本发明涉及黄瓜花叶病毒WL株（CMV-WL）的一种外壳蛋白基因。更确切地说，本发明是涉及一种制备所述基因和基因整合到转移载体上的方法，并涉及用此技术生产具有抗CMV病毒感染的转化植物细胞和转化植物。 黄瓜花叶病毒（CMV）是一种单链（+）RNA植物病毒，其具有功能上分开的一个基因组。该病毒基因组含有命名为RNA 1-4的四种RNA，分别有3389个核苷酸、3035个核苷酸、2193个核苷酸和1027个核苷酸（Peden和Symons，1973;Gould和Symons，1982;Rezaian等，1984;Rezaian等，1985）。因为RNA3也能编码由RNA4编码的外壳蛋白，所以该病毒的传染性仅需要RNA1-3（Peden和Symons，1973）。CMV RNA翻译结果是：由RNA1产生一个95千道尔顿多肽;由RNA2产生一个94千道尔顿多肽（Gordon等，1983）;由RNA3产生两个多肽：其5′端编码一个35千道尔顿多肽，其3′端编码一个24.5千道尔顿多肽（Gould和Symons，1982）。这个24.5千道尔顿多肽和由RNA4编码的多肽相同，是该病毒外壳蛋白。
利用血清学（Devergne和Cardin，1973、1975）、宿主范围（Marrow等，1975）、肽链图（Edwards和Gonsalves，1983）和核酸杂交（Piazzola等，1979;Gonda和Symons，1978）已经分类出几株黄瓜花叶病毒。这些CMV株可分为S和WT两组。CMV-Q株的基因组序列已完全搞清楚（Rezaian等，1984，1985;Gould和Symons，1982;Davies和Symons，1988）。上述Q株属于由三个组分组成的S组中的一个。已知WT组至少有17株。从对CMV-C和CMV-WL外壳蛋白基因的核苷酸序列分析和比较，现已确定C株属于WT组，而WL属于S组。对C株和WL株外壳蛋白基因的核苷酸和氨基酸序列分析显示分别有22.7%和16%的不同（见表2、3）。
对几种病毒〔烟草花叶病毒（Powell-Abel等，1986），紫花苜蓿花叶病毒（loesch-Fries等，1987;Tumer等，1987），黄瓜花叶病素（cuozzo等，1988;Quemada和Slightom，在制备中），马铃薯病毒X（Hemenway，等，1988）〕的研究表明外壳蛋白在基因转移植物中的表达可导致该植物对抗相应病毒的感染。可是，这种基因工程导致的交叉保护作用能否扩大到一种特定病毒的所有株尚未确定。两组CMV显示其外壳蛋白基因有大约16%的不同，因此在现场实验情况下，为了达到此种交叉保护作用，对抗CMV感染，可能需要两组病毒外壳蛋白的表达。
CMV外壳蛋白基因一旦转移和整合到植物基因组上，并不含有其表达的必需信号。必需用基因工程从5′端加一个启动子于其翻译起始密码子（ATG），从3′端加一个多聚腺苷酸附加信号（AATAAA）于其翻译终止密码子。有几种在植物中有功能地启动子可用于此目的，但我们认为最好的启动子是来自花椰菜花叶病毒（CaMV）的35S指令启动子。多聚腺苷酸信号可从CaMV35S基因或从任一特征明确的植物基因中得到，即：蓝曙红合成酶（Bevan等，1983）;章鱼碱合成酶（Depicker等，1982），豆科植物贮存蛋白基因：菜豆碱（Slightom等，1983）。其构建和用于CMV-C外壳蛋白表达的构建相同，该构建公开在PCT专利申PCT/US88/04321中，以WO89/05858形式发表于1989年6月29日，该专利申请具有U.S.SN 135.591的优点，而该美国专利申请提交于1987年12月21日，题目为“Cucumber Mosaic Virus Coat Protein Gene”，其主要内容在此作为对照文献。
于EP223，452中介绍了具有抗病毒疾病作用的植物和产生此种植物的方法。下列参考文献所含的信息也记载了利用基因工程使病毒外壳蛋白基因的基因转移植物中表达所用的材料，程序和重要的结果。
