说明书一类双位点抑制乙酰胆碱酯酶活性的氮杂吖啶氨衍生物、制备方法及其应用
技术领域
本发明具体涉及了一类双位点抑制乙酰胆碱酯酶活性的氮杂吖啶氨衍生物，同时还涉及该氮杂吖啶氨衍生物的制备方法及其应用，属于制药技术领域。
背景技术
乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)是中枢神经系统重要的神经递质之一，广泛存在于脑组织中，在学习记忆中起重要作用。胆碱能功能缺失假说认为阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease，AD)患者脑内ACh的缺失是导致阿尔茨海默氏病的主要原因。因此，提高乙酰胆碱水平对阿尔海默茨患者具有重要意义。研究表明，通过抑制乙酰胆碱酶可提高阿尔海默茨病患者脑内的乙酰胆碱水平，因此，乙酰胆碱酯酶抑制剂可用于治疗阿尔茨海默氏病。乙酰胆碱酯酶有两个主要的活性位点，即催化活化位点(CAS)和外周阴离子位点(PAS)。CAS位点能催化水解ACh的乙酰基。PAS通过静电作用与小分子抑制剂结合，使其更容易进入到催化活性口袋中。他克林(tacrine)(四氢氨基吖啶，THA是中枢神经系统的强抗乙酰胆碱酶药，于1993年获美国FDA批准，用于治疗轻-中度AD，但由于存在严重的肝脏毒性，国内早已停用。因此开发一种能够有效作用于CAS和PAS，且细胞毒性小的乙酰胆碱酶的双位点抑制剂具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一类双位点抑制乙酰胆碱酯酶活性的氮杂吖啶氨衍生物、制备方法及其应用，该氮杂吖啶氨衍生物能够有效抑制乙酰胆碱酯酶的活性。
本发明所采用的技术方案在于提供一类双位点抑制乙酰胆碱酯酶活性的氮杂吖啶氨衍生物，所述氮杂吖啶氨衍生物的结构式如下所示：
其中，n＝1或2。
本发明的技术方案还在于提供一种双位点抑制乙酰胆碱酯酶活性的氮杂吖啶氨衍生物的制备方法，包括以下步骤：
(1)中间体化合物1的制备
将N-苄基-4-哌啶酮3-4mL和三氯氧磷18-23mL混合，搅拌均匀，加入邻氨基苯甲酸2.6-3.5g，搅拌回流1.5-2.5h，停止加热，冷却至室温后，冰浴条件下加入氨水调节pH值至8-9，生成黄色沉淀，抽滤，得黄色沉淀，最后用体积比石油醚：丙酮＝12:1的体系过柱分离，丙酮重结晶，得到淡黄色晶体，即中间体化合物1；
(2)中间体化合物2的制备
将中间体化合物1 0.8-1.0g加入二氯甲烷18-23mL中，冰浴搅拌8-12min后，加入氯乙基氯甲酸酯1.2-1.5mL，搅拌13-18min，在室温下反应0.8-1.2h后，将二氯甲烷蒸干，加入甲醇18-22mL，搅拌回流1.5-2.5h，再将甲醇蒸干，加入0.8-1.2mol/L的KOH水溶液20-30mL，搅拌8-12min，用二氯甲烷进行萃取，收集有机层，用无水硫酸钠进行干燥，过滤，减压蒸馏，用体积比二氯甲烷：甲醇＝50:1和30:1的体系过柱分离，得到浅黄色固体，即中间体化合物2；
(3)中间体化合物3的制备
将中间体化合物2 0.4-0.6g、碳酸钾1.3-1.8g加入乙腈18-22mL中，在40-50℃条件下搅拌12-20min，加入N-(3-溴丙基)邻苯二甲酰亚胺或N-(4-溴丁基)邻苯二甲酰亚胺0.8-1.2g，在40-50℃条件下反应8-10h；反应结束后，将乙腈减压蒸出，加入质量分数10％的碳酸钠水溶液25-35mL，用二氯甲烷进行萃取，收集有机层，用无水硫酸钠进行干燥，过滤，减压蒸馏，用体积比石油醚：丙酮＝10:1的体系过柱分离，得到黄色固体，即为中间体化合物3；
(4)氮杂吖啶氨衍生物的制备
(a)中间体化合物3 1.5-1.6g溶解于甲醇40-45mL中，加入碳酸钾6.13-6.2g和盐酸羟胺1.54-1.6g，在60-65℃条件下反应10-11h，停止加热，冷却至室温，过滤，收集滤液，将甲醇减压蒸干，用体积比二氯甲烷：甲醇：氨水＝15:1:0.3的体系过柱分离，得到黄色油状液体，即中间体化合物4；
将中间体化合物4 1.5-1.6g溶解于甲醇25-30mL中，加入Pd/C催化剂0.3-0.4g，然后将体系内抽真空，并通入氢气，室温反应过夜；停止反应，过滤，收集滤液，加压蒸干，用体积比二氯甲烷：甲醇：氨水＝15:1:0.3的体系过柱分离，得到黄色油状液体，即为结构式Ⅰ的氮杂吖啶氨衍生物；
