血清抗血管α1-和AT1-受体自身抗体检测方法及试剂盒 【技术领域】
本发明涉及医用检测试剂，特别是血清抗血管α1-受体自身抗体(抗α1-肾上腺素受体自身抗体)及AT1-受体自身抗体(抗血管紧张素II-受体1自身抗体)检测试剂。
背景技术
高血压是严重危害人类健康的常见病和多发病，在欧美国家，高血压的患病率多在20％以上，我国也是高血压的高发国家，据1991年全国部分省市抽样普查，总患病率已达11.88％，据上海市的卫生服务调查，高血压的患病率居各种慢性病的第一位。高血压是一个长期逐渐进展的慢性疾病，高血压与脑卒中、左室肥厚、心力衰竭、冠心病、主动脉夹层、慢性肾功能衰竭、高血压眼底病变密切相关，是导致心血管疾病死亡的主要危险因素。在我国，70％的高血压患者属于轻型，病情进展缓慢，约10％的患者属于难治性高血压和重症高血压，是导致心脑血管死亡的主要人群，必须加强血压控制并注意早期预防和监测。高血压的发病机制十分复杂，常常是多种因素综合作用的结果，包括肾脏调节血压功能紊乱、肾素-血管紧张素系统及交感神经系统活性增强、血管内皮细胞功能异常、胰岛素抵抗代谢综合征及遗传因素等；其中，自1970年Ebringe和Doyle发现30％良性高血压和恶性高血压病人中存在血清免疫球蛋白水平的显著增高以来，众多资料表明在实验性高血压动物和高血压病人中存在自身免疫现象，免疫因子的作用可能是高血压发生发展的重要机制，高血压病中存在的免疫功能异常成为高血压发病及高血压并发症产生机制研究的重要领域[Fu ML.Do immunesystem changes have a role in hypertension？J Hypertens 1995；13(11)：1259-65]。
近年来，还发现高血压病人中存在着针对机体心血管调节受体的自身抗体，尤其是抗G蛋白偶联受体的自身抗体，在可能是高血压尤其是恶性高血压发病的重要因素。G蛋白偶联受体是与GTP调节蛋白相关的跨膜受体分子超家族，包括M2-毒蕈碱受体、β-肾上腺素受体、α-肾上腺素受体、血管紧张素受体-1(AT1)等。G蛋白偶联受体是将胞外信号传导给胞内的通用信号分子，在心血管调节中具有极为重要的作用，其肽链结构七次穿越胞膜并形成胞外三个环肽和胞内三个环肽[Hoebeke J.Structural basis of autoimmunity againstG protein coupled membrane receptors.Int J Cardiol 1996，54：103-11.]。目前发现约有1/3的扩张型心肌病病人中存在针对G蛋白偶联受体胞外第二个环肽的抗M2和β1受体自身抗体，并且发现抗M2-受体自身抗体可通过M2受体对新生鼠心肌细胞产生持久的剂量依赖性负性频率作用，表现为不随时间而失敏感的毒蕈碱受体激动活性[Wallukat G，FuHM，Matsui S，et al.Autoantibodies against M2 muscarinic receptors in patients withcardiomyopathy display non-desensitized agonist-1ike effects.Life Sci 1999，64：465-9.]。抗β1-受体自身抗体也具有β1-受体激动活性[Wallukat G，Morwinski M，Kowal K，et al.Autoantibodies against the beta-adrenergic receptor in humanmyocarditis and dilated cardiomyopathy：beta-adrenergic agonism withoutdesensitization.Eur Heart J 1991，12(Suppl D)：178.]，并可导致心肌细胞钙超负荷而引起心肌损害[Wallukat G，Morwinski M，Kowal K，et al.Autoantibodies against thebeta-adrenergic receptor in human myocarditis and dilated cardiomyopathy：beta-adrenergic agonism without desensitization.Eur Heart J 1991，12(SupplD)：178.]