An G.等（1985）“用于高等植物转化的新的克隆载体”（EMBO J.4∶277-284）。
An G.（1986）“植物启动子表达载体的制备及其在转化烟草细胞中对蓝曙红合成酶启动子不同活性分析的应用。”〔植物生理学（plant physiol）81∶86-89〕。
Bevan.M等（1983）“T-DNA中蓝曙红合成酶基因片断的构建和转录”〔核酸研究（Nucleic Acids Research.）11∶369-379〕。
Cuozzo，M等（1988）“在表达黄瓜花叶病毒外壳蛋白或其反向RNA的基因转移烟草植物中的病毒保护作用”（Bio/tech，6∶549-557）。
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Depicker，A等“蓝曙红合成酶：转录图谱和DNA序列”〔J.Mol.Appl Genet 1∶561-573（分子应用遗传学杂志）〕。
Devergne，J.和Cardin.L.（1973）“黄瓜花叶病毒（CMV）研究的贡献：
Ⅳ.对其抗原结构的碱基几个分类的实验“Ann.Phytopathol 5∶409-430 Devergne，J.和Cardin，L.（1975）“黄瓜花叶病毒（CMV.TAV.PSV）”之间的血清学关系。
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Edwards，M和Gonsalver，D.（1983）“利用肽链图对七个生物学上明确不同的黄瓜花叶病毒的分组。”Phytopathology 73∶1117-1120。（植物病理学）。
Gonda，T.和Symons，R.（1978）“用互补DNA杂交分析确定植物病毒间的RNA序列同源程度：对几种黄瓜花叶病毒的应用（病毒学88∶361-370）。
Gonsalves，D.等（1982）“番茄白叶：明显的随体RNA和黄瓜花叶病毒的关系”（Phytopathology 72∶1533-1538）。
Gordon，K.等（1982）“高度纯化的黄瓜花叶病毒诱导的RNA依赖性RNA多聚酶不含有任何RNA基因组的全长度翻译产物”（Virology 123∶284-295）。
Gould，A.和Symons，R.（1982）“黄瓜花田病毒RNA3：其核苷酸序列的确定提供了蛋白3A和病毒外壳蛋白的氨基酸顺序“〔Eur.J.Biochem.（欧洲生化杂志）126∶217-227〕
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Marrou.J.等（1975）“十二个能致病的根VMC的标点：分型尝试”（Meded.Fac.landbouwwet.Rijks Univ.Gent.40∶107-122）。
Peden，K.和Symons.R.（1973）“黄瓜花叶病毒含有功能上分开的基团组”（Virology 53∶487-492）。
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Pietrzak，M.等（1986）“用一个新的植物表达载体进行原生质体转化后，两个细菌性抗生素抗性基因在植物中的表达”（Nuc.Acids.Res.14∶5857-5868）。
Polites，H和Marotti，K.（1986）“一个逐步合成cDNA方案”（Biotechniques 4∶514-520）。
Powell-Abel，P.等（1986）“在表达烟草花叶病毒外壳蛋白基因的基因转移植物中，其疾病发生延迟”（Science 232∶738-743）。
Rezaian，M.等（1984）“黄瓜花叶病毒RNA2的核苷酸序列显示了同源于其它病毒的相应蛋白的有意义的一个翻译产物”（Eur.J.Biochem.143∶277-284）。