(b)将中间体化合物3 1.0-1.1g、水合肼1.43-1.5g加入二氯甲烷和乙醇体积比1-1.1:1的混合溶液20-22mL中，反应过夜，生成白色沉淀，然后将反应液减压蒸馏，剩余物用水溶解，二氯甲烷萃取，收集有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏，用体积比二氯甲烷：甲醇：氨水＝20:1:0.3的体系过柱分离，得到黄色油状液体，即中间体化合物5；
将中间体化合物5 0.4-0.5g溶解于乙腈40-45mL中，加入碳酸钾0.8-0.9g、碘化钾0.1-0.15g，搅拌10-13min，加入溴乙烷0.47-0.5g，在45-48℃条件下反应4-5h，补加溴乙烷至溴乙烷 为0.47-0.5g，继续反应4-5h；停止反应，将乙腈减压蒸干，加入水25-30mL，用二氯甲烷进行萃取，收集有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏，用体积比二氯甲烷：甲醇：氨水＝20:1:0.3的体系过柱分离，得到黄色油状液体，即中间体化合物6；
将中间体化合物6 0.2-0.25g溶解于甲醇40-50mL中，加入碳酸钾1.0-1.2g、盐酸羟胺0.25-0.3g，在60-65℃条件下反应8-10h，停止加热，冷却至室温后过滤，收集滤液并将甲醇减压蒸干，用体积比二氯甲烷：甲醇：氨水＝15:1:0.3的体系过柱分离，得到黄色油状液体，即中间体化合物7；
将中间体化合物7 0.2-0.3g溶解于甲醇25-30mL中，加入Pd/C催化剂0.3-0.4g，然后将体系内抽真空，并通入氢气，室温反应过夜；停止反应，过滤，收集滤液，加压蒸干，用体积比二氯甲烷：甲醇：氨水＝15:1:0.3的体系过柱分离，得到黄色油状液体，即为结构式Ⅱ的氮杂吖啶氨衍生物。
本发明的氮杂吖啶氨衍生物(结构式Ⅰ)合成路线：
本发明的氮杂吖啶氨衍生物(结构式Ⅱ)合成路线：
本发明的技术方案还在于提供一种氮杂吖啶氨衍生物在制备乙酰胆碱酯酶的双位点抑制剂方面的应用。
本发明的氮杂吖啶氨衍生物能够同时作用于催化活化位点(CAS)和外周阴离子位点(PAS)，有效抑制乙酰胆碱酯酶活性，且细胞毒作用小，这为阿尔海默茨病治疗药物的研发奠定了理论基础，也为治疗阿尔海默茨病提供了新的解决途径。实验表明，本发明氮杂吖啶氨衍生物对乙酰胆碱酯酶活性的抑制率最高可达93.19％。同时，本发明的原料来源易得，成本低，可用于规模化生产。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1
本实施例双位点抑制乙酰胆碱酯酶活性的氮杂吖啶氨衍生物的结构式如下：
本实施例双位点抑制乙酰胆碱酯酶活性的氮杂吖啶氨衍生物的的制备方法，包括以下步骤：
(1)中间体化合物1的制备
将N-苄基-4-哌啶酮3.5mL和三氯氧磷20mL混合，搅拌均匀，加入邻氨基苯甲酸3g，搅拌回流2h，停止加热，冷却至室温后，冰浴条件下加入氨水调节pH值至8，生成黄色沉淀，抽滤，得黄色沉淀，最后用体积比石油醚：丙酮＝12:1的体系过柱分离，丙酮重结晶，得到淡黄色晶体，即中间体化合物1；
(2)中间体化合物2的制备
将中间体化合物1 0.9g加入二氯甲烷20mL中，冰浴搅拌10min后，加入氯乙基氯甲酸酯1.3mL，搅拌15min，在室温下反应1h后，将二氯甲烷蒸干，加入甲醇20mL，搅拌回流2h，再将甲醇蒸干，加入1mol/L的KOH水溶液25mL，搅拌10min，用二氯甲烷进行萃取，收集有机层，用无水硫酸钠进行干燥，过滤，减压蒸馏，用体积比二氯甲烷：甲醇＝50:1和30:1的体系过柱分离，得到浅黄色固体，即中间体化合物2；
(3)中间体化合物3的制备
将中间体化合物2 0.5g、碳酸钾1.5g加入乙腈20mL中，在45℃条件下搅拌15min，加入N-(3-溴丙基)邻苯二甲酰亚胺1g，在45℃条件下反应9h；反应结束后，将乙腈减压蒸出，加入质量分数10％的碳酸钠水溶液30mL，用二氯甲烷进行萃取，收集有机层，用无水硫酸钠进行干燥，过滤，减压蒸馏，用体积比石油醚：丙酮＝10:1的体系过柱分离，得到黄色固体，即为中间体化合物3；
(4)氮杂吖啶氨衍生物的制备
中间体化合物3 1.5g溶解于甲醇40mL中，加入碳酸钾6.13g和盐酸羟胺1.54g，在60℃条件下反应10h，停止加热，冷却至室温，过滤，收集滤液，将甲醇减压蒸干，用体积比二氯甲烷：甲醇：氨水＝15:1:0.3的体系过柱分离，得到黄色油状液体，即中间体化合物4；