。抗M2-受体自身抗体及抗β1-受体自身抗体的存在及其病理性激动剂样活性可能是扩张型心肌病发病及心力衰竭的产生地重要机制[Liao YH，Cheng LX，Tu YS，et al.Mechanism of anti-beta-adrenoceptor antibody mediated myocardial damage in dilatedcardiomyopathy.J Tongji Med University 1997，17：5.]；[Magnusson Y，Wallukat G，Waagstein F et al.Autoimmunity in idiopathic dilated cardiomyopathy：characterrization of antibodies against the β1-adrenoceptor with positivechronotropic effect.Circulation 1994；89：2760-7.]。
α1-受体和AT1-受体也属于G蛋白偶联受体超家族，并且在血压调节中具有十分重要的作用。α1-受体的激动可以激活磷酯酶C，动员胞内钙离子而收缩血管、升高血压。AT1-受体的激动除可通过收缩血管而升高血压外，还可增加肾脏的潴钠潴水并通过刺激肾上腺醛固酮的分泌，加强水钠的潴留而升高血压，并可引起心肌及血管平滑肌的肥厚[Pratt RE.Regulation of vascular smooth-muscle cell growth by angiotensin II.Blood Pressure1996；2：6-9.]。已有证据表明在恶性高血压病人中存在抗α1-受体和AT1-受体自身抗体滴度的升高，并且抗α1-受体自身抗体和AT1-受体自身抗体均具有激动剂样活性[参见Fu ML，Herlitz H，Wallukat G，et al.Functional autoimmune epitope on alpha 1-adrenergicreceptors in patients with malignant hypertension.Lancet 1994，344：1660-4.]；[参见Fu ML，Herlitz H，Wallulat G，Hjalmarson A.Non-desensitized positive chronotropiceffect of anti-angiotensin II receptor autoantibodies in patients with malignanthypertension.Circulation 1996；94：4046a.]；[参见Fu ML，Schulze W，Wallulat G etal.Immunohistochemical localization of angiotensin II receptors(AT1)in the heartwith anti-peptide antibodies showing a positive chronotropic effect.Receptors
Fu等人[参见Pratt RE.Regulation of vascular smooth-muscle cell growth byangiotensin II.Blood Pressure 1996；2：6-9.]发现在恶性高血压病人中存在着抗血管α1-受体自身抗体，在恶性原发性高血压和恶性继发性高血压病人中，抗α1-受体自身抗体阳性反应的患者分别占20％和40％，并且这种自身抗体可以显著增强培养的新生大鼠心肌细胞的收缩频率，起到α1-受体起到激动剂样活性。Fu等人还发现恶性高血压中尚存在高滴度的抗AT1-受体自身抗体，免疫细胞化学技术发现大鼠源性抗AT1-受体自身抗体可对新生大鼠心肌细胞起到正性变时效应。另外，Wallukat等[Guatsfsson F.Hypertensivearteiolar necrosis revisited.Blood Press 1997；6：71-7.]发现，在先兆子痫的病人中，亦存在抗AT1-受体自身抗体的阳性反应，其阳性率明显高于正常血压产妇，这一抗体可与ATI-受体特异性结合，产生受体激动剂样活性。自身抗体通过相应受体所引起的病理效应可能是恶性高血压及先兆子痫发生发展的重要因素。
