结肠直肠癌的预后方法和试剂盒.pdf

本发明涉及用于预测癌症患者复发风险的方法及基于不同基因的表达水平向所述患者提供个性化用药的方法，所述不同基因的表达是响应于TGF-β刺激而产生的。本发明还涉及用于实施诊断及预测医学方法的试剂盒。

1.   一种用于预测罹患结肠直肠癌患者的结果的方法，用于给罹患结肠直肠癌患者选择合适的治疗或选择可能受益于结肠直肠癌手术切除后的辅助疗法的患者，所述方法包括测定来自所述患者的样本中的NPR3/C5orf23、CDKN2B及FLT1基因的表达水平，
    其中相对于所述基因的参照值，所述基因增加的表达水平表明患者消极结果的可能性增加，即所述患者是接受手术治疗后的疗法的候选人或所述患者可能受益于手术治疗后的疗法，或
其中相对于所述基因的参照值，所述基因降低的表达水平表明患者积极结果的可能性增加，即所述患者不是接受手术治疗后的疗法的候选人或所述患者不大可能受益于手术治疗后的疗法。

2.   根据权利要求1所述的方法，还包括测定一种或多种选自由FRMD6、IGFBP3、ESM1、FGF1、GEM、MEX3B、WNT2、NGF、MSC、SETBP1、FLJ10357、 DACT、MURC 和Col10A1组成的组中的基因的表达水平，
 其中相对于所述基因的参照值，所述基因增加的表达水平表明患者消极结果的可能性增加，即所述患者是接受手术治疗后的疗法的候选人或所述患者可能受益于手术治疗后的疗法，或
 其中相对于所述基因的参照值，所述基因降低的表达水平表明患者积极结果的可能性增加，即所述患者不是接受手术治疗后的疗法的候选人或所述患者不大可能受益于手术治疗后的疗法。

3.   根据权利要求2所述的方法，其中测定了CDKN2B、NPR3/C5orf23、 FLT1、FRMD6、IGFBP3和ESM1基因的表达水平，并且其中所述患者是罹患II期结肠直肠癌的患者。

4.   根据权利要求2所述的方法，其中测定了CDKN2B、 NPR3/C5orf23、FLT1、FGF1、GEM和MEX3B基因的表达水平，并且其中所述患者是罹患III期结肠直肠癌的患者。

5.   根据权利要求2所述的方法，包括测定下列基因的表达水平：ANGPTL2、ANGPTL4、APBB2、BMPR2、BPGM、C13orf33、C5orf13、NPR/C5orf23、CACHD1、CALD1、CDH6、CDKN2B、CILP、CNTN1、COL10A1、COL12A1、COL27A1、DACT1、DIXDC1、DNAJB5、DNAJC18、ELTD1、EPHA4、ESM1、FAP、FGD6、FGF1、FGF2、FLJ10357、FLT-1、FN1、FRMD4A、FRMD6、GAS1、GEM、GFPT2、GPR161、HAS2、HEY1、HIC1、HS3ST3A1、IGFBP3、IGFBP7、IL11、INHBA、KAL1、KIAA1755、KLF7、LARP6、LMCD1、LMO4、LOC100128178、LOC644242、LOC728264、LOH3CR2A、LRRC8A、MEOX1、MEX3B、MFAP2、MGC16121、MSC、MURC、NEDD9、NGF、NOX4、NPR2、NUAK1、OSGIN2、PALLD、PALM2、PDGFA、PDGFC、PDLIM4、PDPN、PGM2L1、PKNOX2、PMEPA1、PODXL、PPM1E、PTHLH、RASD1、RASGRP3、RASL12、RGS4、RNF150、RUNX1、S1PR5、SEMA6D、SERPINE1、SETBP1、SHISA2、SLC46A3、SNCAIP、SNORD114-3、SOX6、SPSB1、STK38L、SYNE1、SYTL4、TCF4、TGFB2、TIMP3、TMEM88、TNC、TNS1、TPM1、TSHZ3、TSPAN2、VEPH1、WNT2、WNT9A 和 ZEB1基因，以及与具有SEQ ID NO:1 ~13的序列的探针特异性杂交的基因，
 其中相对于所述基因的参照值，所述基因增加的表达水平表明患者消极结果的可能性增加，即所述患者是接受手术治疗后的疗法的候选人或所述患者可能受益于手术治疗后的疗法，或
 其中相对于所述基因的参照值，所述基因降低的表达水平表明患者积极结果的可能性增加，即所述患者不是接受手术治疗后的疗法的候选人或所述患者不大可能受益于手术治疗后的疗法。

6.   根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中额外的测定了患者的肿瘤阶段，并且
其中高肿瘤阶段是消极结果可能性增加的指标，即所述患者是接受手术治疗后的辅助疗法的候选人或所述患者可能受益于手术治疗后的疗法，
其中低肿瘤阶段是积极结果可能性增加的指标，即所述患者不是接受手术治疗后的辅助疗法的候选人或所述患者不大可能受益于手术治疗后的疗法。

7.   根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述疗法选自由化疗、放疗和/或包括TGF-β抑制剂的疗法组成的组。

8.   根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述待预测的结果为复发或者转移的发展。

9.   根据权利要求8所述的方法，其中所述转移是肝转移。

10.   根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述样本选自由肿瘤活组织检查或生物流体组成的组。

11.   根据权利要求10所述的方法，其中所述生物流体选自由血液、血浆和血清组成的组。

12.   一种用于治疗癌症手术治疗后患者的结肠直肠癌的疗法，其中所述患者根据权利要求1-11中任一项所述的方法选择。

13.   根据权利要求12所述的疗法，其中所述疗法选自由化疗、放疗和/或包括TGF-β抑制剂的疗法组成的组。

14.   一种试剂盒，包括足够用于测定NPR3/C5orf23、CDKN2B 和FLT1 基因表达水平的试剂及可选地用于测定一个或多个持家基因表达水平的试剂。

15.   根据权利要求14所述的试剂盒，还包括足够用于测定一种或多种选自由FRMD6、IGFBP3、ESM1、FGF1、GEM、MEX3B、WNT2、NGF、MSC、SETBP1、FLJ10357、DACT1、MURC和 Col10A1组成的组中的基因的表达水平的试剂。

16.   根据权利要求15所述的试剂盒，其中所述试剂足够用于测定CDKN2B、NPR3/C5orf23、FLT1、FRMD6、IGFBP3 和ESM1基因的表达水平或CDKN2B、NPR3/C5orf23、FLT1、FGF1、GEM和MEX3B基因的表达水平。

17.   根据权利要求16所述的试剂盒，其中所述试剂足够用于测定下列基因的表达水平：ANGPTL2、ANGPTL4、APBB2、BMPR2、BPGM、C13orf33、C5orf13、NPR/C5orf23、CACHD1、CALD1、CDH6、CDKN2B、CILP、CNTN1、COL10A1、COL12A1、COL27A1、DACT1、DIXDC1、DNAJB5、DNAJC18、ELTD1、EPHA4、ESM1、FAP、FGD6、FGF1、FGF2、FLJ10357、FLT-1、FN1、FRMD4A、FRMD6、GAS1、GEM、GFPT2、GPR161、HAS2、HEY1、HIC1、HS3ST3A1、IGFBP3、IGFBP7、IL11、INHBA、KAL1、KIAA1755、KLF7、LARP6、LMCD1、LMO4、LOC100128178、LOC644242、LOC728264、LOH3CR2A、LRRC8A、MEOX1、MEX3B、MFAP2、MGC16121、MSC、MURC、NEDD9、NGF、NOX4、NPR2、NUAK1、OSGIN2、PALLD、PALM2、PDGFA、PDGFC、PDLIM4、PDPN、PGM2L1、PKNOX2、PMEPA1、PODXL、PPM1E、PTHLH、RASD1、RASGRP3、RASL12、RGS4、RNF150、RUNX1、S1PR5、SEMA6D、SERPINE1、SETBP1、SHISA2、SLC46A3、SNCAIP、SNORD114-3、SOX6、SPSB1、STK38L、SYNE1、SYTL4、TCF4、TGFB2、TIMP3、TMEM88、TNC、TNS1、TPM1、TSHZ3、TSPAN2、VEPH1、WNT2、WNT9A 和 ZEB1基因，以及与具有SEQ ID NO:1~13的序列的探针特异性杂交的基因。

18.   根据权利要求14~17中任一项所述的试剂盒用于预测罹患结肠直肠癌的患者的结果的应用，用于对罹患结肠直肠癌患者选择合适的治疗或选择可能受益于结肠直肠癌手术切除后的辅助疗法的患者。

结肠直肠癌的预后方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及诊断领域，并且更具体地，涉及预测癌症患者复发风险的方法及向所述患者提供个性化用药的方法。本发明还涉及用于实施诊断及预测药物方法的试剂盒。
背景技术
结肠直肠癌(CRC)是西方世界最常见的瘤形成之一，其是位于肺癌和前列腺癌之后导致男性死亡的第三个原因，并且在女性中是位于乳腺癌之后第二常见的瘤形成。结肠直肠癌是世界范围内男性中第三常见(663,000病例，占总数的10.0％)和女性中第二常见(571,000病例，占总数的9.4％)的癌症。据估计世界范围内有608,000例由结肠直肠癌导致的死亡，占全部癌症死亡的8％，使其成为第四常见的癌症死亡原因。(GLOBOCAN.iarc.fr)
结肠直肠癌的主要治疗选择是手术，根据个体患者的阶段及其他医学因素，伴随或不伴随辅助性化疗和/或放疗。
无论对于病人来说还是出于经济原因，选择合适的治疗都很重要。对于患者存活，知道何时立即使用强烈并具侵略性的治疗方法以防止恶性结肠直肠癌的扩散是很重要的。否则，可能危及患者的生存。相反地，当不必要时进行强烈并具侵略性的治疗对于患者是极其不利的。这种治疗使患者受到由不良毒性产生的一定程度的不适和不便从而可能严重影响患者的生活质量。值得注意的是，每个患者有1/400的概率遭遇治疗导致致命的毒性。此外，强烈并具侵略性的治疗通常非常昂贵，因此其仅在必要时进行。
目前，治疗方案的选择基于肿瘤分期，通常使用美国癌症联合委员会 (AJCC)的肿瘤/节点/转移(TNM)测试进行选择。该TNM系统基于三个种类分配数字。“T”表示肠壁的侵害程度，“N”表示淋巴结包含程度，“M”表示转移程度。癌症的更广泛阶段通常引用源自通过预后分组的TNM值的数字I、II、III、IV；更大的数字表示更晚期的癌症及可能更坏的结果。该系统的细节见下表1：