将中间体化合物4 1.5g溶解于甲醇25mL中，加入Pd/C催化剂0.3g，然后将体系内抽真空，并通入氢气，室温反应过夜；停止反应，过滤，收集滤液，加压蒸干，用体积比二氯甲烷：甲醇：氨水＝15:1:0.3的体系过柱分离，得到黄色油状液体，即为氮杂吖啶氨衍生物。
中间体化合物1 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.11(d,J＝8.4Hz,1H),7.98(d,J＝8.4Hz,1H),7.65(t,J＝7.7Hz,1H),7.51(t,J＝7.6Hz,1H),7.43–7.33(m,4H),7.29(t,J＝7.1Hz,1H),3.88(s,2H),3.78(s,2H),3.22(t,J＝5.9Hz,2H),2.86(t,J＝5.9Hz,2H)。
中间体化合物2 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.14(d,J＝8.4Hz,1H),7.97(d,J＝8.4Hz,1H),7.67(t,J＝7.7Hz,1H),7.54(t,J＝7.6Hz,1H),4.22(s,2H),3.26(t,J＝5.9Hz,2H),3.12(t,J＝5.9Hz,2H)。
中间体化合物3 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.08(d,J＝8.4Hz,1H),7.90(d,J＝8.3Hz,1H),7.66–7.61(m,3H),7.54–7.48(m,1H),7.36(dt,J＝6.8,3.4Hz,2H),3.83(t,J＝6.7Hz,2H),3.71(s,2H),3.06(t,J＝6.0Hz,2H),2.79(t,J＝6.0Hz,2H),2.70(t,J＝6.6Hz,2H),2.00(p,J＝6.6Hz,2H)。
中间体化合物4 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.00(d,J＝8.4Hz,1H),7.87(d,J＝8.4Hz,1H),7.64–7.57(m,1H),7.45(t,J＝7.6Hz,1H),3.73(s,2H),3.12(t,J＝5.8Hz,2H),3.00(t,J＝6.4Hz,2H),2.78(t,J＝5.9Hz,2H),2.66(t,J＝6.2Hz,2H),1.92–1.81(m,2H)。
氮杂吖啶氨衍生物1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.12(d,J＝7.9Hz,1H),7.96(d,J＝8.4Hz,1H),7.65(t,J＝7.6Hz,1H),7.52(t,J＝7.1Hz,1H),3.84(s,2H),3.23(dd,J＝13.7,7.9Hz,2H),2.84(dt,J＝13.7,6.3Hz,4H),2.67(dd,J＝15.6,8.6Hz,2H),1.84–1.74(m,2H)。
实施例2
本实施例双位点抑制乙酰胆碱酯酶活性的氮杂吖啶氨衍生物的结构式如下：
本实施例双位点抑制乙酰胆碱酯酶活性的氮杂吖啶氨衍生物的制备方法，包括以下步骤：
(1)中间体化合物1的制备
将N-苄基-4-哌啶酮3mL和三氯氧磷18mL混合，搅拌均匀，加入邻氨基苯甲酸2.6g，搅拌回流2.5h，停止加热，冷却至室温后，冰浴条件下加入氨水调节pH值至9，生成黄色沉淀，抽滤，得黄色沉淀，最后用体积比石油醚：丙酮＝12:1的体系过柱分离，丙酮重结晶，得到淡黄色晶体，即中间体化合物1；
(2)中间体化合物2的制备
将中间体化合物1 1.0g加入二氯甲烷18mL中，冰浴搅拌8min后，加入氯乙基氯甲酸酯1.5mL，搅拌13min，在室温下反应0.8h后，将二氯甲烷蒸干，加入甲醇18mL，搅拌回流2.5h，再将甲醇蒸干，加入0.8mol/L的KOH水溶液20mL，搅拌8min，用二氯甲烷进行萃取，收集有机层，用无水硫酸钠进行干燥，过滤，减压蒸馏，用体积比二氯甲烷：甲醇＝50:1和30:1的体系过柱分离，得到浅黄色固体，即中间体化合物2；
(3)中间体化合物3的制备