Rezaian，M 等（1985）“黄瓜花叶病毒RNA1的核苷酸序列存在着一个和部分病毒随体RNA互补，和其他病毒RNA同源的序列”（Eur.J.Biochem.150∶331-339）。
Slightom.J.等（1983）“一种法国豆科植物贮存蛋白的基因：菜豆碱”（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80∶1897-1901）。
Tumer，N.等（1987）“紫花苜蓿花叶病毒外壳蛋白基因的表达，给予基因转移的烟草和番茄植物的交叉保护作用”（EMBO，J.6∶1181-1188）。
Vilaine，F.和Casse-Delbart，F.（1987）“由agropine族的土壤生根杆菌（Agrobacterium rhizogenes）的Ri质粒TL和TR区转化根的个别诱导”（Mol.Gen.Genet.206∶17-23）。
本发明提供：黄瓜花叶病毒WL株的外壳蛋白基因（CMV-WL）。
一个植物转化载体，该载体含有来自CMV-WL的外壳蛋白基因，花椰菜花叶病毒的35S启动子和花椰菜花叶病毒35S基因的多聚腺苷酸信号。
含有上述植物转化载体的细菌细胞，该细菌细胞含有来自CMV-WL外壳蛋白基因、花椰菜花叶病毒35S启动子和花椰菜花叶病毒35S基因的多聚腺苷酸信号。
含有来自CMV-WL外壳蛋白基因、花椰菜花叶病毒35S启动子和花椰菜花叶病毒35S基因的多聚腺苷酸信号的一种转化植物细胞。
包括上述转化细胞所组成的植物，该转化细胞含有CMV-WL的外壳蛋白基因、花椰菜花叶病毒35S启动子和花椰菜花叶病毒基因的多聚腺苷酸信号。本发明的转化植物包括甜菜、柑桔属水果、玉米、黄瓜、胡椒、马铃薯、大豆、南瓜和番茄，特别理想是葫芦科类（如南瓜、黄瓜）和茄科类（如胡椒、番茄）。
一种生产抗病毒植物的方法，该方法包括促进植物表达来自CMV-WL株外壳蛋白基因。此方法特别适于生产葫芦科和茄科类植物。
图1-5用来表明本发明的构造物，用于说明质粒和DNA片段的一些规定如下：
（1）单线图既代表环状也代表线状双链DNA。
（2）星号（＊）表示所标分子是环状，无星号标表示分子是线状。
（3）功能团的自然界限之间的连接由是沿水平线的垂直线表示。
（4）基因或功能团都标明。
（5）基因和限制性位点间的距离没有按比例作图，除非另外标明，各图仅表示其相对位置。
用来实施本发明的大多数DNA重组技术都是标准化程序，为本领域专业技术人员所熟知。此程序已有详细描述，如本文引入参考的EP223452，酶有商品供应，可按发明者的建议使用或作已知的变动后使用。试剂、缓冲液和培养条件也为专业人员所了解。本发明所引用的含这类标准技术的综合参考文献如下：R.Wu.等（1979）“酶学方法”68卷：J.H.Miller（1972），《分子遗传学实验》;T.Maniatis等（1982）《分子克隆》;实验室手册》;D.M.Glover.（1985）《DNA克隆》第2卷;S.B.Gelvin and R.A.Schilperoort《基因产物在植物中的导入、表达和分析》。
实施例1，CMV-RNA的分离
黄瓜花叶病毒WL株（CMV-WL）传播于烟草植物中（CV.Havana 423），RNA由标准方法分离，如按Lot等人的方法分离（植物病理年鉴4∶25，1972）。RNA3通过蔗糖梯度密度离心和其他CMV-WL和RNA分开。
实施例2 CMV-WL的RNA3的克隆
（a）双链cDNA3的合成
使纯化的CMV-WL RNA3多腺苷化，以便提供一个寡dT引物的退火位点。反应缓冲液如下：5μl，1M Tris pH7.9;1μl;1MMgCl2;2.5μl，0.1M MnCl2;5μl，5μNaCl;0.5μl，100mM ATP;18μl，12.8mg/ml小牛血清白蛋白。将3.2μl此缓冲液和2μg的CMV-WL RNA3混合，加入3.8μl水和1μl多聚腺苷酸聚合酶，于37℃将该反应混合物温育10分钟。
