甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，异丁基，叔丁基，正-戊基，异戊基，新戊基，正己基，异己基，等等。合适的(C1-C6)取代烷基的例子包括，但不限于，用羟基，卤原子，(C1-C4)烷氧基，和硝基取代的甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，异丁基，叔丁基，正戊基，异戊基，新戊基，正己基，等等。
合适的(C2-C6)链烯基的例子包括，但不限于，乙烯基，正丙烯基，异丙烯基，正丁烯基，异丁烯基，叔丁烯基，正戊烯基，异戊烯基，新戊烯基，正己烯基，等等。合适的(C2-C6)取代链烯基的例子包括，但不限于，用羟基，卤原子，或硝基基团取代的乙烯基，正丙烯基，异丙烯基，正丁烯基，异丁烯基，叔丁烯基，正戊烯基，异戊烯基，新戊烯基，正己烯基，等等。
合适的(C1-C6)烷氧基的例子包括，但不限于，甲氧基，乙氧基，正丙氧基，异丙氧基，正丁氧基，异丁氧基，叔丁氧基，正戊氧基，异戊氧基，新戊氧基和正己氧基。
合适的(C1-C6)羧烷基的例子包括，但不限于，羧基(-COOH)，羧甲基(-CH2COOH)，羧乙基(-CH2CH2COOH)，和羧丙基(-CH2CH2CH2COOH)。
合适的卤原子的例子包括，但不限于，Cl-，Br-，F-，和I-。
在优选的实施方案中，R是-CH2COOH，R1和R2各为甲基而R3和R4各为氢。在更优选的实施方案中，R是-COOH，R1和R2各为甲基而R3和R4各为氢。
载体物质可以是蛋白质，例如但不限于，牛血清白蛋白，卵清蛋白，或钥孔嘁血蓝蛋白；多糖，例如但不限于，葡聚糖，琼脂糖，琼脂或纤维素；或合成的聚合物或共聚物，例如但不限于，聚丙烯醛，聚酰胺，聚丙烯酰胺，聚丁酸酯，聚脲，聚脲酰胺，或聚苯乙烯。
在优选的实施方案中，载体物质是载体蛋白质，更优选的是牛血清白蛋白(BSA)或钥孔嘁血蓝蛋白(KLH)，最优选的是钥孔嘁血蓝蛋白。
本发明的免疫原可以用于制备抗二酰基肼化合物抗体。把免疫原导入合适的动物并收集，分离和纯化抗体。得到的抗体是多克隆抗体，与二酰基肼化合物和其衍生物，特别是苯甲酰基肼和其衍生物具有高结合亲和力和交叉反应性。
另一种可选的方法，利用本领域内熟知的杂交瘤技术将免疫原用于制备单克隆抗体。
在一个实施方案中，制备了抗与载体物质偶联的通式(1)的免疫原的抗体。在优选的实施方案中，制备了抗与载体物质偶联的通式(1)的免疫原的抗体，通式(1)中R是-CH3COOH，R1和R2是甲基，R3和R4是氢。在更优选的实施方案中，制备了抗与载体物质偶联的通式(1)的免疫原的抗体，其中R是-COOH，R1和R2是甲基，R3和R4是氢。
如上叙述，本发明提供测定二酰基肼或其衍生物的方法，首先，该方法包括步骤(A)提供含有未知量的二酰基肼的样品。
样品一般是含有二酰基肼的任何物质。合适的例子包括空气，水，土壤，和生物学物质。在一个实施方案中，样品可以是空气样品或起源于空气样品的样品。在另一个实施方案中，样品可以是水样品或起源于水样品的样品。仍然还有另一个实施方案中，样品可以是土壤样品或起源于土壤样品的样品。
在一个实施方案中，样品可以是生物学物质或含有生物学物质的样品或起源于生物学物质的样品。合适的生物学物质例子包括不限于，植物材料；生物学液体如血液，血清，血浆，淋巴液，胃灌洗液，胆汁，角膜液；生物组织如植物和动物组织，和微生物样品如细菌和病毒。
在优选的实施方案中，样品是土壤或植物材料或起源于此的样品。
二酰基肼化合物如上面通式1所述以及其衍生物。这些衍生物可以是，但不限于，代谢物，合成类似物，环境降解物，起源于此的光化学降解物，特别有用的二酰基肼是根据通式1的苯甲酰基肼，描述在下面的表1中：苯甲酰基肼 R R1 R2 R3 R4 RH5992 -CH2CH3 -CH3 -CH3 H H RH2485 H -CH3 -CH3 CH3 -OCH3 RH2703 -CH2COOH -CH3 -CH3 H H RH2651 -COOH -CH3 -CH3 H H RH0345 -Cl H H H H
在固定化二酰基肼抗原存在下，步骤(B)中步骤(A)的样品与具有与二酰基肼的高亲和力的抗体接触。
