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活动性结核标志物氢谱多肽的检测方法
    本发明涉及一种检测方法，特别是涉及一种活动性结核标志物(ActiveTuberculosis Mark-ATM)′H(氢谱)多肽的检测方法。

    国内外有关结核病实验诊断技术种类较多，早期建立现在仍广泛使用的常规检测方法有痰涂片、菌型鉴定、分离培养、药敏试验及OT皮试等。近十年来发展较快的方法有，酶联免疫吸附试验(ELISA)、酶联免疫电泳技术(ELIEP)、聚合酶链反应(PCR)及核酸探针(DNA Pribe)等。以上各种方法进行结核病诊断时，均是以抗体、抗原及免疫复合物作检测指标。

    本发明的目的在于提供一种利用活动性结核标志物′H多肽对活动性结核病患者的体液进行检测的活动性结核标志物的检测方法。

    本发明活动性结核标志物′H多肽检测方法中的活动性结核标志物′H多肽经氢谱象位分析，确定不属于抗体范畴，而是一种仅存在于活动性结核病患者体内的一种蛋白质成分，并从对11个国家和地区的标准菌株中，经反复技术分析和实验筛选，确立了CD-1331颗粒性抗原，其特点是与′H多肽结合稳定，特异，且无毒无污染，在特定的试验条件下，通过反应，CD1331可与′H多肽形成疏松的吸附环。经染色后，通过观察吸附环的颜色对活动性结核病进行诊断。

    本发明活动性结核标志物′H多肽的检测方法是这样进行的，在反应原CD1331中加入活化剂，如多肽、内纤酶等常用活化剂，充分混合，活化反应原后备用；在琼脂糖介质中加入缓冲液，如巴比妥缓冲液、萨姆缓冲液等常用缓冲液，加热熔化，控制PH＝8.5～8.6，离子强度u＝0.03，介质含水量大于99％，并于40～46℃温度下，向琼脂糖介质缓冲液中加入反应原CD1331，其加入比例为，琼脂糖介质缓冲液∶反应原＝10∶1，制备反应原凝胶板。采用常规的U型制板框制备，控制反应原凝胶板的厚度为2mm，其长度和宽度可根据条件设定；然后利用孔位模板对反应原凝胶板打孔，控制孔径为3mm，孔间距为12～15mm，打孔时注意挑出孔中凝胶块，每孔中加入待测样品，待测样品为体液，如血清、血浆、胸腹水、脑脊液、尿液及脓汁等。样品高体放置时间不超过10小时，放置时间过长会影响检测结果；再将加样后的凝胶板于37～42℃的温度下扩散30分钟～16小时，即反应30分钟～16小时，扩散时间的长短与样品离体放置时间的长短有关，放置时间越长，扩散时间亦越长，此时，′H多肽与反应原形成疏松的吸附环。样品加入量以10μl为宜。恒温扩散可在水箱或培养箱等恒温箱中进行；最后将扩散后的凝胶板置于生理盐水中浸泡8～24小时，其间更换生理盐水2～3次，彻底洗净各种未结合的杂蛋白，干燥后，用染色液染色，脱色，吸附环即成一中心深染，随面积扩大色泽逐渐变淡，直至消失的着色环，晾干后观察着色环颜色，判定检测结果。所用染色液可以是丽春红、氨基黑等常用染色液。观察时如着色环为无色，则为阴性，而根据不同染色液呈现不同颜色时，则为阳性。

    本发明活动性结核标志物地检测方法与OT皮试、酶联免疫ELISA、DNA探针、PCR基因扩增技术及典型病例组患者进行X线计算机断层摄影(CT)、磁共振成像(MRI)等进行多组对比试验，试验及临床研究证明，′H多肽检测的总敏感度为86.87％，特异度96.15％，准确度95.20％，诊断效率为83.53％，批内CV1.2％，批间CV2.0％，P＜0.005，X2检验＝443.19，相关系数＝0.93。

    本发明活动性结核标志物的检测方法的优点在于其准确性高和实用性广，1)由于检测对象不是抗原，故解决了肺外结核，如骨结核、肝结核、子宫内膜结核等深部病变部位取材的困难，使肺部结核不排菌时，痰培养及抗酸染色出现的假阴性结果得以纠正。2)由于检测对象不是抗体，故不受曾否预防接种和曾否罹患结核病的影响，使结果具确诊的价值。3)检测程序合理，设计科学，干扰因素少，在体外检查机体感染结核菌情况，完全避免了皮肤实验造成的医源性损伤。4)与疾病的轻重呈正相关，与疗效的好差成负相关，因半衰期很短，有助于临床调整药物、观察疗效、及时判断采取相应措施。5)方法简捷，费用低廉，既可用于临床，又可用于大批量人群普查和流行病学调查。

    下面结合附图详细说明本发明实施例

    实施例1：

    一、试剂

    1、反应原：CD-1331(颗粒性反原)

    2、活化剂：多肽

    3、缓冲液：巴比妥缓冲液(PH＝8.6，u＝0.03)

    4、介质：琼脂糖(日本进口)

    5、染色液：丽春红

    二、操作

    取反应原CD1331(安瓶、10U)1支，加入多肽4.0ml，充分混匀备用。取琼脂糖0.9g于三角烧瓶中，加入巴比妥缓冲液100ml，置于沸水浴加热溶化，准确吸取琼脂糖介质缓冲液10ml于烧杯中，待41℃温度时加反应原液1,0ml，充分混匀，乘热倒入制板框中，静置冷却后移去文具夹、盖片及U型框，制成2mm×70mm×130mm的反应原凝胶板。将孔位模板衬在抗原凝胶板下，用打孔器对准孔位打孔(孔径3mm，孔间距15mm)，并挑出孔中凝胶块，每孔加入待测样品血清10μl(离体放置1小时)，避免气泡外溢。将加样后的凝胶板水平放置于培养箱内，在37℃下扩散30分钟。取出凝胶板，放入生理盐水中浸泡8小时，其间更换2次生理盐水，于燥后用丽春红染色液染色，脱色，晾干后观察吸附环里红色，检测结果为阳性。

    实施例2：

    一、试剂

    1、反应原：CD-1331(颗粒性反应原)

    2、活化剂：内纤酶

    3、缓冲液：萨姆缓冲液(PH＝8.5，υ＝0.03)

    4、介质：琼脂糖(国产)

    5、染色液：氨基黑

    二、操作

    取反应原CD1331(安瓶、10U)1支，加入内纤酶1.0ml，充分混匀备用。取琼脂糖0.9g于三角烧瓶中，加入萨姆缓冲液100ml，置于沸水浴加热溶化，准确吸取琼脂糖介质缓冲液10ml于烧杯中，待温度45℃时加反应原液1.0ml，充分混匀，乘热倒入制板框中，静置冷却后移去文具夹、盖片及U型框，制成2mm×70mm×130mm的反应原凝胶板。将孔位模板衬在抗原凝胶板下，用打孔器对准孔位打孔(孔径3mm，孔间距12mm)，并挑出孔中凝胶块，每孔加入待测样品血桨10μl(离体放置8小时)，避免气泡外溢。将加样后的凝胶板水平放置于水浴箱内，在37℃下扩散15小时。取出凝胶板，放入生理盐水中浸泡24小时，其间更换3次生理盐水，干燥后用氨基黑染色液染色，脱色，晾于后观察吸附环呈兰色，检测结果为阳性。