尽管AJCC分类提供了一些关于已诊断出的结肠直肠癌所处阶段的有价值信息，但其不能提供关于肿瘤侵入性的信息且其对于预后的可用性是有限的。然而，显然的是IV期的患者具有不良预后，早期结肠直肠癌的诊断不排除肿瘤可能进一步迅速生长的可能性。特别是，完全未知为何20％至40％的II期结肠直肠癌患者(即，既未转移也未诊断出淋巴结浸润的早期癌症)将迅速恶化并死亡。一些研究表明，罹患高风险II期结肠癌的患者集合可 能从辅助疗法中获益(Quasar collaborative group等,Lancet2007；370:2020-2029)。然而，组织病理学变量，诸如II期疾病的高风险特征只有分层治疗时具有指示性。当肿瘤细胞侵入淋巴结时，TNM测试分值作为不良预后且患者通常经历手术后再经受重度化疗。临床研究示出了每25个确定为高风险II期CRC的患者，不管他们是否接受治疗将有20个患者治愈(Quasar collaborative group等,Lancet2007；370:2020-2029)。同样地，只通过手术治疗的罹患III期结肠癌的患者集合在5年内没有复发，即使没有辅助治疗(Ranghammar等,Acta Oncologica2001；40:282-308)。辅助化疗是III期CRC的标准建议，然而，预期识别这组罹患III期结肠癌的患者可能节约治疗。因此，识别患者在最大及最小风险(例如，“高风险”II期及“低风险”III期结肠癌)的准确可靠的方法可以改进这些群体中个性化疗法的选择。
出于这个原因，描述了许多基于分子标记物的表达水平预测结肠直肠癌患者的结果的方法。
Jorissen等(Clin.Cancer Res.,2009,15:7642-7651)描述了由128个基因组成的分类子，其在罹患阶段A的CRC(对应于I期)和阶段D(对应于IV期)的患者之间显示出可再生的变化。此外，至少所述分类子的两个基因(NPR3/C5orf23y FLT1)在疾病复发的患者中被上调。
WO2010042228描述了由176个基因组成的标签的识别，其表达水平与CRC预后相关。
WO2010124222描述了FLT-1(也称为VEGFR-1)的表达水平高于参照值的结肠癌患者在手术切除后肿瘤复发的可能性更高。
US7695913描述了预测罹患CRC的患者的预后的方法，其包括测定INHBA、MYBL2、FAP和Ki67基因的正常表达水平，其中INHBA和FAP表达的增加与正预后的可能性增加呈负相关，且其中MYBL2和Ki67基因的表达与正预后的可能性增加呈正相关。该文件中所描述的方法形成了 Oncotype DX试剂盒的基础，尽管所述试剂盒包括测定12个基因，所述基因包括INHBA、MYBL2、FAP和Ki67基因。
WO02057787报道了旨在测定Survivin mRNA是否能够用于预测复发性结肠直肠癌导致的死亡的研究结果。该研究基于144名患者的冷冻肿瘤活检所得到的数据。据报道，该研究表明Survivin表达与由II期结肠直肠癌患者的复发性癌症导致的死亡的更显著的风险相关。
Rosati等(Tumour Biol,2004,25:258-63)报道了旨在测定结肠直肠腺癌中的胸苷酸合成酶(TS)、p53、bcl-2、Ki-67和p27蛋白的表达是否能够预测无病生存期或总生存期的研究结果。对103名患者的样本进行了免疫组织化学检查。根据该文献，TS、p53、bcl-2、Ki-67和p27任一项的表达与临床结果无统计学上的显著相关，尽管在不利结果及p53阴性表达、Ki-67阳性表达和C期癌症的组合中观察到统计学上的显著相关。
然而，尽管该研究根据这一主题开展，但如今从临床角度看只有极少数的肿瘤标记物同时用于CRC诊断和CRC阶段的测定。能够量化患者受益于化疗的可能性，以更准确地确定III期患者治疗的测试是非常有用的。具有类似II期患者的低复发风险及受益于化疗的可能性低的患者可能选择放弃化疗。具有高复发风险及受益于基于5-FU的化疗可能性低的患者可能选择替代治疗。
因此，在本领域需要具有高可靠性的能够诊断CRC并分级结肠直肠癌阶段的标记物或标记物的控制板。
因此，识别患者在最大及最小风险(例如，“高风险”II期及“低风险”III期结肠癌)的准确可靠的方法可以改进这些群体中个性化疗法的选择。
发明概述
在第一方面，本发明涉及一种用于预测罹患结肠直肠癌患者的结果，对结肠直肠癌患者选择合适的治疗或选择可能受益于结肠直肠癌手术切除后的辅助疗法的患者的方法，所述方法包括测定所述患者的样本中的 NPR3/C5orf23、CDKN2B及FLT1基因的表达水平，
其中相对于所述基因的参照值所述基因增加的表达水平表明患者消极结果的可能性增加，即所述患者是手术治疗后接受疗法的候选人或所述患者可能受益于手术治疗后的疗法，或
其中相对于所述基因的参照值所述基因降低的表达水平表明患者积极结果的可能性增加，即所述患者不是手术治疗后接受疗法的候选人或所述患者不大可能受益于手术治疗后的疗法。
在另一方面，本发明涉及一种预测罹患结肠直肠癌患者的结果或对结肠直肠癌患者选择合适的治疗的方法，其包括测定所述患者的样本中的TGF-β2和/或TGF-β3基因的表达水平，
其中相对于所述基因参照值的所述基因增加的表达水平表明患者消极结果的可能性增加，即所述患者是手术治疗后接受疗法的候选人或所述患者可能受益于手术治疗后的疗法，或
其中相对于所述基因参照值的所述基因降低的表达水平表明患者积极结果的可能性增加，即所述患者不是手术治疗后接受疗法的候选人或所述患者不大可能受益于手术治疗后的疗法。
在另一方面，本发明涉及一种试剂盒，其包括足够用于测定NPR3/C5orf23、CDKN2B和FLT1基因表达水平的试剂及任选地测定一个或多个管家基因表达水平的试剂。
在又一方面，本发明涉及根据本发明的试剂盒的应用，其用于预测罹患结肠直肠癌患者的结果，对罹患结肠直肠癌患者选择合适的治疗或选择可能受益于结肠直肠癌手术切除后的辅助疗法的患者。
在又一方面，本发明涉及试剂盒的应用，所述试剂盒包括足够用于测定TGF-β2和/或TGF-β3基因表达水平的试剂及任选地测定一个或多个持家基因表达水平的试剂，其用于预测结肠直肠癌患者的结果，对结肠直肠癌患者选择合适的治疗或选择可能受益于结肠直肠癌手术切除后的辅助疗法的 患者。
附图说明
图1:TGF-β信号在CRC进展期间的腺瘤-癌转化期间增加。该图示出了CRC样品(●)及腺瘤(○)中的TGFB1、2和3的mRNA水平。
图2:TGF-β信号由CRC结合成纤维细胞(CAFs)提供。分离新鲜切除的原发性CRC肿瘤并使用表面标记物的组合通过FACS纯化特定肿瘤细胞群。与上皮细胞和白细胞相比，CAFs表现出相对高的TGFB2及TGFB3的mRNA水平。TGFB1mRNA水平与CAF和白细胞的水平相当，但高于上皮细胞的水平。通过微阵列分析获得结果(n＝8个CRC患者)。
图3:TGF-β信号在CRC的基质成分中优先作用。根据上皮细胞和基质细胞中核p-SMAD3反应性的分布和强度分析腺瘤(n＝25)和CRC样品(n＝30)的分类。然而多数腺瘤的基质含有少量p-SMAD3高度阳性细胞且整体染色较弱，大量CRC(63％)的特征是大量强核p-SMAD3染色的基质细胞，表明这些细胞中有活性TGF-β信号。
图4:示出了F-TBRS是如何产生的。通过处理的或未处理的TGFB的培养基中的CCD-18Co正常结肠成纤维细胞的微阵列分析获得TGF-β诱导的基因。我们通过分析FACS-纯化的患者CRC细胞群的差异表达细化分类(Venn diagram)。F-TBRS由CAF-富集的细胞群中特异性上调的175个探针组成，与另外两部分相比(>2倍,p<0.05)。CCD-18Co中TGF-β诱导的65个探针不在三个细胞群中的任一个显著富集。
图5:F-TBRS标签的表达显示了复发风险的递增效应。
图6:Kaplan-Meier曲线示出了根据F-TBRS的平均表达水平的剩余的治疗后无病的估计概率。
图7:Kaplan-Meier曲线示出了根据AJCC阶段预先分组的患者样本中根据F-TBRS的平均表达水平的剩余的治疗后无病的估计概率。P值是指三组之间的整体差异。
图8:Kaplan Meier曲线示出了对于所有患者(A)，或II期患者(B)或III期患者(C)取决于3个预测因子(CDKN2B、NPR3/C5orf23、FLT-1)的平均表达的存活率。
图9:示出了3个预测因子(CDKN2B、NPR3/C5orf23、FLT-1)的表达与复发风险之间的增加及近似线性关系。
图10:A.Kaplan Meier曲线示出了对于II期患者取决于6个预测因子(FRMD6、ESM1、IGFBP3、FLT1、NPR3/C5orf23和CDKN2B)的平均表达的存活率。B.在所有患者中6个预测因子(FRMD6、ESM1、IGFBP3、FLT1、NPR3/C5orf23和CDKN2B)的表达与复发风险之间的增加及近似线性关系。
图11:A.Kaplan Meier曲线示出了III期患者中取决于6个预测因子(CDKN2B、NPR3/C5orf23、FLT1、GEM、FGF1和MEX3B)的平均表达的存活率。B.在所有患者中6个预测因子(CDKN2B、NPR3/C5orf23、FLT1、GEM、FGF1和MEX3B)的表达与复发风险之间的增加及近似线性关系。
图12:在计算机验证中，结肠II期预测因子的性质与II期CRC患者组(GSE33113)是完全独立的。A.-Kaplan Meier曲线示出了根据结肠II期预测因子的平均表达的剩余的治疗后无病的概率。B.对于结肠II期预测因子的平均表达中的每一个增量(+1SD)，经历复发的风险增加1.47。
图13:在计算机验证中，结肠III期标签的性质与II期和III期CRC患者的数据组(GSE37892)是完全独立的。A.-Kaplan Meier曲线示出了根据结肠III期预测因子的平均表达的剩余的治疗后无病的概率。B.对于结肠III期预测因子的平均表达中的每一个增量(+1SD)，经历复发的风险增加1.52。
图14:示出了肿瘤中的TGFB2和TGFB3mRNA水平预测CRC复发。A.Kaplan-Meier曲线示出了TGFB1、TGFB2和TGFB3mRNA平均高表达(黑线)相比于中表达(灰色虚线)或低表达(灰色实线)的CRCs患者，随着时间的无复发存活率较低(右下图：整体p值)。B.比较了TGFB1、TGFB2 和TGFB3低表达与中表达、低表达与高表达及中表达与高表达的患者随着时间无复发存活概率的风险率(HR)和p值。TGFB2和TGFB3表达水平对于无病存活具有统计学上显著的预测能力。
图15:对于所有患者根据SCAD系数的CRC患者根据其TGF-β2和-β3表达水平分布。
发明详述
本发明的预后方法
基于F-TBRS及包含3或6个基因的迷你标签的预后方法
本发明的作者已确定一组基因，其能够提供识别复发的CRC患者在最大及最小风险(例如，“高风险”II期及“低风险”III期结肠癌)的可靠方法。例如，如本申请的实施例2所示，在正常结肠成纤维细胞(CCD-co-18)中由TGF-β信号诱导的一组127个基因在癌症相关的成纤维细胞中差异表达以响应由结肠直肠肿瘤纯化的上皮细胞和白细胞的TGF-β信号。这组基因允许预测患者的复发，其灵敏度优于AJCC分期。此外，通过进一步细化上述标签，本发明的作者已从所述127个基因标签中选择一小部分基因，其能够预测复发风险。因此，在第一方面，本发明涉及用于预测罹患结肠直肠癌患者的结果的方法(下文中称为本发明的第一预后方法)，其包括测定所述患者样品中的NPR3/C5orf23、CDKN2B和FLT1基因的表达水平，其中相对于所述基因参照值的所述基因增加的表达水平表明患者消极结果的可能性增加或其中其中相对于所述基因参照值的所述基因降低的表达水平表明患者积极结果的可能性增加。
本文中使用的术语“预测结果”是指患者具有特定临床结果的可能性，无论积极的还是消极的。本发明的预测方法可临床使用以通过选择对于任何特定患者最合适的治疗方法做出治疗决定。如果患者有可能积极响应治疗方案，诸如化疗，本发明的预测方法是预测的有价值工具。预测可能包括预后因子。
本领域技术人员可以理解的是，所述预测尽管是优选的，但不需要100％正确地诊断或评估受试者。然而，该术语需要统计学上显著比例的受试者能够被识别为具有给定结果的概率增加。受试者是否是统计学上显著的不需要本领域技术人员再费周折地使用各种已知的统计评价工具就可以被测定，所述统计工具例如，确定置信区间、p值确定、交叉验证分类率等。详细信息可参见Dowdy and Wearden,Statistics for Research,John Wiley&Sons,New York1983。优选的置信区间为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。P值优选为0.01、0.005或更低。
如本文所使用的术语“患者”，是指分类为哺乳类的所有动物，包括，但不限于，家畜和农畜、灵长类动物及人类，例如人类、非人灵长类动物、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫或啮齿动物。优选地，所述患者是任何年龄或种族的男人或女人。
广义使用的术语“结肠直肠癌”是指(1)由大肠和/或直肠的上皮细胞引起的所有阶段和所有形式的癌症和/或(2)影响大肠和/或直肠内层的所有阶段和所有形式的癌症。在用于结肠直肠癌分类的分期系统中，结肠和直肠被当做一个器官。
在优选的实施方案中，患者患有I期、II期、III期或IV期肿瘤，其中I期定义为T1N0M0或T2N0M0；II期定义为T3N0M0或T4N0M0；III期定义为任何T、N1-2；M0及IV期对应于任何T、任何N、M1。根据美国癌症联合委员会(AJCC)的肿瘤、节点、转移(TNM)分期系统(Greene等(eds.),AJCC Cancer Staging Manual.6th Ed.New York,N.Y.:Springer；2002)，结肠直肠癌的各个阶段定义如下：
-肿瘤：T1：肿瘤侵入粘膜下层；T2：肿瘤侵入固有肌层；T3：肿瘤通过固有肌层侵入浆膜下层或侵入结肠周围或直肠周围组织；T4：肿瘤直接侵入其它器官或结构，和/或穿孔。
-节点：N0：无局部淋巴结转移；N1：转移至1至3个局部淋巴结；N2： 转移至4个或更多局部淋巴结。
-转移：M0：mp远距离转移；M1：存在远距离转移。
在优选的实施方案中，被预测结果的患者是已被诊断出结肠直肠癌或已进行癌症手术切除的患者。在优选的实施方案中，所述患者已进行手术切除I期肿瘤、II期肿瘤、III期肿瘤或IV期肿瘤。
在本发明中，术语“样品”或“生物样品”是指从受试者分离的生物材料。生物样品可能含有任何适于检测所需生物标记物的生物材料且可能含有受试者的细胞和/或非细胞材料。所述样品可以从任何合适的组织或生物流体中分离，例如，前列腺组织、血液、血浆、血清、尿液、脑脊髓液(CSF)或粪便。用于测定标记基因的样品优选为活检获得的结肠直肠组织样品。
可选地，所述样品是生物流体样品。本文中可交换使用术语“生物学流体)”及“生物流体”，且指生物起源的水性流体。
所述生物流体可从任何位置(诸如血液、血浆、血清、尿液、胆汁、脑脊髓液、水状液或玻璃体液，或任何身体分泌物)，渗出液(诸如由脓肿或任何其他部位的感染或炎症获得的液体)，或从关节获得的液体(诸如正常关节或如类风湿性关节炎的疾病感染的关节)获得。
在第一步中，本发明的第一方法包括测定所述患者的样品中的NPR3/C5orf23、CDKN2B和FLT1基因的表达水平。
如本文所使用的术语“NPR3/C5orf23”，是指染色体5中发现的开放阅读框23，对应于NPR3利尿钠肽受体C/鸟苷酸环化酶C(心房利尿钠肽受体C)，也被称为FLJ14054或假定蛋白LOC79614。人类NPR3/C5orf23基因在GenBank数据库中的登记号为NG_028162.1。
如本文所使用的术语“CDKN2B”，是指周期蛋白依赖性激酶抑制剂2B，也被称为p15、MTS-22、MTS21、p15CDK抑制剂、INK4B1、P15、p14_CDK抑制剂、TP15、p15INK4b、CDK抑制蛋白、CDK4I1、p14_INK4B2、多肿瘤抑制因子2、周期蛋白依赖性激酶4和6结合蛋白、p14-INK4b、 p15_INK4B2、p15-INK4b或p15INK4B3。人类CDKN2B mRNA的不同亚型在GenBank数据库中的登记号为NM_078487.2和NM_004936.3。