抗体如上所述，从含有与KLH偶联的RH2651的免疫原得到的抗体是优选的。
固定的二酰基肼抗原可以是与上述任何载体分子偶联的上述任何二酰基肼。在优选的实施方案中，固定抗原是与载体蛋白偶联的RH2651或RH2703，更优选的是与BSA偶联的RH2703。抗原和载体分子的结合称为包被抗原。
包被抗原一般固定于具有顺从地附着这一抗原的表面的固体支持物上。合适的例子包括，但不限于微滴平板；膜材料如硝酸纤维，纤维素，醋酸纤维素，聚碳酸酯，等等；试管；颗粒如小珠，柱填充材料，等等；和具有能结合附着其上的抗原的结合区的衍生表面。一般包被抗原应用于固体支持物并吸附在其上。
在一个实施方案中，包被抗原吸附在微滴平板上。
在步骤(B)中，游离抗原(即，样品中未知量的苯甲酰基肼)和固定的(即，结合的)抗原之间存在对具有与二酰基肼高亲和力的抗体上的结合位点的竞争。结果是形成结合和未结合的抗原-抗体复合物。在步骤(C)中，结合复合物与未结合复合物分离。分离可以是本领域已知的任何方法，如不限于重力分离，磁分离，以及清洗除去未结合的复合物。
一旦与未结合的抗原-抗体复合物分离，步骤(D)中用可检测标记物标记结合的复合物。标记可以是固定于结合抗原-抗体复合物并可检测的任何物质。标记物可以直接检测或通过与底物反应间接检测。合适的例子包括，但不限于酶，颜色染料，荧光材料，化学发光材料，生物发光材料，和放射性同位素。在优选的实施方案中，可检测的标记是酶。通常，酶与具有与结合抗体-抗原复合物结合亲和力的物质偶联。标记物与复合物的结合可以是抗体-抗原，蛋白质-配体，或抗生物素蛋白(链霉抗生物素蛋白)-生物素的结合。在优选的实施方案中，结合是抗体-抗原结合，其中标记结合于具有结合抗体-抗原复合物结合亲和力的抗体。这样的结合导致本领域熟知的典型“夹层”构型。与标记结合的抗体可以是多克隆或单克隆。另外，可以使用含有抗体结合区的任何上述抗体的抗体片段如Fab片段。当然，与标记物偶联的特殊抗体将依赖于与抗原偶联的抗体的类型。那就是，所选择的与标记物偶联的抗体与固定抗体-抗原复合物有结合亲和力。
例如，在优选的实施方案中，本发明中，在兔中产生与抗原偶联的抗体。因此，与标记偶联的抗体是与兔抗体有结合亲和力的抗-兔抗体。
一旦标记了固定化抗体-抗原复合物后，在步骤(E)中在标记物上产生可测定的变化。这一可测定的变化可以由紫外可见光、荧光、电波辐射产生，或导入与标记物反应的底物产生可测定的变化。可理解的是，可测定变化可以是标记固有的，例如，标记可以是放射性同位素，其中放射性，如γ射线，可以简单地通过导入手段产生以便测定放射性。
在一个实施方案中，其中可测定变化是通过将标记的复合物与底物接触实现的。这样的底物是本领域熟知的并依赖于所用的标记类型。在优选的实施方案中，标记物是酶而底物是能够与酶反应产生可测定变化的化合物。在更优选的实施方案中，酶是磷酸酶而底物是磷酸化合物。酶和底物的相互作用一般产生具有可测定特性的化合物。例如化合物是荧光的，具有强吸光值，等等。
最后，在步骤(E)产生可测定变化后，在步骤(F)测定二酰基肼。这样的测定方法是本领域已知的方法，例如，紫外可见分光光度计，荧光光度测定法，γ计数，等等。
一般认为上面叙述的测定方法是间接测定。同时，应理解包括在本发明范围内的还有直接测定。首先，直接方法包括在步骤(A)提供含有未知量的二酰基肼的样品。样品和二酰基肼如上所述。
步骤(A)的样品在步骤(B)中与具有与二酰基肼的结合亲和力的固定化抗体接触形成固定化的抗体-二酰基肼复合物。抗体如上所述，RH2651产生的抗体是优选的。
抗体一般固定于具有顺从地附着这一抗体的表面的固体支持物上。合适的例子包括，但不限于微滴平板；膜材料如硝酸纤维，纤维素，醋酸纤维素，聚碳酸酯，等等；试管；颗粒如小珠，柱填充材料，等等；和具有能结合附着其上的抗体的结合区的衍生表面。在优选的实施方案中，如上关于包被抗原的描述，抗体是固定于固体支持物上的包被抗体。
步骤(B)中，游离抗原(即，样品中未知量的苯甲酰基肼)填充了固定化多克隆抗体的结合位点形成固定化抗体-抗原复合物。步骤(C)中用可检测标记物标记的二酰基肼抗原与未与样品中苯甲酰基肼结合的固定化抗体的位点接触。从而，标记抗原将填充抗体的剩余结合位点。以致固定化抗体与标记的和未标记的抗原偶联。二酰基肼抗原和标记如上所述。但是，在优选的实施方案中，抗原是RH2651而标记物是酶，优选的是辣根过氧化物酶(HRP)。
