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1、(10)申请公布号 CN 102977221 A (43)申请公布日 2013.03.20 CN 102977221 A *CN102977221A* (21)申请号 201210512343.7 (22)申请日 2012.12.04 C08B 37/00(2006.01) A61K 31/715(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人 天津科技大学 地址 300457 天津市滨海新区经济技术开发 区十三大街 29 号 (72)发明人 卢相义 刘薇 罗成 李贞景 (74)专利代理机构 天津盛理知识产权代理有限 公司 12209 代理人 王来佳 (54) 发明名。
2、称 一种薏仁多糖的制备方法与应用 (57) 摘要 本发明涉及一种薏仁多糖的制备方法， 步骤 如下 ： 先将薏仁粉碎、 过筛后， 经脱脂、 水浴提取、 离心、 酶解、 浓缩、 醇沉、 真空冷冻干燥沉淀得薏仁 粗多糖 ； 再将制得的薏仁粗多糖溶解得薏仁粗多 糖溶液， 经过脱蛋白、 脱色、 透析和离子交换柱层 析得薏仁纯化多糖， 再经过真空冷冻干燥得白色 粉末， 即为薏仁多糖。本发明制备方法是通过水 提醇沉法提取得到薏仁粗多糖， 再经过脱蛋白， 脱 色， 透析和离子交换柱层析得薏仁纯化多糖， 再经 过真空冷冻干燥得白色粉末薏仁多糖， 制备方法 方法简单， 薏仁多糖的利率高。 (51)Int.Cl. 。
3、权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 2 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 2 页 附图 5 页 1/1 页 2 1. 一种薏仁多糖的制备方法， 其特征在于 ： 步骤如下 ： 薏仁粗多糖的提取 ： 将薏仁粉碎、 过筛后， 分别用乙酸乙酯和石油醚脱脂后， 按料液比 g ： g 为 1:20-30 加入 蒸馏水中并调节 pH 到 5.2， 85-95水浴提取 3-5h ； 提取后趁热， 取上清液冷却， 酶解去淀 粉， 然后在 3,000r/min 下离心 9-11min， 得上清液 ； 上清液浓缩后， 加。
4、入 2-4 倍浓缩液体积 的 95% 冰乙醇沉淀过夜， 得沉淀， 沉淀经真空冷冻干燥， 得薏仁粗多糖 ； 薏仁粗多糖的纯化 ： 将步骤中制得的薏仁粗多糖加水溶解， 得薏仁粗多糖溶液， 经过脱蛋白、 脱色、 透析和离子交换柱层析得薏仁纯化多糖， 再经过真空冷冻干燥得白色粉 末， 即为薏仁多糖。 2. 根据权利要求 1 所述的薏仁多糖的制备方法， 其特征在于 ： 所述步骤中酶解去淀 粉的具体步骤如下 ： 按酶 ： 上清液的比例为20IU/g加淀粉酶到上清液中， 水浴温度60、 pH7.0去淀粉直到 碘检不变色 ； 然后按酶 ： 上清液的比例为 18IU/g 加糖化酶， 在水浴温度 50 60， p。
5、H6.5 条件下处理 0.5-1.5h ； 100水浴条件下灭酶 8-11min。 3. 根据权利要求 1 所述的薏仁多糖的制备方法， 其特征在于 ： 所述步骤中脱蛋白的 具体步骤如下 ： 向薏仁粗多糖溶液中加入 1/3 粗多糖溶液体积的 Sevage 试剂， 剧烈震荡 30min， 3,000r/min 离心 15min， 除去变形蛋白沉淀， 水相重复上述操作至没有变性蛋白沉淀产生。 4. 根据权利要求 1 所述的薏仁多糖的制备方法， 其特征在于 ： 所述步骤中脱色的具 体步骤如下 ： 使用浓氨水调节脱蛋白后的薏仁粗多糖溶液pH至pH8.0， 再滴加质量百分数30%H2O2至 浅黄色， 于 。
6、50水浴保温 2h。 5. 根据权利要求 1 所述的薏仁多糖的制备方法， 其特征在于 ： 所述步骤中的透析的 条件为 ： 用截留相对分子质量为 8,000-14,000 的透析袋流水透析 2d。 6. 根据权利要求 1 所述的薏仁多糖的制备方法， 其特征在于 ： 所述步骤中的离子交 换柱材料为 DEAE-52 纤维素柱材料。 7.一种如权利要求1至6任一项所述的薏仁多糖的制备方法所制备得到的薏仁多糖在 制备抗肿瘤药物中的应用。 8.一种如权利要求1至6任一项所述的薏仁多糖的制备方法所制备得到的薏仁多糖在 制备诱导细胞凋亡药物中的应用。 9. 根据权利要求 8 所述的薏仁多糖在制备诱导细胞凋亡药。