如本文所使用的术语“FLT1”，是指fms-相关的酪氨酸激酶1，也被称为血管内皮生长因子受体，血管渗透因子受体或VEGFR-1。人类编码FLT1的基因在GenBank数据库中的登记号为NG_012003.1。
此外，除了测定上述标记物，根据本发明的方法还可能包括测定一个或多个选自由FRMD6、IGFBP3、ESM1、FGF1、GEM、MEX3B、WNT2、NGF、MSC、SETBP1、FLJ10357、DACT、MURC和Col10A1组成的组中的标记物，其中一个或多个所述基因相对于参照值增加的表达水平表明患者复发的风险增加，或者，其中其中一个或多个所述基因相对于参照值降低的表达水平表明患者复发的风险较低。
如本文所使用的术语“FRMD6”，是指含有6个的FRMD6域，也被称为EX1、Willin、C14orf31、MGC17921、c14_5320。人类FRMD6基因在GenBank数据库中的登记号为AL079307.7。
如本文所使用的术语“IGFBP3”，是指胰岛素样生长因子结合蛋白3，也被称为IBP3或BP-53。人类IGFBP3基因在GenBank数据库中的登记号为NG_011508.1(位点5001至14028)。
如本文所使用的术语“ESM1”，是指内皮细胞特异性分子1，也被称为内皮细胞特异性分子(endocan)。人类ESM1基因在GenBank数据库中的登记号为NC_000005.9(位点54273695至54281414的互补)。
如本文所使用的术语“FGF1”，是指成纤维细胞生长因子1(酸性)，也被称为AFGF、ECGF、FGFA、ECGFA、ECGFB、HBGF1、GLIO703、ECGF-β或FGF-α。人类FGF1基因在GenBank数据库中的登记号为NC_000005.9(位点141971743至142077635的互补)。
如本文所使用的术语“GEM”，是指在骨骼肌中过度表达的GTP结合蛋白，也被称为KIR或MGC26294。人类GEM基因在GenBank数据库中 的登记号为NC_000008.10(位点95261481至95274547的互补)。
如本文所使用的术语“MEX3B”，是指RNA结合蛋白，也被称为RKHD3、MEX-3B、RNF195、MGC117199或DKFZp434J0617。人类MEX3B基因在GenBank数据库中的登记号为NC_000015.9(位点82334128至82338361的互补)。
如本文所使用的术语“WNT2”，是指无翅型MMTV整合位点家族成员2，也被称为IRP或INT1L1。人类WNT2基因在GenBank数据库中的登记号为NC_000007.13(位点116916685至116963343的互补)。
如本文所使用的术语“NGF”，是指神经生长因子，也被称为NGFB、HSAN5、β-NGF、MGC161426或MGC161428。人类NGF基因在GenBank数据库中的登记号为NG_007944.1(位点5001至57321)。
如本文所使用的术语“MSC”，是指肌蛋白基因，也被称为ABF1、MYOR、ABF-1或bHLHa22。人类MSC基因在GenBank数据库中的登记号为NC_000008.10(位点72753777至72756731的互补)。
如本文所使用的术语“SETBP1”，是指SET结合蛋白1，也被称为SEB、KIAA0437或DKFZp666J1210。人类编码SETBP1基因在GenBank数据库中的登记号为G_027527.1(位点5001至393338)。
如本文所使用的术语“FLJ10357”，是指Rho鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)40，也被称为ARHGEF40、SOLO或蛋白SOLO。人类编码FLJ10357基因在GenBank数据库中的登记号为NC_000014.8(位点21538527至21558036)。基因FLJ10357也被称为ARHGEF40。
如本文所使用的术语“DACT1”，是指dapper、β-连环蛋白的拮抗剂，同系物1，也称作DAPPER1、FRODO、DPR1、HDPR1、THYEX3、DAPPER、肝癌新基因3蛋白、HNG3或hDPR1。人类编码DACT1基因在GenBank数据库中的登记号为NC_000014.8(位点59104757至59115039)。
如本文所使用的术语“MURC”，是指肌肉相关的卷曲螺旋蛋白。人类编 码MURC基因在GenBank数据库中的登记号为NC_000009.11(位点103340336至103350180)。
如本文所使用的术语“Col10A1”，是指X型、α1胶原蛋白。人类编码Col10A1基因在GenBank数据库中的登记号为NG_008032.1(位点5001至12212)。
可以理解的是根据本发明的方法可以包括测定一个或多个上述基因的任何自然发生的多态变体。
在优选的实施方案中，在本发明的第一方法中使用的标记基因是FRMD6、ESM1、IGFBP3、FLT1、NPR3/C5orf23和CDKN2B，且患者为II期CRC患者。
在优选的实施方案中，在本发明的第一方法中使用的标记基因是CDKN2B、NPR3/C5orf23、FLT1、GEM、FGF1和MEX3B，且患者为III期CRC患者。
在优选的实施方案中，本发明的方法包括测定基因FRMD6、IGFBP3、ESM1、FGF1、GEM、MEX3B、WNT2、NGF、MSC、NPR3/C5orf23、CDKN2B、SETBP1、FLJ10357、DACT、MURC、FLT1和Col10A1的表达水平。
根据本发明的方法还可能包括测定一个或多个形成F-TBRS的基因的表达水平，即在富集癌症相关成纤维细胞(富集CAFs；EPCAM-CD45-)的细胞群及EPCAM+和EPCAM-cd45+细胞群之间差异表达的基因，且第一细胞群中的所述基因相对于第二和第三细胞群至少增加两倍，其中相对于所述基因的参照值所述基因增加的表达水平表明患者复发的风险增加，或者，其中相对于所述基因的参照值所述基因降低的表达水平表明患者复发的风险较低。
在优选的实施方案中，预测结肠直肠癌患者的结果的方法包括测定基因ANGPTL2、ANGPTL4、APBB2、BMPR2、BPGM、C13orf33、C5orf13、NPR3/C5orf23、CACHD1、CALD1、CDH6、CDKN2B、CILP、CNTN1、 COL10A1、COL12A1、COL27A1、DACT1、DIXDC1、DNAJB5、DNAJC18、ELTD1、EPHA4、ESM1、FAP、FGD6、FGF1、FGF2、FLJ10357、FLT-1、FN1、FRMD4A、FRMD6、GAS1、GEM、GFPT2、GPR161、HAS2、HEY1、HIC1、HS3ST3A1、IGFBP3、IGFBP7、IL11、INHBA、KAL1、KIAA1755、KLF7、LARP6、LMCD1、LMO4、LOC100128178、LOC644242、LOC728264、LOH3CR2A、LRRC8A、MEOX1、MEX3B、MFAP2、MGC16121、MSC、MURC、NEDD9、NGF、NOX4、NPR2、NUAK1、OSGIN2、PALLD、PALM2、PDGFA、PDGFC、PDLIM4、PDPN、PGM2L1、PKNOX2、PMEPA1、PODXL、PPM1E、PTHLH、RASD1、RASGRP3、RASL12、RGS4、RNF150、RUNX1、S1PR5、SEMA6D、SERPINE1、SETBP1、SHISA2、SLC46A3、SNCAIP、SNORD114-3、SOX6、SPSB1、STK38L、SYNE1、SYTL4、TCF4、TGFB2、TIMP3、TMEM88、TNC、TNS1、TPM1、TSHZ3、TSPAN2、VEPH1、WNT2、WNT9A和ZEB1基因及与具有序列SEQ ID NO:1至13的探针特异性杂交的基因的表达水平，其中相对于所述基因的参照值所述基因增加的表达水平表明患者消极结果的可能性增加，或者，其中相对于所述基因的参照值所述基因降低的表达水平表明患者积极结果的可能性增加。
如本文所使用的术语“特异性杂交”，是指允许两个多核苷酸序列在高度严格或中等严格条件下杂交的情况。在下文中的表述“高度严格条件”和“中等严格条件”关于本发明的试剂盒中的定义且同样适用于本发明方法的内容中。
实际上在本发明的范围内可使用任何常规方法以检测所述标记基因的水平并对于所述标记基因的水平定量。通过非限制性说明方式，通过量化由所述基因编码的mRNA水平或量化蛋白水平测定表达水平。
测定mRNA量的方法在本领域是众所周知的。例如，根据标准方法首先提取样品(例如，从患者中制备的细胞或组织)中含有的核酸，所述标准方法例如使用裂解酶或化学溶液，或按照说明书通过核酸结合树脂提取核 酸。然后通过杂交(例如，Northern印迹分析或将mRNA转化为标记的cDNA后通过寡核苷酸微阵列)和/或扩增(例如，RT-PCR)检测所提取的mRNA。优选为定量或半定量RT-PCR。实时定量或半定量RT-PCR是特别有利的。优选地，设计引物对以重叠内含子从而从推定的基因污染区分cDNA扩增。本领域技术人员可容易地设计合适的引物。扩增的其他方法包括连接酶链式反应(LCR)、转录介导的扩增(TMA)、链置换扩增(SDA)及基于核酸序列的扩增(NASBA)。优选地，通过定量或半定量RT-PCR或通过实时定量或半定量RT-PCR测定mRNA的量。
可选地，还可通过测定由所述基因编码的蛋白的表达水平以测定标记基因的表达水平，因为如果基因的表达增加，相应蛋白质的数量也应该增加。可使用任何常规方法进行测定不同蛋白质的表达水平。通过非限制性实施例，所述测定可使用能够与待测定的蛋白质(或其含有抗原决定簇的片段)特异性结合的抗体进行，随后量化得到的抗原-抗体复合物。在这种类型的试验中，将使用的抗体可以是，例如多克隆血清、杂交瘤上清液或单克隆抗体、抗体片段、Fv、Fab、Fab’和F(ab’)2、scFv、双抗体、三抗体、四抗体和人源化抗体。同时，抗体可以标记或不标记。示例性但非限制性的，可使用的标记物的实施例包括放射性同位素、酶、荧光团、化学发光试剂、酶辅因子或底物、酶抑制剂、颗粒、染料等。在本发明中可使用熟知的各种各样的试验，使用未标记的抗体(第一抗体)及标记的抗体(第二抗体)；这些技术包括Western印迹或免疫印迹、ELISA(酶联免疫吸附测定)、RIA(放射免疫测定)、竞争性EIA(酶免疫测定)、DAS-ELISA(双抗体夹心ELISA)、免疫细胞化学和免疫组织化学技术，基于使用生物芯片或蛋白质微阵列(包括特异性抗体)的技术，或基于胶态沉淀(例如试剂条的形式)的试验。检测和量化蛋白质的其他形式包括亲和层析色谱、配体结合测定等。
当测定患者样品中上述基因的表达水平，该表达水平将与每个所述基因的参照值相比较。通常，参照值是在参照样品中被比较的基因的表达水平。
如本文所使用的“参照样品”是指从一组无疾病状态或特定表现的健康受试者中所得的样品。例如，参照样品可包括由未患有结肠癌或无结肠癌病史的患者的结肠粘膜得到的样品。可选地，所述参照样品可以是一个或一组低复发风险的结肠癌样品。这个样品或这组样品可从已进行手术切除肿瘤且未复发的患者获得，优选地所述患者未进行辅助化疗。在另一实施方案中，所述参照样品是一个I型CRC或一组I型CRCs的样品。
通过测量几个合适受试者中所述基因的表达水平可以确定基因合适的参照表达水平，且这种参照水平可根据特定受试者群体进行调整(例如，参照水平可与年龄相关以在特定年龄的受试者样品中的表达水平与特定年龄组中特定疾病状态、表型或缺乏表达的参照水平之间进行比较)。在优选的实施方案中，所述参照样品从几个健康受试者或无结肠直肠癌病史的患者中获得。可选地，所述参照样品是一个或一组患者的结肠癌样品，所述患者已进行手术切除肿瘤且未复发，优选未进行辅助化疗。本领域技术人员将理解的是参照样品的类型可以根据使用的特定方法而变化。因此，在进行疾病的诊断或预后的情况下，所述参照样品可能是一组非肿瘤结肠直肠组织样品，其可从无结肠直肠癌病史的个体获得或从一组相对于单独肿瘤组织较远的非肿瘤组织获得，或者是一个或一组患者结肠癌样品，所述患者已进行手术切除肿瘤且未复发，优选未进行辅助化疗。在本发明方法的目的是测定患者的治疗效果的情况下，所述参照样品优选为从开始治疗前的所述患者获得的样品。
参照样品中基因的表达谱可优选地由两个或多个个体群体生成。群体，可包括3、4、5、10、15、20、30、40、50或更多个体。此外，参照样品中和个体样品中基因的表达谱将根据本发明的方法进行诊断，其可由相同的个体产生，条件是待测定的图谱和参照图谱由不同时间获得的生物样品生成且相互比较。例如，可在研究阶段的起始期获得个体的样品。然后可以将这个样品的参照生物标记图谱与相同个体的后续样品产生的生物标记图谱相比 较。在优选的实施方案中，所述参照样品是一组来自几个个体的样品，且对应于远离肿瘤区域的结肠直肠组织部分，优选地其从相同的活检获得但不具有任何肿瘤组织的解剖病理学特征。
一旦测定与所述基因的参照值相关的标记基因的表达水平，必须确定所述基因的表达是否有变化(表达的增加或降低)。当本研究受试者样品中的基因表达水平相对于参照样品增加至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％或更多时，认为基因表达增加。类似地，当基因表达水平相对于参照样品降低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％(即不表达)时，认为基因表达降低。
最后，如果标记基因相对于参照样品显示出增加的表达水平，患者将被归类为具有高风险的消极结果，并且，如果标记基因相对于参照样品显示出降低的表达水平，患者将被归类为具有低风险的消极结果。在优选的实施方案中，如果基因的表达水平高于一个或一组患者结肠癌的样品中相同基因的表达水平，其中所述患者已进行手术切除肿瘤且未复发，优选未进行辅助化疗，患者则将被归类为具有高风险的消极结果。
与CRC有关的术语“积极结果”是指患者状态在任何方法下的好转，包括本领域中通常使用的那些方法，诸如，延长无复发间隔(RFI)的持续时间，延长总生存期(OS)的时间，延长无病生存期(DFS)的时间，延长远距离无复发间隔(DRFI)的持续时间等。积极临床结果的可能性增加对应于癌症复发的可能性降低。
与CRC有关的术语“消极结果”是指患者状态在任何方法下的恶化， 包括本领域中通常使用的那些方法，诸如，缩短无复发间隔(RFI)的持续时间，缩短总生存期(OS)的时间，缩短无病生存期(DFS)的时间，缩短远距离无复发间隔(DRFI)的持续时间等。消极临床结果的可能性增加对应于癌症复发的可能性增加。
在优选的实施方案中，给定患者的结果测量为转移的风险或复发的风险。
如本文所使用的术语“转移的风险”，是指与已治疗或诊断的受试者或个体相比，有关受试者或个体可能在限定的时间间隔内在解剖学的远距离位置产生相似或相同肿瘤疾病的几率或概率的可能性或概率评估。
如本文中所使用的术语“转移”是指器官或身体部分中癌性肿瘤的生长，所述身体部分不直接与原始癌性肿瘤的器官相连。转移将被理解为包括微转移，其以器官或身体部分中检测不到的数量的癌细胞存在，所述身体部分不直接与原始癌性肿瘤的器官相连。在优选的实施方案中，所述转移是肝转移。
如本文所使用的术语“复发的风险”，是指与已治疗或诊断的受试者或个体相比较，有关受试者或个体可能在限定的时间间隔内罹患或产生相似或相同肿瘤疾病(相同的解剖学位置或解剖学的远距离位置)的几率或概率的可能性或概率评估。
根据本发明的方法还考虑了结合上述不同标记基因的表达水平与一个或多个临床预后因子预测患者结果的可能性。
预后因子是与结肠直肠癌自然史相关的那些变量，其影响产生结肠直肠癌的患者的复发率及结果。与不良预后相关的临床参数包括，例如，淋巴结转移，及高度恶化肿瘤。预后因子通常用于将患者分类为具有不同基线复发风险的子群。在优选的实施方案中，在本发明的方法中使用的临床预后因子是肿瘤分期，其中升高的肿瘤阶段表示复发的风险增加，或其中降低的肿瘤阶段表示患者复发的风险较低。
在优选的实施方案中，临床预后因子是根据AJCC分类(参见例如AJCC  Cancer Staging Manual,Seventh Edition(2010)，Springer-Verlag New York发表，通过引用并入本文中)的肿瘤分期，如上所述。如上所述的术语“肿瘤分期”是基于肿瘤的TNM值测定的值。因此，I期对应于T1N0M0或T2N0M0；II期对应于T3N0M0或T4N0M0；III期对应于任何T、N1-2；M0及IV期对应于任何T、任何N和M1。
