新肽和以其为有效成分的骨病治疗剂 【技术领域】
本发明涉及新肽和以其为有效成分的骨病治疗剂。
背景技术
生物体内存在许多生理活性物质，它们对维持机体的正常的生命活动具有密切的关系，此乃周知的事实。这些机体内生理活性物质和合成生理活性物质除其自身具有作为新药的可能性之外，还可为开发新药提供有益的启示。因此，对这些生理活性物质的探索是极为重要的。
另一方面，在治疗骨质疏松症等骨病时，目前使用降钙素、雌激素和活性维生素D3等，但它们的治疗效果并不令人满意。
发明的公开
本发明的目的在于，提供可用作骨病治疗剂的新物质。
本发明者在对参与骨形成的成骨细胞的研究中寻找促进成骨细胞活性的物质，发现了具有此作用的新肽，从而完成了本发明。
即，本发明提供对成骨细胞具有增殖促进作用和活性促进作用的具有序列表中序列号1所示的氨基酸序列的肽及其衍生物。此外，本发明还提供含有作为有效成分的上述本发明地肽的骨病治疗剂。
根据本发明，提供了新肽。本发明的新肽如下述实施例中的实验所确证的，对成骨细胞具有增殖促进作用和活性促进作用，表明其具有骨病治疗剂的作用。实施本发明的最佳方式
本发明的肽基本上具有序列表中序列号1所示的氨基酸序列。
此外，在本发明的范围内，除具有序列表中序列号1所示的氨基酸序列的上述肽之外，还包括对成骨细胞具有增殖促进作用和活性促进作用的该肽的衍生物。例如，对上述肽进行了不损害上述作用的化学修饰的产物包含在此处所述的“衍生物”之内。举例而言，将肽的C末端的羧基改为氨基可提高其在生物体内的稳定性是公知的，进行了此类化学修饰的产物也包括在本发明的范围内。
还有，一般在具有生理活性的肽中，当其中的少数氨基酸被其他氨基酸置换，或者插入了少数氨基酸，或者少数氨基酸缺失时，有时其生理活性仍可能得到维持，在本领域是周知的事实。因此，在本发明的范围内，在构成具有序列号1所示的氨基酸序列的上述肽的氨基酸中，其中的少数氨基酸被其他氨基酸置换，或者插入了少数氨基酸，或者少数氨基酸缺失而产生的产物也包含在本发明所述的“衍生物”中，在这些衍生物中，对成骨细胞具有增殖促进作用和活性促进作用的肽包含在本发明的范围内。例如，插入、置换或缺失了5个以下的氨基酸或氨基酸序列的同源性在70％以上的对成骨细胞具有增殖促进作用和活性促进作用的肽也包含在本发明的范围内。肽衍生物对成骨细胞是否具有增殖促进作用和活性促进作用可通过下述实施例2和4中记载的方法进行测定。
序列号1所述的本发明的肽是构成氨基酸数为16的较小的肽，可通过常规的化学合成方法容易地加以制备。例如，可用市售的肽合成仪容易地加以制备。或者，可用下述常规的基因工程学方法容易地加以制备：用DNA合成仪合成编码该氨基酸序列的DNA，将所得DNA插入市售的克隆用载体的克隆位点上，然后使宿主微生物转化和进行培养。
如在下述实施例中的实验所确证的，本发明的肽对成骨细胞具有增殖促进作用和活性促进作用。因此，本发明的肽可用作骨质疏松症之类的骨病的治疗剂。可用本发明的肽治疗的骨病的例子除骨质疏松症之外，还包括骨软化症等。
由于本发明的肽的分子量较小，因此，除静脉注射、皮下注射和肌肉注射之外，还可通过制剂技术进行经口给药和经皮给药。也可直接将本发明的肽给药，或者用常规方法与药理学上可接受的载体混合后给药。
使用剂量应根据患者的状态进行适当地判断，但通常成人每日为本发明的肽0.1-10mg左右。
此外，静脉注射、皮下注射和肌肉注射时，最好将本发明的肽溶解在枸橼酸缓冲液(pH4-6)或乙酸缓冲液(pH4-6)之类的弱酸性缓冲液中后给药。此时，缓冲液中的肽的浓度通常在0.1mg/ml-10mg/ml左右。此外，经口和经皮给药时，最好将本发明的肽溶解在脂溶性物质(例如，凡士林等)中，以提高其吸收性。此时，本发明的肽的浓度通常在0.1mg/ml-100mg/ml左右。
下面结合实施例对本发明作具体说明。但本发明并不受下述实施例的限定。实施例1 肽的制备