将中间体化合物2 0.4g、碳酸钾1.3g加入乙腈18mL中，在50℃条件下搅拌12min，加入N-(4-溴丁基)邻苯二甲酰亚胺0.8g，在50℃条件下反应8h；反应结束后，将乙腈减压蒸出，加入质量分数10％的碳酸钠水溶液25mL，用二氯甲烷进行萃取，收集有机层，用无水硫酸钠进行干燥，过滤，减压蒸馏，用体积比石油醚：丙酮＝10:1的体系过柱分离，得到黄色固体，即为中间体化合物3；
(4)氮杂吖啶氨衍生物的制备
中间体化合物3 1.6g溶解于甲醇45mL中，加入碳酸钾6.2g和盐酸羟胺1.6g，在65℃条件下反应11h，停止加热，冷却至室温，过滤，收集滤液，将甲醇减压蒸干，用体积比二氯甲烷：甲醇：氨水＝15:1:0.3的体系过柱分离，得到黄色油状液体，即中间体化合物4；
将中间体化合物4 1.6g溶解于甲醇30mL中，加入Pd/C催化剂0.4g，然后将体系内抽真空，并通入氢气，室温反应过夜；停止反应，过滤，收集滤液，加压蒸干，用体积比二氯甲烷：甲醇：氨水＝15:1:0.3的体系过柱分离，得到黄色油状液体，即为氮杂吖啶氨衍生物。
中间体化合物1 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.11(d,J＝8.4Hz,1H),7.98(d,J＝8.4Hz,1H),7.65(t,J＝7.7Hz,1H),7.51(t,J＝7.6Hz,1H),7.43–7.33(m,4H),7.29(t,J＝7.1Hz,1H),3.88(s,2H),3.78(s,2H),3.22(t,J＝5.9Hz,2H),2.86(t,J＝5.9Hz,2H)。
中间体化合物2 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.14(d,J＝8.4Hz,1H),7.97(d,J＝8.4Hz,1H),7.67(t,J＝7.7Hz,1H),7.54(t,J＝7.6Hz,1H),4.22(s,2H),3.26(t,J＝5.9Hz,2H),3.12(t,J＝5.9Hz,2H)。
中间体化合物3 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.10(d,J＝8.4Hz,1H),7.94(d,J＝8.4Hz,1H),7.80–7.75(m,2H),7.68–7.61(m,3H),7.51(t,J＝7.6Hz,1H),3.80(s,2H),3.73(t,J＝6.9Hz,2H),3.19(t,J＝5.7Hz,2H),2.84(t,J＝5.5Hz,2H),2.64(t,J＝7.1Hz,2H),1.82–1.73(m,2H),1.67(dt,J＝14.5,7.3Hz,2H)。
中间体化合物4 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.10(d,J＝8.4Hz,1H),7.94(d,J＝8.4Hz,1H),7.67–7.61(m,1H),7.53–7.47(m,1H),3.81(s,2H),3.20(t,J＝6.0Hz,2H),2.84(t,J＝6.0 Hz,2H),2.73(t,J＝7.0Hz,2H),2.63–2.56(m,2H),1.64(dt,J＝8.7,7.1Hz,2H),1.56–1.46(m,2H)。
氮杂吖啶氨衍生物 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.15(d,J＝8.4Hz,1H),7.97(d,J＝8.4Hz,1H),7.67(dd,J＝11.2,4.1Hz,1H),7.54(t,J＝7.7Hz,1H),3.86(s,2H),3.24(t,J＝5.9Hz,2H),2.89(t,J＝6.0Hz,2H),2.76(t,J＝7.0Hz,2H),2.67–2.59(m,2H),1.74–1.63(m,2H),1.60–1.50(m,2H)。
实施例3
本实施例双位点抑制乙酰胆碱酯酶活性的氮杂吖啶氨衍生物的结构式如下：
本实施例双位点抑制乙酰胆碱酯酶活性的氮杂吖啶氨衍生物的的制备方法，包括以下步骤：
(1)中间体化合物1的制备
将N-苄基-4-哌啶酮4mL和三氯氧磷23mL混合，搅拌均匀，加入邻氨基苯甲酸3.5g，搅拌回流1.5h，停止加热，冷却至室温后，冰浴条件下加入氨水调节pH值至8，生成黄色沉淀，抽滤，得黄色沉淀，最后用体积比石油醚：丙酮＝12:1的体系过柱分离，丙酮重结晶，得到淡黄色晶体，即中间体化合物1；