恶性高血压是原发性高血压或继发性高血压血压严重升高所致的一种并发症，常伴有广泛而严重的靶器官损害，病情发展迅速，如不积极治疗，多数病人于半年内死于肾功衰、脑卒中、急性心肌梗塞及心力衰竭等心脑血管并发症。难治性高血压-即三种有效抗高血压药物足够剂量联合使用，仍然不能将血压控制在140/90mmHg的高血压病人，它是一种特殊类型高血压，病程较长，容易发生心、脑、肾损害，难治性高血压的产生与降压药选择欠佳等有关，因此，对难治性高血压的诊断是当前该领域所面临的重要课题。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种检测血清抗血管α1受体及AT1-受体自身抗体的方法。
本发明的另一个目的是提供一种用于血清抗血管α1受体及AT1-受体自身抗体检测试剂盒。
为了探讨难治性高血压与免疫功能异常的关系，我们共收集了难治性高血压病人58例，普通高血压病人96例以及正常血压对照40例，难治性高血压的诊断按美国JNC-VI提出的标准，即三种有效抗高血压药物足够剂量联合使用，仍然不能将血压控制到140/90mmHg的高血压病人称为难治性高血压病人[Fu ML，Herlitz H，Wallukat G，et al.Functionalautoimmune epitope on alpha 1-adrenergic receptors in patients with maiignanthypertension.Lancet 1994，344：1660-4.]。两组高血压病例在性别、年龄、初治血压水平、高血压靶器官损害状况等方面相匹配，高血压病例组与正常血压对照组资料在性别、年龄上相匹配，结果发现在难治性高血压病例组，这两种自身抗体的阳性率明显高与其它两组，分别为43％，10.4％及7.5％，差异具有显著性。
我们还观察了抗体阳性病人对不同的作用于肾素-血管紧张素系统药物的差别，初步结果提示这种自身抗体可模拟血管紧张素，激动血管紧张素受体，在高血压病发生及其并发症进展中具有重要的意义，抗α1-受体和AT1-受体抗体是难治性高血压患者血压不易控制的潜在因素之一。抗α1-受体和AT1-受体抗体的临床检测不仅有助于寻找难治性高血压的发病因素，还有助于指导难治性高血压患者降压药物的选择，特异性阻断α1-受体和AT1-受体的抗高血压药物可能更有利于此类难治性高血压病人的血压控制和并发症防治。抗α1-受体和AT1-受体抗体的临床检测具有重要的临床应用价值。
本发明提供用于检测血清抗血管α1-受体自身抗体及AT1-受体自身抗体的试剂盒由抗原包被板、样品稀释液、阴性对照血清、阳性对照血清、洗液、酶标二抗、显色剂A、显色剂B、终止液组成。
抗原包被板包被有α1、AT1抗原，包被板为聚苯乙烯板(8×12孔)或条(12孔)，聚苯乙烯对蛋白质有良好的吸附性能，可将抗原溶液与聚苯乙烯载体接触，在一定的温度、经过一定的时间即可达到包被(将抗原结合于固相载体上的过程称为包被)的目的.将α1和AT1抗原多肽片段溶解于碳酸缓冲液中(PH 9-11)，以每孔1μg/100μl的量包被，置4℃冰箱过夜，加1％牛血清白蛋白+PBS封闭，置37℃温浴2小时，以消除非特异性反应；拍干、干燥后保存于4℃或-20℃冰箱备用；样品稀释液为0.01M PH7.4的磷酸缓冲液(PBS)加10％的牛血清；阴性对照血清是将健康献血者的血清用多肽抗原进行吸收后，以清除可能的交叉反应物后作为阴性对照血清；阳性对照血清是用测定的抗α1-受体自身抗体及AT1-受体自身抗体阳性的血清30份混合，20μl/支分装，-20℃保存备用；洗液为含0.05％的吐温20的0.01M PH7.4磷酸缓冲液；酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的兔抗人的IgG抗体；显色剂A(底物A)由柠檬酸1.26g，乙酸钠4.64g，水400ml，加30％H2O2264ul构成；显色剂B(底物B)是将四甲基联苯胺(TMB)5mg溶于1ml二甲亚砜构成；终止液为2M的硫酸。
各组分的制备及组成如下：
一.抗原的制备：