最后，在步骤(D)中在标记物上实现可测定变化并在步骤(E)中测定二酰基肼。可测定变化的产生和二酰基肼的测定如上对间接测定所述。
本文所述的对二酰基肼如RH5992和它的衍生物RH2703，RH2651，RH0345和RH2485的测定足够灵敏可用于FIFRA登记要求的田间残留物研究。此外，该测定方法有足够的与结构不同的类似物如RH0345的交叉反应性，因此确信该测定将适用于取代的N-叔丁基-N，N’-苯甲酰基肼杀虫剂的全部类型。
除了测定的灵敏度(ppb)和它通用于RH5992代表的杀虫剂类型以外，最大的优点可能是增高的实验室效率。例如，已经证明一个分析员每天能容易地完成20个样品。这一估价包括样品制备和结果计算。假如1天工作10小时，每个样品只需消耗30分钟的劳动。
本发明抗体的其它用途包括将抗体与固体支持物结合以便浓缩样品基质中的残留物，所以可以用荧光标记标记它们并用于组织研究以鉴定杀虫剂残留物在细胞腔隙的位置。这一信息提供了关于特殊二酰基肼化合物的毒性和代谢的作用方式或机制的重要信息。同时，直接免疫测定方法可以结合进田间分析的“浸枝”试验和检查应用的类型。
下面的缩写被用于下面的实施例中以及本说明书的其它部分。BCA Bicin choninic 酸BSA 牛血清白蛋白DCC 二环己基碳化二亚胺DEA 二乙醇胺DMF 二甲基甲酰胺HRP 辣根过氧化物酶KLH 钥孔嘁血蓝蛋白NHS N-羟基琥珀酰亚胺PBS 磷酸缓冲盐水PBST PBS和0.01％吐温20PNPP 对硝基苯磷酸
实施例1免疫原合成
在5ml梨型烧瓶中加入21umole半抗原RH2651，并溶解于200ulDMF(Fisher Scientific)。在另一4ml试管中将16mgDCC(EM Sciences)和9.1mgNHS(Sigma Chemical)溶解于200ulDMF。将DCC和NHS转移到含有半抗原的烧瓶中，反应物在室温下搅拌约2小时。转移反应物到冷室，继续在4℃搅拌过夜。
在5.4ml去离子水中重新配制载体蛋白，KLH(ImjectR，PierceChemical Co.重新配制时将20mg蛋白质(pH7.2)溶于PBS)。转移活化的半抗原至小离心器(235B型小离心器，Fisher Scientific)离心5分钟除去取代脲沉淀。转移上清液到重新配制的载体蛋白溶液并在室温连续搅拌4小时。
以14000rpm将蛋白质反应混合物离心5分钟除去沉淀蛋白。将全部体积的上清液加到SwiftR聚丙烯酰胺去盐柱(Pierce Chemical Co.)上并用0.01M PBS(pH7.3)洗脱，以3ml一部分收集。在样品完全加到柱上后收集这些流份。取10个3ml流份并测量280nm处每流份的吸光值。合并含有免疫原的流份并用BCA方法测定蛋白质浓度(参见BCA蛋白质测定试剂说明-Pierce Chemical Co.)。
半抗原/蛋白质结合比例确定如下。建立了254nm处0ug/ml-1200ug/ml范围的KLH的吸光值标准曲线。根据标准曲线将BCA方法测得的免疫原流份的蛋白质浓度转变成254nm的吸光值。建立了浓度范围26260nmole/ml的RH2703和浓度范围为6.5-210nmole的RH2651在254nm处的吸光值标准曲线。
测定254nm处免疫原的吸光值(Aconj)，减去计算得的254nm处KLH的吸光值(AKLH)得到半抗原产生的吸光值(AHap)。从标准曲线转变该值(AHap)成为半抗原的浓度(nmole/ml)。
从半抗原的计算浓度(nmole/ml)除于免疫原的测定浓度计算半抗原对蛋白质的摩尔结合比例。使用的KLH平均分子量为6.7×106道尔顿。将摩尔结合比例除于670得到每10,000原子质量单位的KLH中半抗原分子的平均数。结果列于表2中。
实施例2其它免疫原的合成
按照实施例1的方法制备免疫原，但所用的半抗原是RH2703。结果表示在表2中。
实施例3包被抗原合成