(2)中间体化合物2的制备
将中间体化合物1 0.8g加入二氯甲烷23mL中，冰浴搅拌12min后，加入氯乙基氯甲酸酯1.2mL，搅拌18min，在室温下反应1.2h后，将二氯甲烷蒸干，加入甲醇22mL，搅拌回流1.5h，再将甲醇蒸干，加入1.2mol/L的KOH水溶液30mL，搅拌12min，用二氯甲烷进行萃取，收集有机层，用无水硫酸钠进行干燥，过滤，减压蒸馏，用体积比二氯甲烷：甲醇＝50:1和30:1的体系过柱分离，得到浅黄色固体，即中间体化合物2；
(3)中间体化合物3的制备
将中间体化合物2 0.6g、碳酸钾1.8g加入乙腈22mL中，在40℃条件下搅拌20min，加入N-(3-溴丙基)邻苯二甲酰亚胺1.2g，在40℃条件下反应10h；反应结束后，将乙腈减压蒸出，加入质量分数10％的碳酸钠水溶液35mL，用二氯甲烷进行萃取，收集有机层，用无水硫酸钠进行干燥，过滤，减压蒸馏，用体积比石油醚：丙酮＝10:1的体系过柱分离，得到黄色固体，即为中间体化合物3；
(4)氮杂吖啶氨衍生物的制备
将中间体化合物3 1.0g、水合肼1.43g加入二氯甲烷和乙醇体积比1:1的混合溶液20mL中，反应过夜，生成白色沉淀，然后将反应液减压蒸馏，剩余物用水溶解，二氯甲烷萃取，收集有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏，用体积比二氯甲烷：甲醇：氨水＝20:1:0.3的体系过柱分离，得到黄色油状液体，即中间体化合物5；
将中间体化合物5 0.4g溶解于乙腈40mL中，加入碳酸钾0.8g、碘化钾0.1g，搅拌10min，加入溴乙烷0.47g，在45℃条件下反应4h，补加溴乙烷至溴乙烷为0.47g，45℃条件下继续反应4h；停止反应，将乙腈减压蒸干，加入水30mL，用二氯甲烷进行萃取，收集有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏，用体积比二氯甲烷：甲醇：氨水＝20:1:0.3的体系过柱分离，得到黄色油状液体，即中间体化合物6；
将中间体化合物6 0.2g溶解于甲醇40mL中，加入碳酸钾1.0g、盐酸羟胺0.25g，在60℃条件下反应10h，停止加热，冷却至室温后过滤，收集滤液并将甲醇减压蒸干，用体积比二氯甲烷：甲醇：氨水＝15:1:0.3的体系过柱分离，得到黄色油状液体，即中间体化合物7；
将中间体化合物7 0.2g溶解于甲醇25mL中，加入Pd/C催化剂0.3g，然后将体系内抽真空，并通入氢气，室温反应过夜；停止反应，过滤，收集滤液，加压蒸干，用体积比二氯甲烷：甲醇：氨水＝15:1:0.3的体系过柱分离，得到黄色油状液体，即为氮杂吖啶氨衍生物。
中间体化合物1 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.11(d,J＝8.4Hz,1H),7.98(d,J＝8.4Hz,1H),7.65(t,J＝7.7Hz,1H),7.51(t,J＝7.6Hz,1H),7.43–7.33(m,4H),7.29(t,J＝7.1Hz,1H),3.88(s,2H),3.78(s,2H),3.22(t,J＝5.9Hz,2H),2.86(t,J＝5.9Hz,2H)。
中间体化合物2 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.14(d,J＝8.4Hz,1H),7.97(d,J＝8.4Hz,1H),7.67(t,J＝7.7Hz,1H),7.54(t,J＝7.6Hz,1H),4.22(s,2H),3.26(t,J＝5.9Hz,2H),3.12(t,J＝5.9Hz,2H)。
中间体化合物3 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.08(d,J＝8.4Hz,1H),7.90(d,J＝8.3Hz,1H),7.66–7.61(m,3H),7.54–7.48(m,1H),7.36(dt,J＝6.8,3.4Hz,2H),3.83(t,J＝6.7Hz,2H),3.71(s,2H),3.06(t,J＝6.0Hz,2H),2.79(t,J＝6.0Hz,2H),2.70(t,J＝6.6Hz,2H),2.00(p,J＝6.6Hz,2H)。