1.用(日本SHIMADZU公司)PSMM-8型多肽合成仪合成具有抗原决定簇的α1受体及AT1-受体胞外第二环肽片段，即α1受体192-218位氨基酸残基片段和AT1受体165-191位氨基酸残基片段。[参见Myocardial injury due to G-protein coupled receptor-autoimmunity.Jpn Heart J.1998；39：261-74]
α1受体肽段氨基酸序列为
Gly-Trp-Lys-Glu-Pro-Val-Pro-Pro-Asp-Glu-Arg-Phe-Cys-Gly-Ile-Thr-Glu-Glu-Ala-Gly-Tyr-Ala-Val-Phe-Ser-Ser-Val-OH，Val的C端接在载体上。
AT1-受体肽段氨基酸序列为
Ile-His-Arg-Asn-Val-Phe-Phe-Ile-Glu-Asn-Thr-Asn-Ile-Thr-Val-Cys-Ala-Phe-His-Tyr-Glu-Ser-Glu-Asn-Ser-Thr-Leu-OH，Leu的C端接在载体上。
2.抗原合成后处理：用甲醇清洗5次，t-J甲基醚清洗2次后用脱脂树脂(载体)溶剂将多肽与树脂分离，用乙醚沉淀、离心分离，最后用氮气(N2)干燥，置-40℃保存备用。
二.抗原的包被：
1.将α1和AT1抗原多肽片段溶解于碳酸缓冲液中(PH 9-11)，以每孔1μg/100μl的量包被，置4℃冰箱过夜，加1％牛血清白蛋白+PBS封闭，置37℃温浴2小时，以消除非特异性反应；拍干、干燥后保存于4℃或-20℃冰箱备用。
三.其它试剂的配制：
(1)样品的稀释液：9份磷酸缓冲液(PH7.4)+1份小牛血清；
(2)辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG抗体(华美公司提供)；
(3)显色剂A(底物A)：柠檬酸1.26g，乙酸钠4.64g，水400ml，加30％H2O2264ul
(3)显色剂B(底物B)：将四甲基联苯胺(TMB)5mg溶于1ml二甲亚砜
(5)终止液：为2mol/L H2SO4；
(6)洗液：含0.05％Tweeu-20的0.01mol/L磷酸缓冲液(PH7.4)。
使用本发明检测试剂的检测操作步骤：
1.取出包被有α1、AT1抗原的包被板，以样品稀释液稀释待测血清，α1组血清稀释度为1∶40，AT1组血清稀释度为1∶40，将稀释好了的待测血样100ul加入包被板的微孔中，放置37℃温浴2h，用洗液洗板3次，即每次加洗液注满微孔，放置3分钟后拍干洗液，再加洗液如此反复3次；拍干；
2.每孔加入1∶2000辣根过氧化物酶标记IgG抗体100μl，置37℃温浴1h，同上洗板；
3.再加入A液50ul和B液(TMB)50ul温浴10分钟，加入2mol/L H2SO4终止反应；
4.在酶标仪上450nm波长测定光密度值(OD值)，实验中设置空白对照阳性、阴性对照；结果判断：以空白对照为零，以P/N值≥2.1为阳性(P/N＝样本OD值/阴性对照OD值)[参见：尹伯元，王仁芝，李振甲，许以平著.《标记免疫学》原子能出版社1998，130～138.]。
抗原的制备
用(日本SHIMADZU公司)PSMM-8型多肽合成仪合成具有抗原决定簇的α1受体及AT1-受体胞外第二环肽片段，即α1受体192-218位氨基酸残基片段和AT1受体165-191位氨基酸残基片段。[参见Myocardial injury due to G-protein coupled receptor-autoimmunity.Jpn Heart J.1998；39：261-74]。
α1受体肽段氨基酸序列为：
Gly-Trp-Lys-Glu-Pro-Val-Pro-Pro-Asp-Glu-Arg-Phe-Cys-Gly-Ile-Thr-Glu-Glu-Ala
-Gly-Tyr-Ala-Val-Phe-Ser-Ser-Val-OH，Val的C端接在载体上。
AT1-受体肽段氨基酸序列为：
Ile-His-Arg-Asn-Val-Phe-Phe-Ile-Glu-Asn-Thr-Asn-Ile-Thr-Val-Cys-Ala-Phe-His-Tyr-Glu-Ser-Glu-Asn-Ser-Thr-Leu-OH，Leu的C端接在载体上。