所产生的多聚腺苷酸化RNA用于Polites和Marotti的cDNA合成。不同的是0.75mM KCl取代了50mM NaCl，32P-dCTP是130μci/100μl，而不是10～50μci/100μl。
d5-cDNA合成后，通过G-100柱层析纯化，用乙醇沉淀，然后悬浮在20μl的1×EcoR1甲基酶缓冲液（100mM NaCl，100mM Tris-HCl pH8.0，1mM EDTA，80μM S-腺苷甲硫氨酸，100μg/ml小牛血清白蛋白）。取出2μl等分液留待以后做凝胶分析，再加入1μl的32mM S-腺苷甲硫氨酸，1μl（20个单位）的EcoRI甲基化酶到反应混合液中，于37℃下反应温育30分钟，然后于70℃温育10分钟，使反应终止。
从上述反应液中去掉2μl，加入1μl（5单位）的大肠杆菌（E.Coli）DNA聚合酶I.Klenow片段，于37℃下反应物温育10分钟，用酚/氯仿萃取，然后用乙醇沉淀。沉淀物用70%乙醇洗澡，再用70%乙醇，0.3M的醋酸钠液洗涤。
沉淀物干燥后，再次悬浮在8μ 10.5μg/μl的磷酸化EcoRI连接子里（Collaborative Research inc，128spring street，（exington，MA 02173得到）。此后加入1μl 10×联接酶缓冲液（800mM Tris-HCl pH8.0，200mM MgCl2，150mM DTT，10mM ATP）和1μl的T4DNA连接酶（4单位/μl），于15℃反应物温育过夜。
该连接反应于65℃温育10分钟后终止，然后加入60μl水、10μl 10×EcoRI盐（900mM Tris pH8.0，100mM MgCl2，100mM NaCl）和10μl的EcoRI（10单位/μl）于37℃温育1小时（反应开始时取出5μl留待以后做凝胶分析）。反应由酚/氯仿终止并用氯仿萃取。取出5μl作凝胶分析，余下的一半冰冻以备收来使用，另一半用G-100柱层析纯化。含有cDNA的G-100部分经丁醇提取浓缩，用乙醇沉淀后，悬浮于10μl的水中。取3μl供以后分析用，此后，加入1μl λgtll或λzap臂（由stratagene co.供应，3770 Tandy ST.San Diegp，Ca.92121），1μl的10×连接酶缓冲液和1μl的T4-DNA连接酶，反应物15℃温育过夜。
所得到的连接起来的λgtll或zap/cDNA分子，按照提取液包装制造商提供的程序组装，结果可得到重组入噬菌体。此噬菌体按本领域专业人员所熟悉的方法包装。
含有外壳蛋白基因的λ克隆可用纯化的CMV-WL RNA4的经放射标记的单链cDNA杂交来确定。此RNA4单链cDNA的合成如下所述：将RNA4分子多腺苷化，方法同前面所述的CMV-WL RNA3相同;不同的是使用5.8μg RNA4。始链的合成如polites和Marotti所述（Biotechnique 4∶514，1986），不同的是不包括无放射活性的dCTP。另外，使用的放射活性dCTP是260μci/100μl。
标记的单链cDNA经P6柱层析纯化后，用于探测复制滤品，此滤品得自上述的入噬菌体皿中提起。此单链cDNA和几种噬菌体克隆DNA杂交后显示至少含有一部分CMV-WL外壳蛋白基因。几种此类λ克隆经生长后，按照本领域专业人员所熟知的方法由此分离得到DNA。特别是分高到λ克隆WL328，其约2.0Kb的插入含有（MV-WL RNA3所有碱基，但不含有5′端的193个bp。
实施例3
含有CMV-WL外壳蛋白基因的PUC19克隆的构建
利用制备克隆PWL328.1的标准方法，将λ克隆WL328的EcoRI片段转移到质粒载体PUC19上（Bethesda Research，P.O.Box6009，Gaithersburg，Md20877）。然后用Maxam和Gilbert所述方法对PUC19上的EcoRI克隆片段进行序列分析，基于此信息，确定了CMV-WL外壳蛋白基因的全部序列，见图1。如同和CMV-Q RNA3全部序列的对比所确定的情形，对PWL328.1克隆进一步分析，发现其含有除CMV-WL RNA3分子5′端的193bp以前的所有碱基（Daris和Symons，1988，Virology待发表）。CMV-WL和CMV-C的核苷酸和氨基酸序列分别有22.7%（图2）和16%的不同（图3）。