按照实施例1制备免疫原的方法制备包被抗原(RH2703和RH2651)，不同的是BSA(ImjectR，Pierce Chemical Co.)代替KLH作为载体蛋白。用于计算摩尔结合比例的BSA平均分子量是68,000道尔顿。将摩尔结合比例除于6.8得到每10,000amu BSA的半抗原分子平均数。制备的包被抗原的结果表示在表2中。
表2 样品 蛋白质 μmol/ml 半抗原 μmol/ml半抗原/蛋白 质 N(1) RH2651-KLH 2.8×10-4 0.437 1560 2 RH2703-KLH 2.9×10-4 0.943 3250 5 RH2651-BSA 0.03 1.5 50 7 RH2703-BSA 0.04 2.2 50 8(1)N是每10,000原子质量单位的蛋白质的半抗原分子数。
实施例4抗体的生产
从2.5ml免疫原(在0.01M PBS中重新配制为1mg/ml的实施例2的产物)，25mg结核分支杆菌悬浮液和2.5ml弗氏佐剂制备初级接种物。将混合物匀浆化直到粘稠和奶油色。
利用新西兰白兔(5)生产抗体。兔子是重量在4.75-5.5磅之间的无疾病的雌性。首先将抗百日咳杆菌(制备成0.6ml盐水中悬浮6×1010细胞的百日咳杆菌接种物)肌肉内接种兔子并采血提供背景效价。
每个兔子皮下注射的初级接种物的剂量是1.0ml。接种兔子并每21天接受加强的免疫接种。在第四次加强注射8天后，给兔子放血收集抗体。在另一个时间周期后，再开始加强注射并在第四次加强注射后再做生产放血。
实施例5测定兔抗血清
在包被缓冲液(PBS，pH7.2)中将包被抗原重新配制为起始浓度约10ug/ml。将96孔微滴平板的第1和2列的孔保留用于对照样品。首先在第3列的孔中加入200ul起始浓度的包被抗原。第4-12列的孔含有100ul包被缓冲液。转移第3列的孔中的100ul包被抗原部分到第4列的孔中与包被缓冲液混合，以这种方式，在每个随后获得的列的孔中用包被缓冲液以1∶2系列稀释包被抗原。稀释过程继续到第11列，其中包被抗原进行了1∶256的稀释。丢弃最后的100ul。只含有包被缓冲液没有抗原的第12列的孔作为阴性对照。孔A1和A2是空气空白，不接受试剂。孔B1和B2用包被抗原包被并且是背景孔。孔C1和C2被100ul包被缓冲液中的KLH(约10ug/ml)包被作为阳性对照。其余的孔D1-H2是未处理的。用封口条封住这样制备的平板，用塑料包被覆盖包裹，放置于冰箱中，在4℃温育过夜。
过夜温育后，从冰箱中取出平板并倒空。用300ul BSA封闭液(1％BSA，pH7.2由在100mlPBS中溶解1.0g BSA制备)封闭孔(除了A1和A2)中的未结合结合位点。该溶液至少在室温下温育10分钟。
用封闭液1∶1000稀释测试样品，在A排中从A3孔开始将200ul加到孔中。B3-H3排的孔含有100ul封闭液。转移A排孔的测试样品(100ul)到B排孔并完全混合。以这种方式1∶2连续稀释样品到G3排的孔(1∶64000)并丢弃最后100ul。H3排的孔不含有抗体是阴性对照。用100ul封闭液1∶500稀释的预血清温育背景孔B1和B2。用测试样品的1∶1000稀释液温育阳性对照孔C1和C2。用测试样品温育平板约1小时。
温育后，除去测试样品并用洗液洗孔。用缓冲液冲洗孔4-5次。在第三或第四次洗涤时。允许缓冲液保留在孔中，在丢弃前浸泡3-5分钟。用1ml 50％的甘油重新配制与碱性磷酸酶(Pierce Chemical Co.)连接的山羊抗兔IgG并用封闭液稀释1∶5000。在每个孔中加入100ul该溶液并在室温温育平板至少1小时。洗去过量的抗兔抗体，在每个孔中加入100ulPNPP溶液(5mgPNPP溶解于8ml去离子水和2ml DEA缓冲液)。在室温温育平板30分钟。然后加入50ul 2N NaOH终止酶反应。用DynatechMR5000微滴平板读数器测定410nm处每个孔的吸光值。结果表示在表3中。