因此，在优选的实施方案中，本发明还包括测定患者的肿瘤阶段，其中高肿瘤阶段表示复发的风险增加或低肿瘤阶段表示复发的风险降低。
如本文所使用的术语“低肿瘤阶段”，是指AJCC I期或II期。
如本文所使用的术语“高肿瘤阶段”，是指AJCC III期或IV期。
根据本发明分析的患者可能已进行或未进行一种或多种治疗，所述治疗的目的是在测定之前减小肿瘤大小。因此，在优选的实施方案中，患者在进行根据本发明的不同基因的表达水平的测定之前未进行治疗。在另一实施方案中，患者在进行根据本发明的不同基因的表达水平的测定之前已进行治疗，所述治疗选自由化疗、放疗或手术组成的组。
在下文中详细定义术语“化疗”、“放疗”及“手术”，且在本发明的内容中使用相同含义。
基于TGF-β2和TGF-β3表达水平的预后方法
本发明的作者还观察到TGF-β2和/或TGF-β3的表达水平也是CRC患者结果的良好预测因子。鉴于TGF-β2和/或TGFβ3是分泌分子，该发现能够通过测定生物流体中的TGF-β2和/或TGF-β3表达水平以确定患者的预后，提供根据本发明的预测方法的非侵入方式。
因此，在另一方面，本发明涉及一种预测罹患结肠直肠癌患者的结果的方法(下文中称为本发明的第二预后方法)，其包括测定所述患者样品中TGF-β2和/或TGF-β3基因的表达水平，其中相对于每个基因的参照值所述基因增加的表达水平表明消极结果的可能性增加，或其中相对于每个基因的参照值所述基因降低的表达水平表明积极结果的可能性增加。
术语和表述“预测结果”、“结肠直肠癌”、“样品”、“患者”、“增加的表达水平”、“降低的表达水平”、“参照值”、“积极结果”和“消极结果”已在本发明的第一预后方法的内容中详细介绍且在本发明方法的内容中使用相同含义。
在优选的实施方案中，待预测结果的患者是已被诊断出结肠直肠癌且已进行手术切除癌症的患者。
在第一步中，本发明的第二预后方法包括测定患者样品的TGF-β2和/或TGF-β3基因的表达水平。
如本文所使用的术语“TGFβ2”，是指转化生长因子β2，如NBCI数据库中登录号为NP_001129071(亚型1)或NP_003229(亚型2)所示的人类同源基因，登录号为CAB42003的大鼠同源基因，及登录号为AAH11170的小鼠同源基因所示。术语“TGFβ2”还指任何上述序列自然发生的变体和多晶型形式。
如本文所使用的术语“TGFβ3”，是指对应于NCBI数据库中登录号为NP_003230所示的人类TGF-β3前原蛋白同源基因的氨基酸301至412，及对应于登录号为NP_037306所示的大鼠TGF-β3前原蛋白同源基因的氨基酸301至412的转化生长因子(TGF)β3。术语“TGFβ3”还指任何上述序列自然发生的变体和多晶型形式。
可通过测定所述基因的mRNA水平或测定由所述基因编码的蛋白质水平以测定TGF-β2和/或TGF-β3基因的表达水平。已在上述本发明的第一预后方法的内容中详细描述了用于测定给定mRNA或多肽的表达水平的合适方法。
在还一实施方案中，根据本发明的方法在选自由肿瘤活检或生物流体组成的组的样品中进行。在另一实施方案中，当样品为生物流体时，所述生物流体选自由血液、血浆和血清组成的组。
在优选的实施方案中，通过RT-PCR进行测定TGF-β2和/或TGF-β3的 表达水平。在还一实施方案中，其中样品是肿瘤样品，然后通过RT-PCR测定TGF-β2和/或TGFβ3的表达水平。在另一实施方案中，其中样品是生物流体，然后通过测量相应的TGF-β2和TGF-β3多肽的水平测定表达水平。
所述方法还包括，除了测定上述基因的表达水平，确定肿瘤阶段，其中高肿瘤阶段表明复发的风险增加或其中低肿瘤阶段表明患者复发的风险较低。术语“高肿瘤阶段”和“低肿瘤阶段”如上详细定义且在本发明方法的内容中使用相同含义。
在优选的实施方案中，在结肠直肠癌患者的样品中进行预后方法，其中结肠直肠癌是II期或III期结肠直肠肿瘤。在另一实施方案中，所述方法在已进行手术切除肿瘤的患者中进行。
在还一实施方案中，根据本发明方法测定患者结果通过测定诊断时刻的转移的风险或复发的风险进行。
根据本发明的个性化治疗方法
上述定义的预后方法还允许向罹患结肠直肠癌患者提供个性化疗法。特别是，被认为具有高复发风险的患者将最可能受益于手术后的额外治疗。相反地，具有低复发风险的患者可以放弃手术后的额外治疗。
基于F-TBRS和迷你标签的表达水平的个性化药物
因此，在另一方面，本发明涉及一种用于为结肠直肠癌患者选择合适疗法的方法(下文中称为本发明的第一种个性化治疗方法)，其包括测定所述患者样品中NPR3/C5orf23、CDKN2B和FLT1基因的表达水平，其中相对于所述基因的参照值所述基因增加的表达水平表明患者是接受手术治疗后辅助放疗或化疗的候选人，或其中相对于所述基因的参照值所述基因降低的表达水平表明患者不是接受手术治疗后辅助放疗或化疗的候选人。
如本文所使用的“治疗”是指试图预防、治愈、延迟、降低疾病或病症或复发的疾病或病症的严重度，或改善疾病或病症或复发的疾病或病症的一种或多种症状，或为了延长患者的存活期(其超过了在不进行这种治疗的情 况下预测的存活期)的临床干预。
术语“结肠直肠癌”已在本发明预后方法的内容中详细描述且其在根据本发明的个性化方法的内容中使用相同含义。
在第一步中，根据本发明的第一种个性化治疗方法包括测定所述患者样品中的NPR3/C5orf23、CDKN2B和FLT1基因的表达水平。
术语“结肠直肠癌”、“患者”、“NPR3/C5orf23基因”、“CDKN2B基因”、“FLT1基因”、“表达水平”、“样品”已在上文中详细描述且同样适用于根据本发明方法的方法。
此外，除了测定上述标记物，根据本发明的第一种个性化方法还包括测定一个或多个选自由FRMD6、IGFBP3、ESM1、FGF1、GEM、MEX3B、WNT2、NGF、MSC、SETBP1、FLJ10357、DACT、MURC和Col10A1组成的组中的标记物，其中相对于参照值，一个或多个所述基因增加的表达水平表明患者是接受手术治疗后疗法的候选人，或其中相对于所述基因的参照值所述基因降低的表达水平表明患者不是接受手术治疗后疗法的候选人。
在优选的实施方案中，根据本发明的第一种个性化治疗方法包括测定基因CDKN2B、NPR3/C5orf23、FLT1、FRMD6、IGFBP3和ESM1的表达水平并且测定在II期结肠直肠癌患者的样品中进行。
在另一优选的实施方案中，根据本发明的第一种个性化治疗方法包括测定CDKN2B、NPR3/C5orf23、FLT1、FGF1、GEM和MEX3B基因的水平并且测定在III期结肠直肠癌患者的样品中进行。
在又一实施方案中，根据本发明的第一种个性化治疗方法还包括测定一个或多个如表1所示的基因的表达水平，所述基因的特征在于在相对于EPCAM+富集CAF的柱中其FC值大于2，其中相对于所述基因的参照值所述基因增加的表达水平表明患者是接受手术治疗后辅助治疗的候选人，或其中相对于所述基因的参照值所述基因降低的表达水平表明患者不是接受手术治疗后疗法的候选人。
在优选的实施方案中，根据本发明的第一种个性化疗法包括测定基因ANGPTL2、ANGPTL4、APBB2、BMPR2、BPGM、C13orf33、C5orf13、NPR3/C5orf23、CACHD1、CALD1、CDH6、CDKN2B、CILP、CNTN1、COL10A1、COL12A1、COL27A1、DACT1、DIXDC1、DNAJB5、DNAJC18、ELTD1、EPHA4、ESM1、FAP、FGD6、FGF1、FGF2、FLJ10357、FLT-1、FN1、FRMD4A、FRMD6、GAS1、GEM、GFPT2、GPR161、HAS2、HEY1、HIC1、HS3ST3A1、IGFBP3、IGFBP7、IL11、INHBA、KAL1、KIAA1755、KLF7、LARP6、LMCD1、LMO4、LOC100128178、LOC644242、LOC728264、LOH3CR2A、LRRC8A、MEOX1、MEX3B、MFAP2、MGC16121、MSC、MURC、NEDD9、NGF、NOX4、NPR2、NUAK1、OSGIN2、PALLD、PALM2、PDGFA、PDGFC、PDLIM4、PDPN、PGM2L1、PKNOX2、PMEPA1、PODXL、PPM1E、PTHLH、RASD1、RASGRP3、RASL12、RGS4、RNF150、RUNX1、S1PR5、SEMA6D、SERPINE1、SETBP1、SHISA2、SLC46A3、SNCAIP、SNORD114-3、SOX6、SPSB1、STK38L、SYNE1、SYTL4、TCF4、TGFB2、TIMP3、TMEM88、TNC、TNS1、TPM1、TSHZ3、TSPAN2、VEPH1、WNT2、WNT9A和ZEB1基因及与具有序列SEQ ID NO:1至13的探针特异性杂交的基因的表达水平，其中相对于所述基因的参照值所述基因增加的表达水平表明患者是接受手术治疗后辅助放疗或化疗的候选人，其中相对于一个或多个所述基因的参照值所述基因降低的表达水平表明患者不是接受手术治疗后放疗或化疗的候选人。
如本文所使用的术语“特异性杂交”，是指允许两个多核苷酸序列在高度严格或中等严格条件下杂交的情况。表述“高度严格条件”和“中等严格条件”在下述关于本发明的试剂盒中定义且同样适用于本发明方法的内容中。
可通过测定由所述基因编码的mRNA水平或测定由所述基因编码的多肽水平测定在本发明的第一种个性化方法中使用的不同基因的表达水平。
在第二步中，根据本发明的第一种个性化疗法包括识别相对于所述基因的参照值所述基因的表达水平增加且作为接受手术治疗后的辅助放疗或化疗的候选人的患者，或识别相对于参照值所述基因的表达水平降低且不作为接受手术后的放疗或化疗的候选人的患者。
如本文所使用的术语“手术”，是指包括在人类或其他哺乳动物的身体上的手部或手部使用仪器有条理的操作的任何治疗过程以产生疗效或补救。
如本文所使用的术语“化疗”、“化疗药物”，广义地是指使用化学药物或其组合用于治疗癌症、肿瘤或恶性瘤形成，包括细胞毒性或抑制细胞生长的药物。根据本发明的化疗药物的实施例包括：
-烷化剂(例如氮芥、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、链脲霉素、卡莫司汀、洛莫司汀、美法仑、白消安、达卡巴嗪、替莫唑胺、塞替派或六甲蜜胺)；
-铂类药物(例如顺铂，卡铂或奥沙利铂)；
-抗代谢药物(例如5-氟尿嘧啶、卡培他滨、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、吉西他滨、阿糖胞苷、氟达拉滨或培美曲塞)；
-抗肿瘤抗生素(例如柔红霉素、阿霉素、表柔比星、伊达比星、放线菌素-D、博莱霉素、丝裂霉素C或米托蒽醌)；
-有丝分裂抑制剂(例如紫杉醇、多烯紫杉醇、伊沙匹隆、长春碱，长春新碱、长春瑞滨、长春地辛或雌莫司汀)；以及
-拓扑异构酶抑制剂(例如依托泊苷、替尼泊苷、托泊替康、伊立替康、二氟替康或厄洛替康)。
术语“放疗”是本领域中常用于指多种类型的放射疗法的术语，所述放射疗法包括内部和外部放射疗法或放射免疫治疗，且使用多种类型的辐射，其包括X射线、γ射线、α粒子、β粒子、光子、电子、中子、放射性同位素或其他形式的电离辐射。
在优选的实施方案中，所述疗法是新辅助疗法或辅助化疗。
如本文所使用的术语“新辅助疗法”，是指在手术切除癌症患者的原发性肿瘤之前，对癌症给予的任何类型的治疗。新辅助疗法最常用的原因是减小肿瘤的大小以有助于更有效的手术。新辅助疗法包括放疗和疗法，优选为全身性治疗，诸如激素疗法、化疗、免疫疗法及单克隆抗体疗法。
如本文所使用的术语“辅助疗法”，是指通常在手术切除癌症患者的原发性肿瘤之后给予的作为额外治疗的对癌症的任何类型的治疗(例如，化疗或放疗)，所述癌症患者具有转移的风险和/或可能复发的风险。这种辅助治疗的目的是改善预后。辅助疗法包括放疗和疗法，优选为全身性治疗，诸如激素疗法、化疗、免疫疗法及单克隆抗体疗法。
在优选的实施方案中，化疗包括使用一种或多种TGF-β抑制剂。
本发明中“TGFβ抑制剂”应理解为能够预防由TGFβ及其受体的相互作用导致的信号传输的任何化合物。根据本发明可使用的TGFβ1抑制剂包括预防TGFβ竞争性或变构结合至其受体的化合物，结合至TGFβ的化合物及抑制TGFβ的细胞内信号转导的化合物。用于测定TGFβ抑制剂的抑制能力的合适试验包括在Mv-1-Lu细胞增殖试验中使用抑制剂体外抑制TGFβ的生物活性，及使用CCl₄诱导的急性肝损伤模型通过抑制剂体内抑制TGFβ的生物活性(WO200519244中公开)。关于TGF-β拮抗剂的更多细节参见Wojtowicz-Praga(2003)。
在本发明中使用的合适的TGFβ抑制剂包括，但不限于，
-能够自然结合并抑制TGFβ的可溶性蛋白(LAP、核心蛋白聚糖、纤调蛋白聚糖、光蛋白聚糖、内皮糖蛋白、α2-巨球蛋白)。
-与TGFβ内源性受体竞争结合配体的受体，如BAMBI。在本发明中，TGFβ可溶性受体理解为TGFβ受体的胞外结构域，其可通过内皮糖蛋白或β聚糖(III型受体)的蛋白水解处理，或通过只表达I型和II型TGFβ受体的胞外结构域的重组技术来生理上的获得。
-抑制性抗-TGFβ抗体包括，但不限于，多特异性、多克隆、单克隆抗 体及其F(ab′)₂、Fab片段，例如EP117544，Ling等(J.Amer.Soc.Nephrol.14:377-388(2003))，McCormick等(J.Immunol.,1999,163:5693-5699)及Cordeiro(Curr.Opin.MoI.Ther.,2003,5:199-203)中所述的那些；
-对TGFβ受体和TGFβ受体可溶形式具有特异性的单克隆及多克隆抗体；
-TGF-β受体I型激酶抑制剂，例如，DaCosta Bayfield,(Mol.Pharmacol.,2004,65:744-52),Laping,(Curr.Opin.Pharmacol.,2003,3:204-8)及Laping(Mol.Pharmacol.,2002,62:58-64)中所述；
-小分子，例如曲尼司特(N-[3,4-二甲氧基肉桂酰]-邻氨基苯甲酸)(Wilkenson,K.A.2000)，SB-431542(TGF-β受体II的抑制剂)；4-(5-苯并[l,3]二氧杂环戊烯-5-基-4-吡啶-2-基-lH-咪唑-2-基)-苯甲酰胺水合物，4-[4-(3,4-亚甲基二氧苯基)-5-(2-吡啶基)-lH-咪唑-2-基]-苯甲酰胺水合物，4-[4-(l,3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-(2-吡啶基)-lH-咪唑-2-基]-苯甲酰胺水合物)；NPC-30345(TGF-β受体I的抑制剂)；LY364947(TGF-β受体I的抑制剂；4-[3-(2-吡啶基)-IH-吡唑-4-基]-喹啉)；A-83-01(I型TGF-β受体的抑制剂；3-(6-甲基吡啶-2-基)-l-苯基硫代氨基甲酰基-4-喹啉-4-基吡唑)；LY2157299(I型TGF-β受体的抑制剂；Lilly研究)；LY550410(I型TGF-β受体的抑制剂；Lilly Research)；LY580276(I型TGF-β受体的抑制剂；Lilly研究)；LY566578(I型TGF-β受体的抑制剂；Lilly研究)；SB-505124(I型TGF-β受体的选择性抑制剂；2-(5-苯并[l,3]二氧杂环戊烯-5-基-2-叔丁基-3H-咪唑-4-基)-6-甲基吡啶盐酸盐)；SD-093(I型TGF-β受体的抑制剂；Scios Inc)；或SD-208(I型TGF-β受体的抑制剂)。
-作为TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3一部分的肽，在Mittl(1996)中公开。
-包含从TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3肽末端开始计数的112个氨基酸的肽。这些肽的起始于RXXR基序之后，结束于TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3肽末端之前的113个氨基酸，其中R是氨基酸精氨酸且XX表示任何氨基 酸或无氨基酸。
-TGF-β特异性反义寡聚核苷酸，siRNAs或shRNAs。
其他合适的TGF-β抑制剂在表2中定义，如Kelly和Morris(J.Immunotoxicol.,2010,7:15-26)所给出的那些。