抗原合成后处理：用甲醇清洗5次，t-J甲基醚清洗2次后用脱脂树脂(载体)溶剂将多肽与树脂分离，用乙醚沉淀、离心分离，最后用氮气(N2)干燥，置-40℃保存备用。
抗原的包被：
将α1和AT1抗原多肽片段溶解于碳酸缓冲液中(PH 9-11)，以每孔1μg/100μl的量包被，置4℃冰箱过夜，加1％牛血清白蛋白+PBS封闭，置37℃温浴2小时，以消除非特异性反应；拍干、干燥后保存于4℃或-20℃冰箱备用。
其它试剂的配制：
(1)样品的稀释液：9份磷酸缓冲液(PH7.4)+1份小牛血清；
(2)辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体(华美公司提供)；
(3)TMB：溶解5mg的四甲基联苯胺(TMB)于1ml二甲基亚(DMSO)中(密封保存，4℃暗处可保存半年)，加上述TMB溶液0.25ml于12ml 0.1mol/L柠檬酸钠缓冲液(PH5.5)中，再加入100μl 3％H2O2；
(4)终止液：为2mol/L H2SO4；
(5)洗液：含0.1％Tweeu-20的0.01mol/L磷酸缓冲液(PH7.4)。
使用本发明检测试剂盒的检测操作步骤：
1.取出包被有α1、AT1抗原的包被板，以样品稀释液稀释待测血清，α1组血清稀释度为1∶40，AT1组血清稀释度为1∶20，置37℃温浴2h，用洗液洗板3次，每次放置3分钟；
2.每孔加入1∶2000辣根过氧化物酶标抗体100μl，置37℃温浴1h，同上洗板；
3.再加入底物(TMB)温浴10分钟，加入2mol/L H2SO4终止反应；
4.在酶标仪上450nm波长测定光密度值，实验中设置空白对照阳性、阴性对照；
5.结果判断：以空白对照为零，以P/N值≥2.1为阳性。(P/N＝样本OD值/阴性对照OD值)。
本发明检测试剂盒的检测原理是：将特异性抗原包被于固相载体，加入含待测抗体(人IgG)的样品，使之与固相抗原结合，加入酶标抗人IgG作为第二抗体；反应后再加入底物A，B液显蓝色。
反应过程为：固相包被(特异性抗原结合于固相载体上)→加待测抗体(人IgG)的样品(使待测抗体与固体抗原结合)→保温(使待测抗体与固相抗原在一定的温度下充分结合)→洗涤(洗去未与固相抗原结合的其它物质)→加辣根过氧化物酶标记的IgG抗体(使特异性抗原与待测抗体结合的免疫复合物上标上辣根过氧化物酶)→保温(充分结合)→洗涤(洗去未结合上的多余的辣根过氧化物酶)→加A，B液(A液：H2O2为受氢体，B液：还原型TMB为供氢体，辣根过氧化物酶首先和H2O2反应，形成活泼的氧化剂，然后氧化剂与还原型TMB反应生成蓝色的氧化型TMB)→保温(充分反应显色)→比色。
该方法特异性和敏感性高、操作简便，为临床开展检测AT1-受体自身抗体和抗α1-受体自身抗体提供了快速、敏感的检测方法，检测该抗体有助于难治性高血压的诊断和指导降压药物的选择。
我们共收集了难治性高血压病人58例，普通高血压病人96例，以及正常高血压对照40例，两组高血压病例在性别、年龄、初治高血压水平等方面相匹配。结果发现：在难治性高血压组，这两种自身抗体的阳性率明显高于其它两组，分别为43％、10.4％及7.5％，差异有显著性；抗α1受体和AT1受体抗体是难治性高血压患者血压不易控制的潜在因素，抗α1受体和AT1受体抗体的临床检测不仅有助于指导难治性高血压患者降压药物的选择，特异性阻断α1受体和AT1受体的抗高血压药物能更有利于此类难治性难治性高血压病人的血压控制和并发症防治，抗α1受体和AT1受体抗体的临床检测具有重要的临床应用价值。
由于自身抗体在恶性高血压和先兆子痫病人中具有较高的发生率，抗血管α1-及AT1-受体自身抗体的检测可用于恶性高血压的诊断和评价，并有利于恶性高血压病人的药物选择，如抗α1-受体阳性，可选择特异性α1-受体阻断剂，如AT1-受体阳性，加用AT1-受体拮抗剂，可能更有利于血压的控制和并发症的防治。虽然AT1-受体拮抗剂不用于妊娠高血压病人，AT1-受体自身抗体的检测可能有利于对妊娠高血压病人发生先兆子痫和子痫的预测。检测抗血管α1-及AT1-受体自身抗体能对具体的药物选择提供帮助。