中间体化合物5 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.13(d,J＝8.3Hz,1H),7.96(d,J＝8.4Hz,1H),7.69–7.63(m,1H),7.53(t,J＝7.6Hz,1H),3.85(s,2H),3.22(t,J＝6.0Hz,2H),2.87(t,J＝6.0Hz,2H),2.81(t,J＝6.8Hz,2H),2.68(t,J＝7.2Hz,2H),1.83–1.73(m,2H)。
中间体化合物6 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.16(d,J＝8.4Hz,1H),7.98(d,J＝8.4Hz,1H),7.68(t,J＝7.7Hz,1H),7.55(t,J＝7.6Hz,1H),3.88(s,2H),3.25(t,J＝6.0Hz,2H),2.90(t, J＝6.0Hz,2H),2.69–2.62(m,2H),2.61–2.50(m,6H),1.81(dt,J＝14.9,7.5Hz,2H),1.04(t,J＝7.1Hz,6H)。
中间体化合物7 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.98(d,J＝8.5Hz,1H),7.71(d,J＝8.1Hz,1H),7.65–7.59(m,1H),7.45(t,J＝7.1Hz,1H),3.83(d,J＝6.7Hz,2H),3.28–3.22(m,2H),2.92(dd,J＝12.1,6.0Hz,2H),2.63–2.50(m,8H),1.80(dt,J＝15.0,7.5Hz,2H),1.09–1.01(m,6H)。
氮杂吖啶氨衍生物1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.97(d,J＝8.5Hz,1H),7.72(d,J＝8.1Hz,1H),7.62(ddd,J＝8.4,6.9,1.3Hz,1H),7.47–7.42(m,1H),3.83(d,J＝6.3Hz,2H),3.25(t,J＝6.1Hz,2H),2.93(t,J＝6.1Hz,2H),2.62–2.51(m,9H),1.80(dt,J＝17.7,7.5Hz,2H),1.04(dd,J＝9.3,5.0Hz,7H)
实施例4
本实施例双位点抑制乙酰胆碱酯酶活性的氮杂吖啶氨衍生物的结构式如下：
本实施例双位点抑制乙酰胆碱酯酶活性的氮杂吖啶氨衍生物的制备方法，包括以下步骤：
(1)中间体化合物1的制备
将N-苄基-4-哌啶酮3.5mL和三氯氧磷20mL混合，搅拌均匀，加入邻氨基苯甲酸3g，搅拌回流2h，停止加热，冷却至室温后，冰浴条件下加入氨水调节pH值至9，生成黄色沉淀，抽滤，得黄色沉淀，最后用体积比石油醚：丙酮＝12:1的体系过柱分离，丙酮重结晶，得到淡黄色晶体，即中间体化合物1；
(2)中间体化合物2的制备
将中间体化合物1 0.9g加入二氯甲烷20mL中，冰浴搅拌10min后，加入氯乙基氯甲酸酯1.3mL，搅拌15min，在室温下反应1h后，将二氯甲烷蒸干，加入甲醇20mL，搅拌回流2h，再将甲醇蒸干，加入1mol/L的KOH水溶液25mL，搅拌10min，用二氯甲烷进行萃取，收集有机层，用无水硫酸钠进行干燥，过滤，减压蒸馏，用体积比二氯甲烷：甲醇＝50:1和30:1的体系过柱分离，得到浅黄色固体，即中间体化合物2；
(3)中间体化合物3的制备
将中间体化合物2 0.5g、碳酸钾1.5g加入乙腈20mL中，在45℃条件下搅拌15min，加入N-(4-溴丁基)邻苯二甲酰亚胺1g，在45℃条件下反应9h；反应结束后，将乙腈减压蒸出， 加入质量分数10％的碳酸钠水溶液30mL，用二氯甲烷进行萃取，收集有机层，用无水硫酸钠进行干燥，过滤，减压蒸馏，用体积比石油醚：丙酮＝10:1的体系过柱分离，得到黄色固体，即为中间体化合物3；
(4)氮杂吖啶氨衍生物的制备
将中间体化合物3 1.1g、水合肼1.5g加入二氯甲烷和乙醇体积比1.1:1的混合溶液22mL中，反应过夜，生成白色沉淀，然后将反应液减压蒸馏，剩余物用水溶解，二氯甲烷萃取，收集有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏，用体积比二氯甲烷：甲醇：氨水＝20:1:0.3的体系过柱分离，得到黄色油状液体，即中间体化合物5；