在优选的实施方案中，所述疗法是新辅助疗法或辅助化疗。
如本文所使用的术语“新辅助疗法”，是指在手术切除癌症患者的原发 性肿瘤之前，对癌症给予的任何类型的治疗。新辅助疗法最常用的原因是减小肿瘤的大小以有助于更有效的手术。新辅助疗法包括放疗和疗法，优选为全身性治疗，诸如激素疗法、化疗、免疫疗法及单克隆抗体疗法。
如本文所使用的术语“辅助疗法”，是指通常在手术切除癌症患者的原发性肿瘤之后给予的作为额外治疗的对癌症的任何类型的治疗(例如，化疗或放疗)，所述癌症患者具有转移的风险和/或可能复发的风险。这种辅助治疗的目的是改善预后。辅助疗法包括放疗和疗法，优选为全身性治疗，诸如激素疗法、化疗、免疫疗法及单克隆抗体疗法。
在另一方面，本发明涉及一种选择可能受益于手术切除结肠直肠癌后的辅助疗法的患者的方法(下文中称为“本发明的第二种个性化治疗方法”)，其包括测定所述患者样品中NPR3/C5orf23、CDKN2B和FLT1的表达水平，其中相对于所述基因的参照值所述基因增加的表达水平表明患者可能受益于手术治疗后的疗法，或其中相对于所述基因的参照值所述基因降低的表达水平表明患者不大可能受益于手术治疗后的疗法。
如本文所使用的术语“治疗”或“疗法”可模糊使用且指试图预防、治愈、延迟、降低疾病或病症或复发的疾病或病症的严重度，或改善疾病或病症或复发的疾病或病症的一种或多种症状，或为了延长患者的存活期(其超过了在不进行这种治疗的情况下预测的存活期)的临床干预。
术语“结肠直肠癌”已在本发明预后方法的内容中详细描述且其在根据本发明的个性化方法的内容中使用相同含义。
在第一步中，根据本发明的第二种个性化治疗方法包括测定所述患者样品中的NPR3/C5orf23、CDKN2B和FLT1基因的表达水平。
术语“结肠直肠癌”、“患者”、“NPR3/C5orf23基因”、“CDKN2B基因”、“FLT1基因”、“表达水平”、“样品”及“疗法”已在上文中详细描述且其同样适用于根据本发明方法的方法。
在又一优选方法中，除了测定NPR3/C5orf23、CDKN2B和FLT1基因 的表达水平，根据本发明的第二种个性化治疗方法还包括测定一个或多个选自由FRMD6、IGFBP3、ESM1、FGF1、GEM、MEX3B、WNT2、NGF、MSC、SETBP1、FLJ10357、DACT、MURC和Col10A1组成的组中的基因的表达水平，其中相对于一个或多个所述基因的参照值一个或多个所述基因增加的表达水平表明患者是接受手术治疗后辅助疗法候选人，其中相对于一个或多个所述基因的参照值所述基因降低的表达水平表明患者不是接受手术治疗后放疗或化疗的候选人。
在优选的实施方案中，根据本发明的第二种个性化治疗方法包括测定基因CDKN2B、NPR3/C5orf23、FLT1、FRMD6、IGFBP3和ESM1的表达水平并且测定在II期结肠直肠癌患者的样品中进行。
在另一优选的实施方案中，根据本发明的第二种个性化治疗方法包括测定CDKN2B、NPR3/C5orf23、FLT1、FGF1、GEM和MEX3B基因的水平并且测定在III期结肠直肠癌患者的样品中进行。
涉及每种这些基因的术语已在上文中详细描述且其同样适用于根据本发明方法的方法。
在又一实施方案中，根据本发明的第二种个性化治疗方法包括测定如表1所示的基因的表达水平，所述基因在相对于EPCAM+富集CAF的柱中其FC值大于2，其中相对于所述基因的参照值所述基因增加的表达水平表明患者可能受益于手术治疗后的疗法，或其中相对于所述基因的参照值所述基因降低的表达水平表明患者不大可能受益于手术治疗后的疗法。
因此，在另一实施方案中，根据本发明的第二种个性化疗法还包括测定ANGPTL2、ANGPTL4、APBB2、BMPR2、BPGM、C13orf33、C5orf13、NPR3/C5orf23、CACHD1、CALD1、CDH6、CDKN2B、CILP、CNTN1、COL10A1、COL12A1、COL27A1、DACT1、DIXDC1、DNAJB5、DNAJC18、ELTD1、EPHA4、ESM1、FAP、FGD6、FGF1、FGF2、FLJ10357、FLT-1、FN1、FRMD4A、FRMD6、GAS1、GEM、GFPT2、GPR161、HAS2、HEY1、 HIC1、HS3ST3A1、IGFBP3、IGFBP7、IL11、INHBA、KAL1、KIAA1755、KLF7、LARP6、LMCD1、LMO4、LOC100128178、LOC644242、LOC728264、LOH3CR2A、LRRC8A、MEOX1、MEX3B、MFAP2、MGC16121、MSC、MURC、NEDD9、NGF、NOX4、NPR2、NUAK1、OSGIN2、PALLD、PALM2、PDGFA、PDGFC、PDLIM4、PDPN、PGM2L1、PKNOX2、PMEPA1、PODXL、PPM1E、PTHLH、RASD1、RASGRP3、RASL12、RGS4、RNF150、RUNX1、S1PR5、SEMA6D、SERPINE1、SETBP1、SHISA2、SLC46A3、SNCAIP、SNORD114-3、SOX6、SPSB1、STK38L、SYNE1、SYTL4、TCF4、TGFB2、TIMP3、TMEM88、TNC、TNS1、TPM1、TSHZ3、TSPAN2、VEPH1、WNT2、WNT9A和ZEB1基因及与具有序列SEQ ID NO:1至13的探针特异性杂交的基因的表达水平，其中相对于所述基因的参照值所述基因增加的表达水平表明患者可能受益于手术治疗后的疗法，或其中相对于所述基因的参照值所述基因降低的表达水平表明患者不大可能受益于手术治疗后的疗法。
如本文所使用的术语“特异性杂交”是指允许两个多核苷酸序列在高度严格或中等严格条件下杂交的情况。表述“高度严格条件”和“中等严格条件”在下述关于本发明的试剂盒中定义且同样适用于本发明方法的内容中。
可通过测定由所述基因编码的mRNA水平或测定由所述基因编码的多肽水平测定在本发明的第二种个性化疗法中使用的不同基因的表达水平。
在第二步中，根据本发明的个性化疗法包括识别相对于所述基因的参照值所述基因的表达水平增加且可能受益于手术治疗后的疗法的患者，或识别相对于所述基因的参照值所述基因的表达水平降低且不大可能受益于手术治疗后的疗法的患者。
术语“受益”是指改善患者的疾病状态。有益的或期望的临床结果包括，但不限于，检测出及未检测出的症状缓解、患病时间缩短，稳定的病理状态(特别是没有恶化)、延缓疾病发展、改善病理状态、延长存活期(与不施用所述治疗的预计存活期相比)及缓解(部分及全部)。
在特定实施方案中，用于是或不是候选人的患者的手术治疗后的疗法选自由化疗、放疗和/或包括TGF-β抑制剂的疗法组成的组。
术语“手术”或“手术治疗”、“化疗”、“化疗药物”、“放疗”及“包括TGF-β抑制剂的疗法”已在上文中详细描述且同样适用于根据本发明方法的方法。
基于TGF-β2和TGF-β3的表达水平的个性化药物
在又一方面，本发明涉及一种选择对患者的结肠直肠癌合适的疗法的方法(下文中称为“本发明的第三种个性化治疗方法”)，其包括测定所述患者样品中TGF-β2和/或TGF-β3基因的表达水平，其中相对于所述基因的参照值所述基因增加的表达水平表明患者是接受手术治疗后辅助放疗或化疗的候选人，或其中相对于所述基因的参照值所述基因降低的表达水平表明患者不是接受手术治疗后辅助放疗或化疗的候选人。
术语“选择疗法”、“结肠直肠癌”、“样品”、“患者”、“TGF-β2”、“TGF-β3”、“增加的表达水平”、“辅助疗法”、“放疗”、“化疗”已在根据本发明的预后方法及个性化药物的内容中进行描述并同样适用于本发明的方法。
在优选的实施方案中，根据本发明的第三种个性化治疗方法用于确定患者是否是接受化疗或放疗的候选人。在又一实施方案中，所述化疗基于使用如上所述的TGF-β抑制剂。
在优选的实施方案中，根据本发明的第三种个性化治疗方法还包括确定患者的肿瘤阶段，其中高肿瘤阶段表明患者是接受手术治疗后辅助放疗或化疗的候选，或其中低肿瘤阶段表明患者复发的风险较低。
在又一实施方案中，根据本发明的第三种个性化治疗方法在结肠直肠癌为II期或III期结肠直肠肿瘤的患者中进行。
在又一实施方案中，通过测定所述基因的mRNA水平测定TGF-β2和/或TGF-β3基因的表达水平。在又一更优选实施方案中，通过RT-PCR测定 mRNA的水平。在另一实施方案中，通过测定所述基因编码的蛋白质水平测定TGF-β2和/或TGF-β3基因的表达水平。
在另一实施方案中，测定基因表达水平的样品选自由肿瘤活检或生物流体组成的组。在还一更优选实施方案中，其中所述样品是生物流体，然后所述生物流体选自由血液、血浆和血清组成的组。
在又一实施方案中，所述化疗基于TGF-β抑制剂。术语“TGF-β抑制剂”如上定义。
本发明的个性化疗法
以上定义的预后方法及个性化治疗方法还能够向罹患结肠直肠癌患者提供个性化疗法。特别是，被认为具有高复发风险的患者将最有可能受益于手术后的额外治疗。相反地，具有低复发风险的患者可能不需要手术后的额外治疗。
因此，在另一方面，本发明涉及一种用于治疗手术切除癌症后的患者的结肠直肠癌的疗法，其中所述患者通过本发明第一种、第二种或第三种个性化治疗方法选择。
在特定实施方案中，所述治疗选自由化疗、放疗和/或包括TGF-β抑制剂的疗法组成的组。
术语“疗法”、“治疗”、“结肠直肠癌”、“患者”、“放疗”、“手术”或“手术治疗”、“化疗”、“化疗药物”、“放疗”及“包括TGF-β抑制剂的疗法”已在上文中详细描述并同样适用于本发明的个性化疗法。
本发明的试剂盒
在另一实施方案中，本发明涉及一种试剂盒，其用于测定构成F-TBRS标签、源自F-TBRS的迷你标签的基因的表达水平或TGF-β2和/或TGF-β3的表达水平。因此，在优选的实施方案中，本发明的试剂盒包括足够测定NPR3/C5orf23、CDKN2B和FLT1基因的表达水平的试剂。
在另一实施方案中，本发明的试剂盒包括足够测定NPR3/C5orf23、 CDKN2B、FLT1基因及一个或多个选自由FRMD6、IGFBP3、ESM1、FGF1、GEM、MEX3B、WNT2、NGF、MSC、SETBP1、FLJ10357、DACT、MURC和Col10A1基因组成的组中的其他基因的表达水平的试剂。
在另一实施方案中，根据本发明的试剂盒包括足够测定CDKN2B、NPR3/C5orf23、FLT1、FRMD6、IGFBP3和ESM1基因的表达水平的试剂。
在另一实施方案中，根据本发明的试剂盒包括足够测定CDKN2B、NPR3/C5orf23、FLT1、FGF1、GEM和MEX3B基因的表达水平的试剂。
在另一实施方案中，根据本发明的试剂盒还包括足够测定一个或多个表1中所示基因的表达水平的试剂，所述基因在富集癌症相关的成纤维细胞(富集CAFs)的细胞群和EPCAM+之间差异表达且比所述第一细胞群增加至少2倍。
在另一实施方案中，所述试剂盒包括足够测定ANGPTL2、ANGPTL4、APBB2、BMPR2、BPGM、C13orf33、C5orf13、NPR3/C5orf23、CACHD1、CALD1、CDH6、CDKN2B、CILP、CNTN1、COL10A1、COL12A1、COL27A1、DACT1、DIXDC1、DNAJB5、DNAJC18、ELTD1、EPHA4、ESM1、FAP、FGD6、FGF1、FGF2、FLJ10357、FLT-1、FN1、FRMD4A、FRMD6、GAS1、GEM、GFPT2、GPR161、HAS2、HEY1、HIC1、HS3ST3A1、IGFBP3、IGFBP7、IL11、INHBA、KAL1、KIAA1755、KLF7、LARP6、LMCD1、LMO4、LOC100128178、LOC644242、LOC728264、LOH3CR2A、LRRC8A、MEOX1、MEX3B、MFAP2、MGC16121、MSC、MURC、NEDD9、NGF、NOX4、NPR2、NUAK1、OSGIN2、PALLD、PALM2、PDGFA、PDGFC、PDLIM4、PDPN、PGM2L1、PKNOX2、PMEPA1、PODXL、PPM1E、PTHLH、RASD1、RASGRP3、RASL12、RGS4、RNF150、RUNX1、S1PR5、SEMA6D、SERPINE1、SETBP1、SHISA2、SLC46A3、SNCAIP、SNORD114-3、SOX6、SPSB1、STK38L、SYNE1、SYTL4、TCF4、TGFB2、TIMP3、TMEM88、TNC、TNS1、TPM1、TSHZ3、TSPAN2、VEPH1、WNT2、WNT9A和ZEB1基因及与具 有序列SEQ ID NO:1至13的探针特异性杂交的基因的表达水平的试剂。
在又一实施方案中，本发明的试剂盒包括足够测定TGF-β2和/或TGF-β3基因的表达水平的试剂。
在优选的实施方案中，足够测定一个或多个基因的表达水平的试剂包括至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％的构成试剂盒的足够测定基因的表达水平的试剂的总量。因此，在特定情况下，包括测定NPR3/C5ORF23、CDKN2B和FLT1基因的表达水平的试剂的试剂盒中，对所述基因具有特异性的试剂(例如能够在严格条件下与NPR3/C5ORF23基因、CDKN2B和FLT1基因杂交的探针)包括至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％的存在于试剂盒中的探针。
在另一实施方案中，足够测定一个或多个基因的表达水平的试剂包括至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的构成试剂盒的试剂的总量。
在本发明的内容中，“试剂盒”理解为一种含有不同试剂的产品以能够运输和储存，所述试剂是实施本发明的方法所必须的。适合包装试剂盒组分的材料包括晶体、塑料(聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯等)、瓶子、小瓶、纸、信封等。此外，本发明的试剂盒可能含有同时、按顺序或独立地使用试剂盒中不同组分的说明书。所述说明书可以是印刷材料形式或能够储存的且可由使用者读取的电子载体形式，诸如电子储存媒介(磁盘、磁带等)，光学媒体(CD-ROM、DVD)等。此外或可选地，所述媒体可含有能够提供所述说明书的网址。
表述“能够测定基因表达水平的试剂”是指通过测定mRNA水平或通过测定蛋白质水平以测定基因表达水平的一个化合物或一组化合物。因此， 第一类型的试剂包括能够与所述基因编码的mRNAs特异性杂交的探针。第二类型的试剂包括与标记基因编码的蛋白质特异性结合的化合物，且优选地包括抗体，尽管其可以是特异性适体。
在本发明试剂盒的特定实施方案中，所述试剂盒的试剂是能够特异性检测上述基因的mRNA水平和/或一个或多个上述基因编码的蛋白质水平的核酸。能够与上述基因特异性杂交的核酸可以是一对或多对寡核苷酸引物，用于特异性扩增所述基因的mRNA(或其相应的cDNAs)片段。