另外，这两种血管自身抗体可用于高血压病人的病情监测，如高血压病人病程发展中出现了抗体的阳性反应，提示某种异常因素可能触发了机体自身免疫反应的产生，并有可能导致恶性高血压和难治性高血压，及时的病情监测和干预将有利于恶性高血压和难治性高血压的早期诊断和防治，减少由此引起的心脑血管疾病的发生和发展，降低人群死亡率。本发明揭示抗α1-受体自身抗体阳性的病人较此抗体阴性的病人其抗AT1受体自身抗体阳性率明显增高，同时，抗AT1受体自身抗体阳性的病人较其他病人有更高的抗α1-受体自身抗体阳性率，提示抗α1-受体与抗AT1-受体自身抗体的产生具有一定的相关性。同时，免疫球蛋白升高的病人，其抗α1-及AT1-抗体阳性率也高于其他人。本发明揭示抗α1-受体及AT1-受体自身抗体存在一定的相关性，可能与α1-受体及AT1-受体的同源性有关，也可能某些潜在的因素是导致机体产生多种自身抗体的原因。由于这两种自身抗体的阳性情况存在相关，同时检测这两种自身抗体，将更有利于难治性高血压的诊断，提高难治性高血压检出的特异性和敏感性，并可对难治性高血压病人进一步的用药选择提供更有价值的证据，同时检测抗α1-及AT1-受体自身抗体，对难治性高血压的诊断、预后评价及抗高血压药物选择具有重要的指导意义。
图1为本发明检测原理及反应过程图解。
【具体实施方式】
实施例1：
本发明诊断试剂盒的制备
一、抗原的制备：
1.用(日本SHIMADZU公司)PSMM-8型多肽合成仪合成具有抗原决定簇的α1受体及AT1-受体胞外第二环肽片段，即α1受体192-218位氨基酸残基片段和AT1受体165-191位氨基酸残基片段。[参见Myocardial injury due to G-protein coupled receptor-autoimmunity.Jpn Heart J.1998；39：261-74]
α1受体肽段氨基酸序列为
Gly-Trp-Lys-Glu-Pro-Val-Pro-Pro-Asp-Glu-Arg-Phe-Cys-Gly-Ile-Thr-6lu-Glu-Ala-Gly-Tyr-Ala-Val-Phe-Ser-Ser-Val-OH，Val的C端接在载体上。
AT1-受体肽段氨基酸序列为
Ile-His-Arg-Asn-Val-Phe-Phe-Ile-Glu-Asn-Thr-Asn-Ile-Thr-Val-Cys-Ala-Phe-His-Tyr-Glu-Ser-Glu-Asn-Ser-Thr-Leu-OH，Leu的C端接在载体上。
2.抗原合成后处理：用甲醇清洗5次，t-J甲基醚清洗2次后用脱脂树脂(载体)溶剂将多肽与树脂分离，用乙醚沉淀、离心分离，最后用氮气(N2)干燥，置-40℃保存备用。
二、抗原的包被：
将α1和AT1抗原多肽片段溶解于碳酸缓冲液中(PH 9-11)，以每孔1μg/100μl的量包被，置4℃冰箱过夜，加1％牛血清白蛋白+PBS封闭，置37℃温浴2小时，以消除非特异性反应；拍干、干燥后保存于4℃或-20℃冰箱备用。
三、其它试剂的配制：
(1)样品的稀释液：9份磷酸缓冲液(PH7.4)+1份小牛血清；
(2)辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体(华美公司提供)；
(3)TMB：溶解5mg的四甲基联苯胺(TMB)于1ml二甲基亚(DMSO)中(密封保存，4℃暗处可保存半年)，加上述TMB溶液0.25ml于12ml 0.1mol/L柠檬酸钠缓冲液(PH5.5)中，再加入100μl 3％H2O2；
(4)终止液：为2mol/L H2SO4；
(5)洗液：含0.1％Tweeu-20的0.01mol/L磷酸缓冲液(PH7.4)。
实施例2
使用本发明检测试剂盒的检测操作：
1.取出包被有α1、AT1抗原的包被板，以样品稀释液稀释待测血清，α1组血清稀释度为1∶40，AT1组血清稀释度为1∶20，置37℃温浴2h，用洗液洗板3次，每次放置3分钟；
2.每孔加入1∶2000辣根过氧化物酶标抗体100μl，置37℃温浴1h，同上洗板；
3.再加入底物(TMB)温浴10分钟，加入2mol/L H2SO4终止反应；
4.在酶标仪上450nm波长测定光密度值，实验中设置空白对照阳性、阴性对照；
5.结果判断：以空白对照为零，以P/N值≥2.1为阳性。(P/N＝样本OD值/阴性对照OD值)。