表3 免疫原 兔#试验血样#1试验血样#2生产血样#1 生产血样#2 RH2651-KLH 1331 1/32000 1/64000 1/64000 1/128000 RH2651-KLH 1332 1/32000 1/128000 1/64000 1/128000 RH2651-KLH 1333 1/32000 未采血2 1/64000 1/128000 RH2651-KLH 1334 1/32000 1/64000 1/128000 1/128000 RH2651-KLH 1335 1/32000 1/32000 1/128000 1/128000 RH2703-KLH 1336 1/16000 1/64000 1/64000 1/128000 RH2703-KLH 1337 1/16000 1/64000 1/64000 1/128000 RH2703-KLH 1388 1/16000 1/64000 1/64000 1/128000 RH2703-KLH 1399 1/32000 1/64000 1/64000 1/128000 RH2703-KLH 1340 nd1 1/64000 1/64000 1/1280001没有测定抗体效价。2该动物的耳疤痕阻止了获取测试血。
实施例6分离和纯化抗体
合并实施例3的注射过程中收集的免疫血清并用BCA方法测定总蛋白，发现是66mg/ml。测定免疫血清的体积并分成两个各90ml的相同的等分试样。一个等分试样用两倍体积的去离子水稀释。用等体积的4M硫酸胺依次稀释得到的溶液体积最后得到2M硫酸胺溶液。在室温搅拌悬浮液过夜。通过在10000g-av.离心30分钟收集蛋白质沉淀。蛋白质沉淀溶解于最小体积的0.02M磷酸钠缓冲液(pH8.0)，该缓冲液是通过稀释0.1M磷酸钠缓冲液制备的。
在2L 0.02M磷酸钠缓冲液(pH8)中，在室温透析重新配制的蛋白质溶液4小时，然后在4L中，在4℃透析过夜，最后在4L中，在室温下透析4小时。
利用DEAE纤维素(DE52，Whatman，Inc.)用两个独立的等分试样从合并的抗血清离子交换纯化IgG，该纤维素湿体积为150ml，在2.6cm(i.d.)的柱中填充了约26cm高的床。用0.02M的磷酸钠缓冲液(pH8.0)平衡柱。柱的蛋白质容量约为1.5g(每ml湿体积10mg)。将全部体积的透析蛋白溶液泵到柱上，用0.02M的磷酸钠缓冲液pH8.0开始洗脱。调整流速到约5ml/分钟，每5ml收集流份。开始的150ml洗脱液含有任何未保留的蛋白质。
在开始的150ml后，线性梯度摩尔浓度连续变化到0.3M。梯度是在两个梯度形成室形成的，第一个室含有250ml 0.02M缓冲液，第二个室含有250ml 0.3M缓冲液。洗脱过程中连续搅拌第一个室，以5ml一管的流份收集接下来的500ml洗脱液。通过测定280nm的吸光值检测蛋白质洗脱液，将吸光值对洗脱体积(收集管号#)绘图得到层析谱。
通过本文叙述的间接方法测定每一管的等分试样的IgG。合并含有IgG的部分，用具有Amicon滤纸(分子量排斥极限-10,000道尔顿)的搅拌细胞浓缩器减少体积。用标准的BCA方法测定合并的浓缩的IgG流份的蛋白质浓度。在蛋白质溶液中加入无菌过滤和-20℃储存的叠氮化钠。来自DEAE离子交换柱的蛋白质洗脱曲线描述在图1。开环代表从280nm处的吸光值测得的总蛋白。闭环代表410nm处间接测定测得的每流份的抗体效价。合并部分流份号51-80，用蛋白质亲和层析进一步纯化。
用蛋白质A亲和Pak柱和免疫纯RIgG缓冲液(免疫纯IgG纯化试剂盒，Pierce Chemical Co.)亲和纯化DEAE纯化的IgG(1mg/ml)。放置蛋白质A柱和缓冲液至室温，用5ml结合缓冲液洗柱。1∶9稀释DEAE纯化IgG得到蛋白质浓度6mg/ml，将1ml等分试样加至柱上。用另外15ml结合缓冲液洗柱。
用5ml免疫纯IgG洗脱缓冲液进行IgG的洗脱，获取1ml流份。测定280nm处每部分的吸光值，用预先用10ml 0.02M PBS(20mM磷酸钠，100mM NaCl，pH7.4)调节过的5ml前纤维素柱对具有显著吸光值的流份(流份3)去盐。利用10个1ml的0.02M PBS等分洗脱，收集1ml一流份。用BCA方法测定每个流份总蛋白的吸光值。
1∶5稀释蛋白质A亲和层析纯化的IgG得到蛋白质浓度1mg/ml。从66mg/ml的平均总血清蛋白质得到估计的9mg/ml IgG浓度，估计的IgG回收率是67％。
实施例7间接测定的最佳化