在优选的实施方案中，本发明的试剂盒的第一组分包括能与上述基因特异性杂交的探针。
如本文所使用的术语“特异性杂交”是指允许两个多核苷酸在高度严格或中等严格条件下杂交的情况。
杂交反应的“严格性”是本领域技术人员容易测定的，且通常是根据探针长度、洗涤温度和盐浓度的经验计算。通常，较长探针需要适合退火的较高温度，而较短探针需要较低温度。杂交通常取决于当互补链存在于低于其解链温度的环境中时变性DNA重新退火的能力。所需的探针和杂交序列之间同源性越高，使用的相对温度越高。因此，较高的相对温度趋向于使反应条件更严格，而较低的温度趋向于使反应条件较不严格。杂交反应严格性的其他细节和解释可参见Ausubel等,Current Protocols in Molecular Biology,Wiley Interscience Publishers,(1995)。
如本文所定义的“严格条件”或“高度严格条件”，典型地为：(1)采用低离子强度和高温洗涤，例如50℃下0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠；(2)在杂交过程中使用变性剂，诸如甲酰胺，例如42℃下50％(v/v)甲酰胺与0.1％牛血清蛋白/0.1％聚蔗糖/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/pH为6.5的50mM磷酸钠缓冲液与750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠；或(3)42℃下使用50％甲酰胺、5xSSC(0.75M NaCl,0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸铵(pH6.8)、0.1％焦磷酸钠、5x登哈特溶液、超声处理的鲑鱼精 子DNA(50μg/ml)、0.1％SDS及10％硫酸葡聚糖，42℃下用0.2xSSC(氯化钠/柠檬酸钠)和50％甲酰胺洗涤，然后在55℃下使用由含有EDTA的0.1xSSC组成的高度严格洗液洗涤。
“中等严格条件”可如Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,New York:Cold Spring Harbor Press,1989所描述的识别，且包括使用不如上述条件严格的洗涤溶液和杂交条件(例如，温度、离子强度和SDS％)。中等严格条件的实例是37℃下在溶液中过夜培养，所述溶液含有20％甲酰胺、5xSSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸铵(pH7.6)、5x登哈特溶液、10％硫酸葡聚糖，及20mg/ml变性剪切鲑鱼精子DNA，然后在约37-50℃下用1xSSC洗涤过滤物。本领域技术人员将认识到如何调整温度、离子强度等，在必要时调节诸如探针长度等因素。
在几个本发明识别的基因的表达水平同时测定的情况下，包括所有基因的探针是有用的，所述基因的表达可在微阵列杂交中测定。
微阵列包括多个空间分布且稳定连接到载体(例如，生物芯片)的核酸。所述核酸序列与基因的特定序列互补，所述基因的表达将被检测，因此其能够与所述核酸杂交。在本发明的方法中，将含有大量核酸的微阵列与从本研究的患者分离的核酸制剂相接触。在适合杂交的条件下进行微阵列与核酸制剂的培养。随后，除去未保持在载体中的核酸后，检测杂交模式，其提供所分析样品的基因图谱信息。尽管所述微阵列能提供样品中存在的核酸的定性和定量信息，但本发明需要使用能够提供定量信息的阵列和方法。
本发明考虑了关于使用的探针类型和载体类型的各种阵列。阵列中包括的能够与核酸杂交的探针可以是保持杂交能力的核酸或其类似物，例如，其中磷酸二酯键被硫代磷酸酯、甲基亚胺、甲基磷酸酯、氨基磷酸酯、胍键等取代的核酸，其中核苷酸的核糖被其他己糖取代的核酸，肽核酸(PNA)等。探针的长度可以是5至50个核苷酸，优选，7、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、100个核苷酸且在10至100个核苷酸 范围内变化，优选地15至150个核苷酸的范围内，更优选地15至100个核苷酸的范围内，且可以是单链或双链核酸。所述阵列可以含有特定长度的特定mRNA的所有特异性探针或可以含有选自mRNA不同区域的探针。每个探针可使用有变化碱基的探针平行测定，优选地在探针的中心位置。将所述阵列与含有与所述阵列的探针互补的序列的核酸的样品相接触，并测定与每个探针及相应的杂交对照的杂交信号。在与探针及其杂交对照的杂交信号之间观察到较大差异的探针被选用。优化过程可包括第二轮优化，其中杂交序列与不含有与所述阵列的探针互补的序列的样品杂交。在第二轮选择后，那些杂交信号比阈值水平低的探针将被选择。因此，经过两次对照的探针，即与靶核酸的非特异性杂交水平最低且与靶核酸的特异性杂交水平最高的探针被选择。
选择对不同靶基因的特异性探针以使其能够与靶核酸特异性结合且最低程度与非相关基因杂交。然而，20个核苷酸的探针对于特定mRNA不是唯一的。因此，靶向所述序列的探针将与出现在非相关基因的mRNA中的相同序列交叉杂交。此外，也有探针在使用的条件下不能与靶基因特异性杂交(由于二级结构或与所述阵列的底物相互作用)。这种类型的探针不能包括在所述阵列中。因此，本领域的技术人员将观察到将要结合到特定阵列的探针在其结合到阵列前必须优化。探针的优化通常通过产生含有多个靶向特定靶多核苷酸不同区域的探针的阵列完成。该阵列首先与含有分离形式的靶核酸的样品接触，其次与核酸的复杂混合物接触。因此，与靶核酸高特异性杂交但与复杂样品低杂交或不杂交的探针被选择结合到本发明的阵列中。此外，可能包括在将研究的每个探针的阵列杂交对照中。在优选的实施方案中，杂交对照含有位于探针中心区域的可变位置。在所研究的探针及其杂交对照之间观察到高度杂交的情况下，所述探针不包括在阵列中。
本发明的微阵列不仅含有对表明确定的病理生理状况的多核苷酸的特异性探针，还含有一系列对照探针，其可以是三种类型：标准化对照、表达 水平对照和杂交对照。
标准化对照是与标记的参照序列完全互补的寡核苷酸，添加所述参照序列至待分析的核酸制剂中。源自杂交后标准化对照的信号提供了杂交条件、标记强度、检测效率及其他一系列因素的变化的指示，所述因素能导致不同微阵列之间杂交信号的变化。由阵列剩余探针检测到的信号优选地被对照探针发出的信号分开，因此标准化测量。实际上，任何探针都可用作标准化对照。然而，已知杂交效率根据核苷酸的组成及探针长度变化。因此，优选的标准化探针是代表阵列中存在的探针的平均长度，尽管其被选择为包括一定范围的长度，所述长度反映阵列中存在的探针的剩余部分。标准化探针可设计为能反映阵列中存在的探针剩余部分的核苷酸的平均组成。有限数量的标准化探针被优先选择以使其能够适当地杂交，即其不具有二级结构且其与阵列所使用的任何探针无序列相似性。标准化探针可位于阵列的任何位置或多个位置以有效地控制与阵列结构相关的杂交效率的变化。标准化对照优选地位于阵列一端和/或其中心。
表达对照水平是与分析的样品中组成型表达的基因特异性杂交的探针。表达水平对照被设计成对照细胞的生理状态和代谢活性。表达水平对照与靶核酸表达水平的协方差的检验表明表达水平的变化是否是由于表达水平的变化或细胞中整体转录速率的变化或其一般代谢活性的变化。因此，在细胞缺乏对于细胞存活所必需的特定代谢产物的情况下，预期观察到靶基因表达水平及对照表达水平的降低。另一方面，如果观察到靶基因及对照基因的表达增加，可能是由于细胞代谢活性的增加，而不是由于靶基因表达的特异增加。适合用作表达对照的探针对应于组成型表达的基因，诸如编码使用重要细胞功能的蛋白质的基因，所述蛋白质诸如β-2-微球蛋白、遍在蛋白、核糖体蛋白18S、亲环素A、转铁蛋白受体、肌动蛋白、GAPDH、酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶激活蛋白(YWHAZ)和β-肌动蛋白。
杂交对照可包括在针对靶基因的探针及针对表达水平或标准化对照的 探针中。错误对照是与针对靶基因的探针相同的寡核苷酸探针，但其含有一个或几个核苷酸突变，即其在特定位置含有核苷酸不与靶基因中对应的核苷酸杂交。选择杂交对照以使用合适的杂交条件，靶基因与特异性探针杂交但不与杂交对照杂交或具有降低的效率。杂交对照优选地含有在探针中心的一个或几个改性位置。因此杂交对照表明样品中核酸与探针的非特异性杂交或交叉杂交的程度，所述探针不同于含有完全互补序列的探针。
本发明的阵列还可以含有扩增及样品制剂对照，其是与选择的对照基因的子序列互补的探针，因为它们通常不会出现在本研究的生物样品中，诸如细菌基因的探针。向RNA样品补充已知量的与选择的对照探针杂交的核酸。测定与所述探针的杂交表明在制备过程中核酸的回收程度并估计在样品处理过程中核酸发生的变化。
一旦提供了一组显示合适特异性的探针和一组对照探针，将对照探针排列在阵列的已知位置，从而在杂交和检测步骤之后，有可能建立杂交的阳性信号与来自阵列坐标的特定基因之间的相关性，在所述阵列中检测到杂交的阳性信号。
微阵列可以是通过光刻原位合成方法具有成千上万个寡核苷酸的高密度阵列(Fodor等,1991,Science,767-773)。这种类型的探针通常是冗余的，即，它们包括将被检测的每个mRNA的几个探针。在优选的实施方案中，阵列是低密度阵列或每平方厘米含有少于10000个探针的LDA。在所述低密度阵列中，在固体载体(例如，晶体表面、膜)的不同位置借助移液管手动施加不同探针。用于固定探针的载体可由多种材料获得，所述材料包括塑料、陶瓷、金属、凝胶、膜、晶体等。微阵列可使用本领域技术人员已知的任何方法获得。
杂交后，在非杂交的核酸能够在检测步骤中发出信号的情况下，去除所述非杂交核酸的洗涤步骤是必需的。使用本领域技术人员已知的方法和溶液完成洗涤步骤。
在核酸标记不能被直接检测的情况下，可能将包括靶核酸的微阵列与具有其他体系组分的微阵列相结合，所述其他组分是引起反应产生可检测的信号所必需的。例如，如果靶核酸用生物素标记，在合适条件下将所述阵列与具有荧光试剂的共轭链霉亲和素接触以发生生物素与链霉亲和素的结合。在培养微阵列与体系产生的可检测信号后，有必要进行洗涤步骤以去除与阵列非特异性结合的所有分子。由本领域技术人员根据体系产生的可检测信号使用合适的条件确定洗涤条件，且其为本领域技术人员所熟知的。
获得的杂交模式可通过几种不同方法观察或检测，所述检测通过微阵列中使用的体系类型测定。因此，通过闪烁计数、放射自显影、荧光信号测定、量热测定、光信号检测等进行杂交模式的检测。
在杂交及可能的随后洗涤及处理过程后，检测并定量杂交模式，其中将对应于阵列中每个杂交点的信号与对应于已知数量的末端标记的核酸发出的信号的参照值相比较，因此获得每个在微阵列特定点杂交的核酸的拷贝数的绝对值。
在通过测定所述基因编码的多肽的水平测定根据本发明的基因表达水平的情况下，根据本发明的试剂盒包括能够与所述多肽特异性结合的试剂。因此，在一种实施方案中，本发明涉及包括特异性抗体的试剂盒，所述抗体特异于NPR3/C5orf23、CDKN2B和FLT1基因编码的多肽。
在另一实施方案中，本发明的试剂盒包括特异于NPR3/C5orf23、CDKN2B、FLT1基因及一个或多个其他多肽的抗体，所述其他多肽选自由FRMD6、IGFBP3、ESM1、FGF1、GEM、MEX3B、WNT2、NGF、MSC、SETBP1、FLJ10357、DACT、MURC和Col10A1基因编码的多肽组成的组。
在另一实施方案中，根据本发明的试剂盒包括特异于CDKN2B、NPR3/C5orf23、FLT1、FRMD6、IGFBP3和ESM1基因的抗体。
在另一实施方案中，根据本发明的试剂盒包括特异于CDKN2B、NPR3/C5orf23、FLT1、FGF1、GEM和MEX3B基因的抗体。
在另一实施方案中，根据本发明的试剂盒还包括特异于表1中所示的基因编码的多肽的抗体，所述基因在癌症相关的成纤维细胞(富集CAFs)富集的细胞群和EPCAM+差异表达且比所述第一细胞群增加至少2倍。
在另一实施方案中，根据本发明的试剂盒包括特异于下述基因编码的多肽的抗体，所述基因为ANGPTL2、ANGPTL4、APBB2、BMPR2、BPGM、C13orf33、C5orf13、NPR3/C5orf23、CACHD1、CALD1、CDH6、CDKN2B、CILP、CNTN1、COL10A1、COL12A1、COL27A1、DACT1、DIXDC1、DNAJB5、DNAJC18、ELTD1、EPHA4、ESM1、FAP、FGD6、FGF1、FGF2、FLJ10357、FLT-1、FN1、FRMD4A、FRMD6、GAS1、GEM、GFPT2、GPR161、HAS2、HEY1、HIC1、HS3ST3A1、IGFBP3、IGFBP7、IL11、INHBA、KAL1、KIAA1755、KLF7、LARP6、LMCD1、LMO4、LOC100128178、LOC644242、LOC728264、LOH3CR2A、LRRC8A、MEOX1、MEX3B、MFAP2、MGC16121、MSC、MURC、NEDD9、NGF、NOX4、NPR2、NUAK1、OSGIN2、PALLD、PALM2、PDGFA、PDGFC、PDLIM4、PDPN、PGM2L1、PKNOX2、PMEPA1、PODXL、PPM1E、PTHLH、RASD1、RASGRP3、RASL12、RGS4、RNF150、RUNX1、S1PR5、SEMA6D、SERPINE1、SETBP1、SHISA2、SLC46A3、SNCAIP、SNORD114-3、SOX6、SPSB1、STK38L、SYNE1、SYTL4、TCF4、TGFB2、TIMP3、TMEM88、TNC、TNS1、TPM1、TSHZ3、TSPAN2、VEPH1、WNT2、WNT9A和ZEB1基因及与具有序列SEQ ID NO:1至13的探针特异性杂交的基因。
在还一实施方案中，本发明的试剂盒包括特异于TGF-β2和/或TGF-β3基因的抗体。
为了这个目的，诸如De Wildt等(2000)Nat.Biotechnol.18:989-994；Lueking等(1999)Anal.Biochem.270:103-111；Ge等(2000)Nucleic Acids Res.28,e3,I-VII；MacBeath和Schreiber(2000)Science289:1760-1763；WO01/40803和WO99/51773A1所描述的抗体的阵列是有用的。所述阵列的抗 体包括任何能够与配体高亲和力结合的免疫剂，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE，及与抗体相似具有抗原结合位点的分子，诸如Fab'、Fab、F(ab')2、单结构域抗体或DABS、Fv、scFv等。制备所述抗体的技术是本领域技术人员所熟知的且包括Ausubel等(Current Protocols in Molecular Biology,eds.Ausubel等,John Wiley&Sons(1992))描述的方法。