将中间体化合物5 0.5g溶解于乙腈45mL中，加入碳酸钾0.9g、碘化钾0.15g，搅拌13min，加入溴乙烷0.5g，在48℃条件下反应5h，补加溴乙烷至溴乙烷为0.5g，48℃条件下继续反应5h；停止反应，将乙腈减压蒸干，加入水25mL，用二氯甲烷进行萃取，收集有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏，用体积比二氯甲烷：甲醇：氨水＝20:1:0.3的体系过柱分离，得到黄色油状液体，即中间体化合物6；
将中间体化合物6 0.25g溶解于甲醇50mL中，加入碳酸钾1.2g、盐酸羟胺0.3g，在65℃条件下反应8h，停止加热，冷却至室温后过滤，收集滤液并将甲醇减压蒸干，用体积比二氯甲烷：甲醇：氨水＝15:1:0.3的体系过柱分离，得到黄色油状液体，即中间体化合物7；
将中间体化合物7 0.3g溶解于甲醇30mL中，加入Pd/C催化剂0.4g，然后将体系内抽真空，并通入氢气，室温反应过夜；停止反应，过滤，收集滤液，加压蒸干，用体积比二氯甲烷：甲醇：氨水＝15:1:0.3的体系过柱分离，得到黄色油状液体，即为氮杂吖啶氨衍生物。
中间体化合物1 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.11(d,J＝8.4Hz,1H),7.98(d,J＝8.4Hz,1H),7.65(t,J＝7.7Hz,1H),7.51(t,J＝7.6Hz,1H),7.43–7.33(m,4H),7.29(t,J＝7.1Hz,1H),3.88(s,2H),3.78(s,2H),3.22(t,J＝5.9Hz,2H),2.86(t,J＝5.9Hz,2H)。
中间体化合物2 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.14(d,J＝8.4Hz,1H),7.97(d,J＝8.4Hz,1H),7.67(t,J＝7.7Hz,1H),7.54(t,J＝7.6Hz,1H),4.22(s,2H),3.26(t,J＝5.9Hz,2H),3.12(t,J＝5.9Hz,2H)。
中间体化合物3 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.10(d,J＝8.4Hz,1H),7.94(d,J＝8.4Hz,1H),7.80–7.75(m,2H),7.68–7.61(m,3H),7.51(t,J＝7.6Hz,1H),3.80(s,2H),3.73(t,J＝6.9Hz,2H),3.19(t,J＝5.7Hz,2H),2.84(t,J＝5.5Hz,2H),2.64(t,J＝7.1Hz,2H),1.82–1.73(m,2H),1.67(dt,J＝14.5,7.3Hz,2H)。
中间体化合物5 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.15(d,J＝8.3Hz,1H),7.98(d,J＝8.4Hz,1H),7.68(t,J＝7.2Hz,1H),7.55(t,J＝7.5Hz,1H),3.87(s,2H),3.24(t,J＝5.9Hz,2H),2.89(t, J＝6.0Hz,2H),2.75(t,J＝7.0Hz,2H),2.68–2.59(m,2H),1.72–1.63(m,2H),1.58–1.49(m,2H)。
中间体化合物6 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.15(d,J＝8.3Hz,1H),7.71(d,J＝8.1Hz,1H),7.65–7.59(m,1H),7.45(t,J＝7.1Hz,1H),3.83(d,J＝6.7Hz,2H),3.28–3.22(m,2H),2.92(dd,J＝12.1,6.0Hz,2H),2.63–2.50(m,8H),1.80(dt,J＝15.0,7.5Hz,2H),1.09–1.01(m,6H)。
中间体化合物7 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.17–8.12(m,1H),7.97(d,J＝8.4Hz,1H),7.71–7.65(m,1H),7.58–7.51(m,1H),3.85(d,J＝8.8Hz,3H),3.41–3.31(m,6H),3.22(t,J＝5.9Hz,2H),2.87(t,J＝6.0Hz,2H),2.68(t,J＝6.9Hz,2H),1.92–1.81(m,2H),1.76–1.65(m,2H),1.30(t,J＝7.2Hz,7H)。