用市售的肽合成仪合成了具有序列号1所示的氨基酸序列的肽。实施例2 成骨细胞增殖促进作用
将来源于大鼠的成骨细胞ROS细胞(ATCC公司产品)在含10％胎牛血清的F10培养基(大日本制药公司产品)中培养，于含5％二氧化碳的加湿的37℃恒温器中温育。经过胰蛋白酶处理后，将ROS细胞接种在24孔培养平板上，每孔1×105个细胞，待细胞铺满(confluent)后，将培养基改为含1％胎牛血清的F10培养基，培养24小时。然后，将由实施例1制得的本发明的肽溶解在含1％胎牛血清的F10培养基中，分别往各孔中加入不同容量的本肽，继续培养24小时。培养后，通过MTT测定法测定本肽对细胞的增殖促进效果，求出相对于非处理组的增殖促进效果。MTT测定法和增殖促进率的计算方法具体如下。按日本Funakoshi株式会社销售的MTF-Cell-Growth Assay Kit的操作步骤，分别往各孔中加入不同容量的本物质，放置一昼夜后，利用存活细胞的线粒体中存在的酶使MTT〔3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四唑〕裂解成暗蓝色的甲的现象，用比色法对存活细胞计数。以未加本物质的对照组为100％，求出加入了不同容量的肽的组的比色度，结果见下列表1。
表 1肽添加量(μg/孔)增殖促进率(％) 0 0.001 0.01 0.1 1.0 100.0 109.6 110.5 636.2 1317.1
表1的结果证实，本发明的肽对成骨细胞具有增殖促进作用。因此，本发明的肽被认为与骨量的增加有关联，可用于治疗骨质疏松症等骨病。实施例3 成骨细胞上本肽的受体的存在
由于判明本肽对成骨细胞具有增殖促进作用，因此推测成骨细胞上有本肽的受体存在。若受体存在，则可认为本肽对生命而言是关键性物质，下面对成骨细胞是否存在所述受体进行调查。
用生物素标记由实施例1制得的肽，往按与实施例2同样的方法培养的ROS细胞中加入一定量的标记的本肽，为引发竞争反应，再将未标记的本肽溶解在含10％胎牛血清的F10培养基中，分别加入不同的容量，观察竞争反应。该实验操作的内容具体如下。按SUMILON公司生产的蛋白生物素化标记试剂盒的操作步骤，将本肽生物素化，往接种在各孔中的一定数的细胞中加入一定量的生物素化的肽，再在每个孔中分别加入0-0.512μg的未标记的肽，进行竞争反应6小时，然后用PBS洗涤细胞，使用以链霉抗生物素蛋白标记的过氧化物酶，与在细胞表面上同受体结合的生物素化的肽反应，观察显色反应。若细胞表面存在本肽的受体，则出现与未标记的肽的竞争反应，显色强度下降。结果见下列表2。
表 2 未标记物质的添加量 (μg/孔)加入的标记物质所占的比例 (％) 0 0.032 0.064 0.128 0.256 0.512 100 98.4 86.5 79.6 34.1 29.5
如表2所示，由于加入的标记物质所占的比例依赖于未标记物质的添加量而变化，显然，成骨细胞具有本肽的受体，推测本物质起关键性的作用。急性毒性试验
用ddy雄性小鼠(体重40～45g)就由实施例1制得的肽的急性毒性进行了试验。将本肽溶解在生理盐水(pH6.0)中，注射在小鼠的尾静脉上，观察14日。剂量为1、10、100μg/kg。结果见表3。
表 3 剂量(μg/kg) 死亡只数 1 10 100 0/5 0/5 0/5
由上述可见，直至100μg/kg的剂量范围仍未见动物死亡。
工业上应用的可能性
本发明的肽如上述实施例中的实验所确证的，对成骨细胞具有增殖促进作用和活性促进作用，可用作骨病治疗剂。
【序列表】
序列号：1
序列长度：16
序列类型：氨基酸
序列Lys Leu Thr Thr Ile Phe Pro Leu Asn Trp Lys Tyr Arg Lys Ala Leu1 5 10 15