利用RH2703-BSA作为包被抗原。在存在恒量蛋白质A纯化IgG(10ul 20ug/ml溶液，100ng/孔)时，通过方格型测定(参见Voller等人，Bull of World Health Organization，53，35(1976))使存在最小量的抗原(RH2703)时得到可读反应(0.3-0.5吸光值单位410nm)需要的浓度最佳化。在存在恒量包被抗原(RH2703-BSA，100ul 10ug/ml溶液)时获得对最小量的RH5992的可读反应使蛋白质A纯化IgG的浓度最佳化。
抗体浓度最佳约为20ug/ml(100ng/微孔)而包被抗原最佳为25ng/ml或2.5ng/微孔。当转换成摩尔基础并假设半抗原/蛋白质结合比例为55，半抗原摩尔数超过加入的IgG三倍。
确定了存在最佳浓度的RH2703-BSA包被抗原时RH2703，RH2651，RH5992，RH0345和RH2485对蛋白质IgG的抑制百分数。在从没有测试物质0ng/ml到1000ng/ml范围的7个浓度测试每个测试物质。每个浓度的测试重复7次。抗原阴性和抗体阴性孔提供阴性对照而KLH/抗KLH孔用作阳性对照。
用含有0.1％吐温20的包被缓冲液作测试物质储存液的系列稀释得到1000ng/ml，100ng/ml，10ng/ml，1ng/ml，0.1ng/ml，0.01ng/ml测试浓度。包被缓冲液w/0.1％吐温20用作0ng/ml测试浓度。在室温用10ul蛋白质A IgG(20ul/ml)温育测试浓度的测试物质(每个190ul)1小时。在温育周期后，转移100ul测试物质-IgG混合物到适当的微滴孔。微滴孔已经用最佳浓度的RH2703-BSA包被并用0.3ml的包被缓冲液中的1％BSA溶液封闭过量的蛋白质结合位点。在室温再温育平板1小时。
在第二次温育后，洗涤平板，加入与碱性磷酸酶偶联的山羊抗-兔免疫球蛋白(用1ml 50％甘油重构0.6mg，随后用封闭液稀释1∶5000-Pierce Chemical Co.)。如实施例5所述温育，洗涤平板，加入PNPP底物。不加入NaOH终止液，在读410nm处吸光值之前允许平板显色2小时。抑制曲线描述在图2-6。特殊的纯化抗体特征数据表示在表4中。
如上所述确定IC50。用Microsoft Excel Analysis ToolPak(微软公司，版权1993)设定的指数曲线分析活性百分数对抑制剂浓度的关系。为了计算IC50，当y等于50，即保留50％活性或50％抑制时，由指数方程y＝bmnx得到x。用Microsoft Excelc，Ver5.0制图法(微软公司，版权1993)进行制图。
如上所述从IC50计算交叉反应百分数。用Microsoft Excel，Ver5.0制图法(微软公司，版权1993)制得从7个抑制剂浓度得到的7次重复分析的平均吸光值的图。将线性动力学范围显示在从各种抑制剂浓度在410nm处的吸光值的图得到的曲线的线性部分。如上所述计算灵敏度。
定义检测的极限为三倍的测定背景噪音，为了估计背景噪音，计算了每个抑制剂浓度的重复分析的标准偏差，进行回归分析的最少平方法。将回归线的y-截距当作噪音产生的背景吸收。以3乘背景吸收，用线性范围得到的标准曲线的斜率相除，转换成抑制剂浓度。定义这样得到的浓度为抑制剂的测定极限。
表4 检测物质IC50，ng/ml灵敏度ng检测极限ng/ml交叉反应性％ RH5992 0.61 0.07 0.66 100 RH2703 1.13 0.19 1.7 54 RH2651 1.59 0.22 1.9 38 RH0345 6.5 0.08 0.75 9 RH2458 0.05 0.08 1.8 NA
实施例8-19间接测定
用100ul/孔的RH2703-BSA包被抗原(10ug/ml)包被微滴平板得到每孔包被量1ug。在4℃温育平板过夜。在使用前用300ul/孔的1％的包被缓冲液中的BSA溶液封闭未结合的蛋白质结合位点。
取约1g甘蓝和土壤样品的等分试样。将甘蓝样品#03(1.0191g)和土壤样品#49(1.0180g)作为对照并用50ng或500ng的RH5992示踪以便测定回收率。样品和所用的样品量示于下面表6中。
将样品等分试样置于25ml圆锥型离心管并用50或500ng的RH5992示踪回收样品，该RH5992是用PBST稀释RH5992储存标准液(乙腈中1mg/ml)制备的。