氮杂吖啶氨衍生物1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.96(d,J＝8.5Hz,1H),7.68(d,J＝8.2Hz,1H),7.60(dd,J＝8.3,7.0Hz,1H),7.42(t,J＝7.5Hz,1H),3.79(d,J＝8.7Hz,2H),3.23(t,J＝6.0Hz,2H),2.88(dd,J＝14.0,8.1Hz,2H),2.59–2.43(m,9H),1.66–1.57(m,2H),1.51(dt,J＝9.3,7.5Hz,2H),1.00(t,J＝7.2Hz,6H)。
实验例1、本发明氮杂吖啶氨衍生物的细胞毒性检测
MTT法是检测化合物或药物对细胞活力影响的常规方法。其原理是活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶(NADH/NADPH)将外源性四甲基偶氮唑盐还原为蓝紫色的结晶物甲臢(Formazan)，并沉积在细胞内和细胞周围，以DMSO等特殊溶解液溶解四甲基偶氮唑盐后，以酶标仪在570nm测定其吸光度值(OD值)，可间接地反映化合物对被测细胞活性的影响，进而反映化合物是否对被测细胞有细胞毒作用。本发明采用MTT法是检测实施例1-4的氮杂吖啶氨衍生物对HOPC(人少突胶质细胞)、HAEC(人主动脉内皮细胞)、SGC 7901(人胃癌细胞)、K562(人白血病细胞)细胞活力的影响，以考察氮杂吖啶氨衍生物潜在地细胞毒作用(结果见表1)。每次实验48h，4个复孔，以均值计算其抑制率，计算式如下：
细胞生长抑制率(％)＝(A对照-A加化合物)/(A对照-A空白)×100％
结果表明：50μM实施例1-4的氮杂吖啶氨衍生物在48h内对HOPC细胞(人少突胶质细胞)活性的抑制率为15.631％、10.729％、17.901％、11.532％，因此证明本发明的氮杂吖啶氨衍生物对HOPC细胞无细胞毒或极低细胞毒；50μM实施例1-4的氮杂吖啶氨衍生物在48h内对HAEC细胞(人主动脉内皮细胞)活性的抑制率为16.563％，4.997％，22.296％，1.258％，因此证明本发明的氮杂吖啶氨衍生物对HAEC细胞无细胞毒或极低细胞毒；50μM实施例1-4的氮杂吖啶氨衍生物在48h内对SGC细胞(人胃癌细胞)活性的抑制率为12.335％，5.839％，11.430％，10.498％，因此证明本发明的氮杂吖啶氨衍生物对HOPC细胞无细胞毒 或极低细胞毒；50μM实施例1-4的氮杂吖啶氨衍生物在48h内对K562细胞(人白血病细胞)活性的抑制率为30.401％，35.062％，35.705％，21.468％，因此证明实施例4的氮杂吖啶氨衍生物对K562细胞有极低细胞毒，实施例1-3的氮杂吖啶氨衍生物对K562细胞有较低细胞毒。
表1 MTT法检测氮杂吖啶氨衍生物干预48h对细胞活性的抑制率(％)
实验例2、本发明的氮杂吖啶氨衍生物对乙酰胆碱酯酶活性抑制作用的检测
本发明采用了Ellman法测定氮杂吖啶氨衍生物对乙酰胆碱酯酶活性。Ellman法的原理是根据乙酰胆碱酯酶(丁酰胆碱酯酶)可以水解硫代乙酰胆碱(硫代丁酰胆碱)，生成硫代胆碱，它能与5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)反应，生成黄色的5-硫-2-硝基苯甲酸可 在412nm处产生紫外吸收，于酶标仪λ＝412nm扫描2min测定吸光度(A)值。以不加样品的空白作为对照。每次检测6个复孔，以均值计算出各化合物的相对酶活力(结果见表2)。计算式如下：
相对酶活力＝(A加化合物/A对照)×100
抑制率＝(100﹣相对酶活力)×100％
结果表明：10μM实施例1-4的氮杂吖啶氨衍生物对乙酰胆碱酯酶活性的抑制率分别为16.24％，68.19％，70.78％，93.19％。这表明本发明的氮杂吖啶氨衍生物对乙酰胆碱酯酶活性有较好的抑制率，以实施例4的氮杂吖啶氨衍生物对乙酰胆碱酯酶活性的抑制最佳。
表2 Ellman法检测氮杂吖啶氨衍生物(10μM)对乙酰胆碱酶活性影响