实施例4
含有植物能表达的，具有CaMV35S的磷酸化信号的CMV-WL外壳蛋白基因的微T-DNA质粒的构建。
为了得到CaMV35S启动子和多聚腺苷酸信号，从λ克隆WL328剪除一片段，此片段从APaI切点（位于RNA3内基因区）建伸到EcoRI切点（在克隆实验时得到），然后连接到载体PDH51的多克隆位点上（从Thomus Hohn;Priedrich Miesher Institute，P.O.Box 2543，CH-4002，Basel，Switzerland可得到）（Pietrzak等，1986）可用ApaI和EcoRI对WL328分别进行完全和部分消化，产生一个从相应的ApaI切点到EcoRI切点、具有钝性末端分子的1090个bp片段（用绿豆核酸酶），然后把它连接到PDH51的SmaI切点上（见图4）。这个克隆，命名为pDH51/CPWL，可用Maxam-Gilbert技术进行序列分析，看是否适合在植物中表达。
植物可表达的外壳蛋白基因被转移到载体上，此载体应适合于土壤杆菌中介的基因转移。经EcoRI部分消化后，从EcoRI切点到EcoRI切点的约1.9kb片段从pDH51/CPWL被切下来，然后接到质粒PUCl813的EcoRI切点上（Robert Kay，Dept of chemistry Washington state University，pullman，Washington可得到），得到质粒PUCl813/CPWL。含有该植物可表达的CMV-WL外壳蛋白基因的这个1.9Kb片段，经HindⅢ部分消化后被切除，然后接到载体PGA482的HindⅢ切点上（An，1986）（Gynehung An，Institute of Biologicul Chemistry，Washington state University有此载体）。质粒PGA482先前已经修改，含有植物可表达的β-葡糖苷酸基因，这在WO89/05858中有记载（本文将该文作为引用文献），经修改的质粒被命名为PGA482/G，克隆该表达暗盒后，该质粒被命名为pGA482/CPWL/G（见图5）。
此质粒或其衍生物可用本领域专业人员所熟知的方法转移到土壤杆菌A208、C58、LBA4404、C582707、A4RS、A4RS（PRiB278b）及其他细菌中。ATCC、12301 Parklawn Drive、Rockville，MD。供应A208，C58、LBA4404株。Dr.F.Casse-Delbart;C.N.R.A，Routede saint cyr，F78000，Versailles，France供应A4RS（PRiB278b）。Dr.A.C.Hepburn，University of Illinois，urbana，IL供应C582707株。可用本领域专业人员所熟知的方法，或按美国专利申请序列号135655中所记载的方法，通过土壤杆菌中介转移植物可表达的CMV-WL外壳蛋白基因。上述专利提交于1987年12月21日，标题为“发育植物种子经土壤杆菌中介的转化”，该申请作为PCT，申请PCT/US88/04464再提交，以WO89/05859发表于1989年6月29号。其主要部分在这里作为引用文献。用其他方法如直接DNA摄取（paszkowski，等，EMBO.J.1984，3∶2717），显微注射（Crossway等人，Mol.Gen.Genet.202∶179），电刺孔法（Fromm等，proc，Natl.Acad.Sci.U.S.A.82∶5824）或高速显微投影法（Klein，等，Nature 327∶70）也可使此基因转移到植物细胞里。