通过用声波细胞破碎器(SonicatorHeat Systems，Inc.W-225R型，带有H-1微端探针)在80％功率声波处理3分钟，用5ml PBST等分试样萃取样品。以4000g离心萃取混合物5分钟，轻轻倒出PBST层。用PBST稀释每种样品的等分试样得到原始样品提取物的1∶100稀释液(甘蓝样品)和1∶500稀释液(土壤样品)。
将稀释样品的等分试样(180ul)与10ul每种RH5992标准液(2，10，20，100，200和2000ng/ml)和IgG(10ul)混合得到具有RH5992最后浓度分别为0.1，0.5，1，5，10，和100ng/ml的样品。样品在12×8排列的96孔形式的硼硅酸酯玻璃管中完全混合。对应于抗体阴性孔的管含有10ul缓冲液。对应于抗原阴性孔的管没有IgG加入并含有100ppb的PBST中的RH5992。对应于KLH阳性对照的管空着。
在1小时的温育周期后，转移100ul示踪样品到微滴平板并继续温育1小时。
温育后，如上所述洗涤平板并加入100ul与碱性磷酸酶偶联的山羊抗兔IgG并在室温温育1小时，温育后，再洗涤平板，加入100ul PNPP底物。继续用底物温育1-2小时并用Dynatech MR5000微板读数器测定410nm处的吸光值。计算抗原阴性孔测得的吸光值的平均值并自动将它从测试孔中除去，以这种方式除去抗体非特异结合产生的吸光值。
用标准加法定量样品中的残留水平。用Microsoft Excel，Ver5.0制图法从减去了非特异结合的重复样品吸光值的平均倒数得到吸光值倒数相对加入的抑制剂浓度的图。用Microsoft ExcelAnalysis ToolPak将得到的数据代入方程式y＝mx+b。在这个关系式中，y是实验测得的吸光值倒数，b是常数，m是计算的斜率而x是加入的抑制剂的浓度。计算每个数据点相对于来自线性方程的有关计算值的标准误差，最后除去无关的值。
当y等于不加抑制剂测得的吸光值倒数时解对于X的线性方程，得到样品浓度。乘以对应的稀释因子将结果转换成总ng数。用取的样品质量除于总ng数得到最后结果ng/g。
用外部标准方法建立定量样品残留物的标准曲线。用Microsoft ExcelAnalysis ToolPak进行指数曲线设定和线性回归分析。如上所述计算回收百分数。
用外部标准法和内部标准法(加法)分析峰值为50ng/g和500ng/g的回收样品。回收百分数的结果表示在表5中的圆括号中。在PBST和基质空白样品(甘蓝样品#03和土壤样品#49)中得到的标准曲线图表示在图7中。
表5 样品 内部标准Cng/g 外部标准Cng/g 甘蓝R1 52(104％) 53(106％) 甘蓝R2 471(94％) 426(85％) 土壤R1 55(110％) 55(110％) 土壤R2 511(102％) 514(103％)
来自甘蓝和土壤样品的内部标准分析的结果表示在表6中。一星期后再分析两个甘蓝和土壤提取物估计样品基质的稳定性。结果表示在圆括号中。每个样品的计算线性回归线表示在图8-15。
表6 样品ID Cug/g 样品ID Cug/g 甘蓝 土壤 20139-01 1.75(1.41) 92-0017-151 41.4 20139-02 2.41 92-0017-157 20.0 20139-04 5.92 92-0017-175 18.4 20139-05 13.2(12.9) 92-0017-187 28
实施例20标记抗原的合成
将4.6mg(10.5umole)量的RH2651置于5ml的梨型烧瓶并溶解于100ml DMF。在另外的试管中，将4.6mg NHS和8.8ul DCC各溶解于100ulDMF。将NHS和DCC加入RH2651并在室温搅拌约一小时。在4℃继续搅拌过夜。接着将10mg HRP溶解于2.7ml 0.01M PBS，pH7.2。在Beckman小离心机E(Beckman仪器)离心RH2651/NHS/DCC三次。将上清液逐滴加入HRP并搅拌。在室温搅拌混合物4小时，然后在小离心机中离心3分钟。用PBS平衡过的Swift去盐柱(Pierce Chemical Co.)对含有偶联蛋白质的上清液去盐。用PBS洗脱蛋白质并以3ml/份收集流份。合并280nm的吸光值确定的含有蛋白质偶联物的流份并用BCA蛋白质测定法(PierceChemical Co.)确定蛋白质浓度。