所述阵列的抗体可快捷应用，例如，使用市售的机器人系统(例如，由Genetic Microsystems或Biorobotics所生产的)。所述阵列的基质可以是硝化纤维、塑料、晶体或多孔材料，例如丙烯酰胺、琼脂糖或其它聚合物。在另一实施方案中，可能通过在阵列过滤器中培养使用产生检测本发明的蛋白质的特异性抗体的细胞。在诱导抗体表达后，后者被固定在阵列位置中的过滤器上，其为所述产生的细胞的位置。可以将抗体阵列与标记的靶标相接触且可以测定靶标与固定化抗体的结合水平。如果靶标是未标记的，可以使用夹层试验，其中使用特异于多肽的第二标记的抗体，所述多肽与固定在载体的多肽相结合。在所述阵列每个点的样品中存在的多肽的数量的量化可作为表达图谱储存在数据库中。抗体的阵列可一式两份，且可用于比较两个不同样品的结合图谱。
在另一方面，本发明涉及本发明的试剂盒用于预测结肠直肠癌患者的结果或确定结肠直肠癌患者是否是手术后化疗或放疗的候选人的应用。在优选的实施方案中，根据本发明的试剂盒在II期或III期CRC患者中使用。
本发明的其他方面
[1]一种用于预测罹患结肠直肠癌患者的结果的方法，用于对结肠直肠癌患者选择合适的治疗或选择可能受益于结肠直肠癌手术切除后的辅助疗法的患者，所述方法包括测定所述患者的样本中的TGF-β2和/或TGF-β3基因的表达水平，
其中相对于所述基因的参照值所述基因增加的表达水平表明患者消极结果的可能性增加，即所述患者是接受手术治疗后辅助疗法的候选人或所述 患者可能受益于手术治疗后的辅助疗法，
其中相对于每个基因的参照值所述基因降低的表达水平表明患者积极结果的可能性增加，或者说所述患者不是接受手术治疗后辅助疗法的候选人或所述患者不大可能受益于手术治疗后的辅助疗法。
[2]根据方面[1]所述的方法，其中患者的肿瘤阶段是额外确定的，并且
其中高肿瘤阶段表明消极结果的可能性增加，即所述患者是接受手术治疗后辅助治疗的候选人或所述患者可能受益于手术治疗后的疗法，
其中低肿瘤阶段患者表明积极结果的可能性增加，即患者不是接受手术治疗后辅助治疗的候选人，或者所述患者不大可能受益于手术治疗后的疗法。
[3]根据方面[1]或[2]所述的方法，其中所述疗法选自由化疗、放疗和/或包括TGF-β抑制剂的疗法的组。
[4]根据方面[1]至[3]任一方面所述的方法，其中所述样本选自由肿瘤活检或生物流体组成的组。
[5]根据方面[1]所述的方法，其中所述生物流体选自由血液、血浆和血清组成的组。
[6]一种试剂盒，包含足够用于测定TGF-β2和/或TGF-β3基因的表达水平的试剂，及任选地，用于测定一种或多种持家基因的表达水平的试剂。
[7]根据方面[6]的试剂盒的应用，其用于预测结肠直肠癌患者的结果，用于对结肠直肠癌患者选择合适的治疗或选择可能受益于结肠直肠癌手术切除后的辅助疗法的患者。
下文中本发明将通过以下具体实施例来进行详细描述，其仅用于示例性说明，而不以任何方式限制本发明的范围。
具体实施例
材料和方法
临床材料
人类组织样本获自海地(del Mar)医院病理科，并获得了根据道德管理肿瘤库协会的认可。本研究遵循赫尔辛基宣言的指导方针并且在这项研究的背景下病理标本的病人的身份保持匿名。人类结肠正常的成纤维细胞(CCD-18Co)获得自ATCC，并在实验之前进行小于10代的传代培养。
根据p-Smad3染色的肿瘤样本的分类
定期在海地医院收集的腺瘤(n＝25)和CRC(n＝30)样本用抗-p-SMAD3抗体染色。根据整体的p-SMAD3密度或在肿瘤相关基质中的染色定性分类样本，并由专家病理学家(M.I.)进行上皮癌细胞。平均染色水平被总结归为三类：高、中和低。对于肿瘤相关的基质，考虑了所有细胞类型。
肿瘤聚集和染色
来自海地医院(西班牙巴塞罗那)治疗的CRC患者(n＝8)的刚刚获得的肿瘤用无菌刀片切碎，并在37℃下，在50％DMEM/50％F12(均来自Gibco)的培养基中旋转培养15～20分钟，该培养基含有100X青霉素/链霉素(Gibco)；0.1％透明质酸酶和0.1％胶原酶1A(均来自Sigma)。然后将切片用移液管均化，并通过连续的18G和21G针头。通过添加10％FBS终止酶反应，通过连续滤过100μm→70μm→40μm(BD Falcon)的细胞筛收集单细胞。离心细胞，悬浮于5ml氯化铵(0.15M；Sigma Aldrich)中，并在室温下培养5分钟以使红细胞裂解。用HBSS(Lonza)洗涤两次后，细胞在1ml封闭液中培养5分钟：染色缓冲液(SB)(HBSS+5％FBS)；1％BSA；5％的小鼠血清。然后细胞在具有抗-hEpcam/TROP1-APC共轭抗体的SB(30分钟；1/50；R&D系统)和抗-CD45-PE共轭的抗体(20分钟；1/10；Miltenyi Biotec)中染色。用碘化丙啶标记死亡的细胞。
使用荧光激活细胞分选(FACS)分离细胞。使用RNeasy试剂盒(Qiagen)提取RNA。通过IRB转录组核心设施，使用标准方法进行标记并将试样与HG-U133A2.0基因表达芯片(Affymetrix)杂交。使用Partek软件进行数据分析。
制备F-TBRS基因表达标签
CCD-18Co成纤维细胞以60％汇合(confluence)播种，并用TGFB1(Peprotech；5ng/ml)处理8小时。使用HG-U133和2.0Affimetrix阵列测定基因表达曲线，并通过RMA标准化。制备第一标签，被包含的基因在用TGF-β处理成纤维细胞的重复试验中上调至少2倍(p<0.05)。该列表通过来自CRC患者纯化的细胞群的表达曲线而进一步细化：[CD45(+)，Epcam(-)；白细胞部分]，[CD45(-)Epcam(+)；上皮细胞部分]和[CD45(-)Epcam(-)；富集CAF的部分]。在富集CAF的部分中F-TBRS对应于基因上调(>2倍,p<0.05)，相比于其他两个细胞群。通过中等t检验获得倍数变化富集的所有p值。
数据组
对应于人类结肠腺瘤和结肠癌的数据组已经在之前有所描述(Sabates-Bellver等,2007；Mol.Cancer Res.,5,1263-1275；van der Flier等,2007；Gastroenterology,132,628-632)。为了使F-TBRS表达与临床疾病进展相互关联，我们合并了两组Affymetrix转录曲线(GSE17537和GSE14333)，其在基因表达数据库www.ncbi.nlm.nih.gov/geo获得，相应于获得的主要的用于临床反馈的CRC。GSE1753729由55位在范德比尔特大学医学中心(Vanderbilt,USA)治疗的结肠癌患者组成。GSE1433330含有在两个不同医院(彼得·麦卡勒姆癌症中心(澳大利亚)和H.Lee Moffitt癌症中心(美国))治疗的290位CRC患者组成的库。GSE17537和GSE14333数据组可用的注释的临床数据，包括AJCC分期、年龄、性别和无病生存时间间隔。在这些组群中，在不同AJCC分期的肿瘤样本的代表遵循接受在上述医院中的标准治疗的CRC患者的自然分布。为了消除数据组之间的系统偏差，所有基因的表达水平都在汇集之前转化为Z分数。
为了在硅片中有效研究，使用了两个额外的组群，数据组GSE33113和GSE37892。GSE33113含有一组90位AJCC II期CRC患者的材料，其收集 自荷兰阿姆斯特丹的学术医学中心(AMC)。来自这些患者的多方面的医疗记录被保留，并且绝大多数的患者的长期临床反馈是可以获取的。GSE37892中的组群含有一系列130个结肠癌样本，其中他们是II期和III期的CRC患者。
F-TBRS和临床结果的关联
为了使F-TBRS与无病生存率相关联，我们没有考虑IV期CRC，因为在这些病例中的复发通常与不完全的手术切除转移部位肿瘤相关。我们使用基因组富集分析(GSEA)以评估我们的标签与相关变量之间的相关度。GSEA是基于根据基因对于疾病复发的危险比(通过Cox模型评估)及根据其余变量的倍数变化进行的基因分级。GSEA的输出是富集分数(ES)，标准化的富集分数(NES)，其表明待测试基因组的大小，P值和预计的错误发现率(FDR)。ES、NES和FDR如Subramanian等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,2005,102:15545-15550)所提出的建议那样获得。对于每个标签使用10,000个排列计算P值，并用Benjamini-Yekutieli方法进行调整(Behav.Brain Res.,2001,125,279-284)。为了评估标签对于复发的预测能力，我们计算了平均标签表达并测试了其关于单变量Cox比例风险模型似然比检验的重要性。通过获得的对于每个基因的Z分数计算平均标签表达，并且在标签中求所有基因的Z分数平均值。患者根据其平均F-TBRS表达分为三组：F-TBRS低(表达<M-SD),F-TBRS中(表达>M-SD and<M)和F-TBRS高(表达>M)，其中M是所有患者的平均值，SD是标准偏差。我们获得了对于低、中和高平均标签分数的患者的Kaplan-Meier存活曲线。多变量Cox模型还包括年龄、性别和AJCC分期。非显著变量从模型中以循序渐进的方式被丢弃，直到所有的变量在统计上是显著的。统计学上的显著性定义在0.05水平。在所有Cox模型中的P值基于似然比检验。
基于SCAD的逻辑回归模型拟合(Fan&Li,1999,Journal of the American Statistical Association,1999,96,1348-1360)预测复发事件，其基于患者年龄、 性别、分期和基因表达，并选择非零系数估计变量。SCAD惩罚参数通过10倍交叉验证设置，如在R程序包ncvreg中所进行的。我们对于II期、III期进行了这项分析，也对所有患者进行，其提供了一些短期和长期预测基因标签。
为了进一步评估每个基因标签和无疾病存活率之间的关联，计算了平均标签表达(即，在标签中的所有基因)并匹配多变量Cox比例风险模型，其包括分期作为调整变量。为了使结果可视化，我们将患者根据其平均标签表达进行分级，并获得了Kaplan-Meier曲线，使用四次惩罚样条作为光滑函数评估对于风险比例的影响(Eilers等,1996,Statistical Science,11,89-121)，如在R程序包pspline所进行的。
免疫组织化学
使用抗磷酸化-SMAD3(Rockland)的第一抗体在石蜡切片上进行免疫组织化学。简言之，切片在用抗磷酸化-smad3(1/100)培养之前，在pH值是6的柠檬酸缓冲液中高压灭菌10分钟。第二生物素抗体(Vector Laboratories Inc)以1:200稀释使用，并使用Vectastain ABC试剂盒(Vector Laboratories Inc)检测，如供应商所推荐的。
实施例1
CRC进展期间的TGF-β信号转导
研究了CRC进展期间的TGF-β信号转导。结肠癌样本的基因表达谱证实了在CRC的子组中，TGFB1、TGFB2和TGFB的mRNA升高的水平，而所有腺瘤显示了低水平的三种TGF-β同工型(图1)。腺瘤-CRC转化的特征包括增加的促结缔组织增生性反应，炎症和新血管形成，这些所有都涉及几种非癌细胞类型，其存在于肿瘤基质内。
为了研究TGF-β同工型的细胞类型特异性表达，对特定的由初级CRC纯化的肿瘤细胞群进行绘制(n＝8个患者)。标记基因表达的分析表明EPCAM+细胞群大量地富集在上皮癌细胞中，EpCAM-/CD45+细胞群富集在 白细胞中，并且EPCAM-/CD45-细胞群富集在癌症相关的成纤维细胞(CAFs)中(数据未示出)。在非上皮细胞中(CD45+和CD45-)TGFB1表达水平高，而升高的TGFB2和TGFB3mRNA水平仅存在于富集的CAF的细胞群中(图2)。
为了鉴定腺瘤和CRC中TGF-β靶向的细胞群，使用磷酸化的SMAD3(p-SMAD3)作为TGF-β通路激活的标志物。临床资料上的免疫组织化学分析揭示了上皮癌细胞中的显著的核p-SMAD3积累在腺瘤中有40％，而在CRC中仅有7％(图3)。该发现可能反映出在CRC进展期间，在TGF-β信号转导途径组分中失活的突变的频繁发生。另外，上皮p-SMAD3+CRC细胞可具有被损坏的TGF-β转录反应，由于在SMAD4中的基因改变(Liu等,1997,Genes dev.,11:3157-3167及Alarcon,C.,2009,Cell,139:757-769)。与CRC中的上皮TGF-β信号丢失同时发生的是，肿瘤基质细胞示出了高水平的p-SMAD3(图3)。而大多数腺瘤的基质含有很少的p-SMAD3高度阳性细胞，并且整体染色弱，大部分CRCs(63％)的特征在于基质细胞丰富，并具有强的核p-SMAD3染色。总之，这些观察到的结果表明结肠肿瘤的亚组经历了TGF-β在腺瘤-癌转变之间的表达增加，并且肿瘤基质组分是该增加主要的贡献者。在CRC中TGF-β升高的水平优先地靶向肿瘤相关的基质细胞而不是癌细胞。
实施例2
能够预测CRC结果的成纤维细胞特异性TGF-β应答标签的鉴定
如实施例1所示，p-SMAD3积累在不同肿瘤基质相关的细胞(包括淋巴细胞和内皮细胞)的核中。然而，CRC中的大多数常见基质p-SMAD3+细胞类型表现出薄且细长的形状，具有成纤维细胞的大量膜延伸特性。癌症相关的成纤维细胞(CAFs)是反应性肿瘤基质的最丰富的细胞群，并且它们参与几种癌症类型的肿瘤生长、侵润和转移。为了研究在CRC中TGF-β-刺激的成纤维细胞的作用，在这些细胞中首选被鉴定出由TGF-β调控的基 因组。在存在或不存在TGF-β的条件下培养正常的结肠成纤维细胞(CCD-18Co)，并使用微阵列评估整体基因表达谱。在这些细胞中TGF-β信号上调280个基因的表达水平(391个探针；>2倍，p<0.05)。使用在实施例1中描述的纯化的肿瘤细胞群评估该基因组的细胞类型特异性。由于在CCD-18Co成纤维细胞中由TGF-β诱导的391个探针，有127个基因(通过175个探针检测)在富集CAF的细胞群中是差异上调的(图4；表1)。这些175个探针(127个基因)被称为成纤维特异性TGF-β应答标签(F-TBRS)。显然，相比于腺瘤，F-TBRS在CRC中高度表达(数据未示出)。这一观察结果与CRC进展期间，TGFB1、2和3升高的水平以及p-SMAD3+CAF升高的丰度相一致(图1)。
表1：在TGF-β刺激的结肠成纤维细胞中基因的差异性调控列表，其中“CCD+对比CCD-倍数变化”是指在TGF-β刺激的CAF和正常结肠成纤维细胞之间的基因表达水平的倍数变化，并且其中“CD45-/Epcam-对比CD45+和Epcam+倍数变化”是指在TGF-β刺激的CAF和在Epcam+(上皮)细胞及Epcam-Cd45+细胞(白细胞)中的平均基因表达之间的基因表达的倍数变化。NA：不注明。