如下证明RH2651与HRP的结合。用100ul的10ug/ml 2651-HRP包被微板孔并在4℃储存过夜。倒空平板后，用1％的PBS中的BSA封闭孔。封闭后，在孔中加入按照实施例6制备的蛋白质A纯化的2651IgG的1∶2连续稀释液(以1∶500开始)以便探测RH2651。在1小时室温温育后，用0.01％吐温20 PBS洗平板。加入碱性磷酸酶标记的山羊抗兔IgG并在室温再温育1小时。洗平板并加入对-硝基苯磷酸底物。15分钟显色期后，用Dynatech MR5000微板读数器测定410nm处的吸光值。
对RH2651与辣根过氧化物酶偶联的评估证实了1∶32000的2651IgG抗1ug 2651-HRP的效价。这表明了偶联反应成功。
实施例21包被抗体最佳化
用2651IgG包被微板。从第1列开始在每个孔中加入100ul 10ug/ml2651IgG并在平板上作1∶2的系列稀释。密封平板并储存于4℃直到准备使用。倒空后，用0.01％溶于PBS中的吐温20洗平板并在室温用1％的溶于PBS中的BSA封闭1小时。封闭后，倒空平板并在每个孔中加入150ulPBS。然后沿平板从10ug/ml开始加入50ul 2651-HRP稀释液并继续沿平板1∶2稀释。在1小时室温温育后，象前面一样洗涤平板并在每个孔中加入150ul 1-StepSlow-TMB(来自Pierce Chemical Co.的过氧化物酶底物)。在1小时显色后，加入150ul 1N H2SO4终止反应，用DynatechMR5000微板读数器测定每个孔在450nm处的吸光值。对照包括没有包被抗原的孔和没有2651-HRP加入的孔。确定包被抗体2651IgG浓度为0.625ug/ml和2561-HRP浓度为1.25ug/ml对于使用1-StepSlow-TMB底物是最适浓度。
实施例22直接测定
各用100ul 0.625ug/ml2651IgG包被微板的孔。留下一排不包被作对照。在4℃保留平板过夜。第二天用0.01％的溶于PBS中的吐温20洗平板并用1％的溶于PBS中的BSA封闭至少30分钟。从1mg/ml的储存液制备RH5992，RH2651，RH2703，和RH2485的标准液。将RH0345的标准液制备成0.1ng/ml，0.5ng/ml，1ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，50ng/ml，和100ng/ml。在倒空封闭液后，在适当的孔中加入150ul标准液。加入150ulPBS作零对照。在室温温育45分钟后，在每个孔中加入50ul 1.25ug/ml2651-HRP并晃动平板混合内容物。一个含有抗体和标准液的列不接受2651-HRP而是50ul PBS作为阴性对照。在室温温育45分钟后，象前面一样洗平板并在每个孔中加入150ul 2651-HRP，晃动平板混合内容物。一个含有抗体和标准液的列不接受2651-HRP而是50ul PBS作为阴性对照。在室温温育45分钟后，象前面洗平板并在每个孔中加入150ul Step 1SlowTMB。在室温下2小时后，在每个孔中加入150ul 1N H2SO4，用DynatechMR5000微板读数器读出450nm处的吸光值。
图16a显示了测定实验的典型曲线。可见曲线的线性部分在0.01ng/ml和10ng/ml之间。图16b利用吸光值倒数产生一个正斜率显示了测定的线性范围的典型的标准曲线。对于RH5992的计算的检测极限为0.096ng/ml而计算的灵敏度为0.005ng。表7给出了RH5992和类似物的数据。
表7 测试物质IC50ng/ml灵敏度ng 测定极限 ng/ml交叉反应性，％RH2651 RH5992 RH5992 3.64 0.005 0.106 32 100 RH2703 2.10 0.002 0.031 56 173 RH2651 1.17 0.001 0.013 100 311 RH0345 16.94 0.255 5.10 6.9 21.5 RH2485 4.64 0.024 0.482 25 78.4