上述数据表明腺瘤到CRC的转化与CAF中TGF-β-驱使的转录进程的发生一致。接着研究CRC中的基质TGF-β信号的不同程度是否与临床疾病进展相关。调查了在三家不同的医院治疗的340个CRC病例的代表性的汇集阵列，从这些病例中公众可以获得的原发性肿瘤的转录情况和临床反馈结果(参见方法)。基因组富集分析(GSEA)揭示了F-TBRS与两个最主要的临床进展参数高度相关：诊断时的转移性传播(结合的AJCC III+IV期对比I+II期；FDR<10^-6)和最终癌症复发(FDR<10^-6)(数据未示出)。这些数据暗示从CRC的早期阶段过渡到晚期的特征在于在CAF中高水平的TGF-β-诱导的基因。
为了进一步探索在CAF中的TGF-β信号转导和肿瘤复发之间的联系，根据F-TBRS基因的平均表达的低、中或高，将CRC患者队列分为三组(图6)。在三组之间观察到较大差异的癌症复发的相对风险。在随访的10年期间，55％的具有F-TBRS高阳性原发性肿瘤的CRC患者经历肿瘤复发，而所有的具有F-TBRS低肿瘤的患者仍然无病(图6)。
大约20-30％的II期及30-50％的III期的进行目的性治疗疗法的CRC患 者癌症复发，通常以远转移的形式。F-TBRS水平与II期和III期患者的复发高度烈相关，并且鉴定出两组(低F-TBRS水平)中的一小组患者(10％)没有观察到复发(图7)。值得注意的是，甚至在I期CRC中很少发生复发(在该组中，45位患者2人复发)与成纤维细胞特异的TGF-β驱使的基因的高水平表达相关。Cox比例风险多变量分析(表2)示出了F-TBRS表达是癌症复发的独立预测因子，其对CRC患者仍然治疗后无病的识别超过AJCC分期系统。
表2：使用Cox比例风险模型的多变量分析来评估F-TBRS的依赖性和在癌症复发的预后中AJCC分期