7、物中的应用， 其特征在于 ： 所述薏仁多糖的作用浓度为 300g/mL。 权 利 要 求 书 CN 102977221 A 2 1/6 页 3 一种薏仁多糖的制备方法与应用 技术领域 0001 本发明属于营养与免疫领域， 涉及多糖的提取， 尤其是一种薏仁多糖的制备方法 与应用。 背景技术 0002 薏米 （Coix） 别名薏苡仁、 米仁、 薏珠子、 菩提子、 芑实、 解蠡等， 广泛地种植于亚洲、 非洲和地中海周边的温暖地区。喜生于湿润地区， 但能耐涝耐旱。薏米的干燥成熟种仁叫 做薏仁， 薏仁质坚实， 断面白色， 粉性， 气微， 味微甜， 薏仁通过烘烤或加工成薏米粉食用。 薏 米的种仁能入药治病。
8、。李时珍在 本草纲目 中记载 ： 薏仁能 “健脾益胃， 补肺清热， 去风渗 湿。炊饭食， 治冷气。煎饮， 利小便热淋。 ” 它含有丰富的蛋白质、 脂肪、 碳水化合物和多种氨 基酸、 维生素、 无机盐， 其中主要的功能性成分是脂肪和糖类。在传统的中药中作为一种利 尿剂、 抗炎药物、 抗癌药物、 镇痛剂和一种营养物。研究表明薏仁中含有大量脂肪酸包括棕 榈酸、 硬脂酸、 十八碳二烯酸、 硬脂酸、 油酸、 亚油酸等， 其中含有的寡聚糖具有 DPPH 自由基 清除能力和脂质抗氧化能力。薏仁组份已被证实具有降血糖， 提高免疫力等作用。 0003 多糖是一类天然大分子化合物， 由 10 个以上单糖基通过苷键。
9、连接而成。通常多糖 由几百个或几千个单糖聚合而成， 是多分散分子， 没有明确的分子量， 只能有一个平均分子 量， 其性质已完全不同于单糖， 多糖具有明显的种属特异性， 结构规则庞大， 有宏观 （颗粒大 小） 不均一性， 是一类高分子多聚物， 具有复杂的生物活性和功能， 其中部分多糖具有抗肿 瘤机制表现在多糖能够直接抑制肿瘤细胞生长 ； 多糖抑制肿瘤细胞的蛋白质和核酸合成 ； 多糖诱导肿瘤细胞凋亡。 0004 通过检索， 未发现与本专利申请相关的专利公开文献。 发明内容 0005 本应用的目的在于克服现有技术的不足， 提供一种原料来源广泛、 价格低廉、 方法 简单的薏仁多糖的制备方法， 同时也提。
10、供了由该制备方法制备得到的薏仁多糖的应用。 0006 本发明实现目的的技术方案是 ： 0007 一种薏仁多糖的制备方法， 其特征在于 ： 步骤如下 ： 0008 薏仁粗多糖的提取 ： 0009 将薏仁粉碎、 过筛后， 分别用乙酸乙酯和石油醚脱脂后， 按料液比 g ： g 为 1:20-30 加入蒸馏水中并调节pH到5.2， 85-95水浴提取3-5h ； 提取后趁热， 取上清液冷却， 酶解去 淀粉， 然后在 3,000r/min 下离心 9-11min， 得上清液 ； 上清液浓缩后， 加入 2-4 倍浓缩液体 积的 95% 冰乙醇沉淀过夜， 得沉淀， 沉淀经真空冷冻干燥， 得薏仁粗多糖 ； 0。
11、010 薏仁粗多糖的纯化 ： 将步骤中制得的薏仁粗多糖加水溶解， 得薏仁粗多糖溶 液， 经过脱蛋白、 脱色、 透析和离子交换柱层析得薏仁纯化多糖， 再经过真空冷冻干燥得白 色粉末， 即为薏仁多糖。 0011 而且， 所述步骤中酶解去淀粉的具体步骤如下 ： 说 明 书 CN 102977221 A 3 2/6 页 4 0012 按酶 ： 上清液的比例为 20IU/g 加淀粉酶到上清液中， 水浴温度 60、 pH7.0 去淀 粉直到碘检不变色 ； 然后按酶 ： 上清液的比例为 18IU/g 加糖化酶， 在水浴温度 50 60， pH6.5 条件下处理 0.5-1.5h ； 100水浴条件下灭酶 8。
12、-11min。 0013 而且， 所述步骤中脱蛋白的具体步骤如下 ： 0014 向薏仁粗多糖溶液中加入 1/3 粗多糖溶液体积的 Sevage 试剂， 剧烈震荡 30min， 3,000r/min 离心 15min， 除去变形蛋白沉淀， 水相重复上述操作至没有变性蛋白沉淀产生。 0015 而且， 所述步骤中脱色的具体步骤如下 ： 0016 使用浓氨水调节脱蛋白后的薏仁粗多糖溶液 pH 至 pH8.0， 再滴加质量百分数 30%H2O2至浅黄色， 于 50水浴保温 2h。 0017 而且， 所述步骤中的透析的条件为 ： 用截留相对分子质量为 8,000-14,000 的透 析袋流水透析 2d。 。
13、0018 而且， 所述步骤中的离子交换柱材料为 DEAE-52 纤维素柱材料。 0019 如上所述的薏仁多糖的制备方法所制备得到的薏仁多糖在制备抗肿瘤药物中的 应用。 0020 如上所述的薏仁多糖的制备方法所制备得到的薏仁多糖在制备诱导细胞凋亡药 物中的应用。 0021 而且， 所述薏仁多糖的作用浓度为 300g/mL。 0022 本发明的优点和有益效果为 ： 0023 1、 本发明制备方法是通过水提醇沉法提取得到薏仁粗多糖， 再经过脱蛋白， 脱色， 透析和离子交换柱层析得薏仁纯化多糖， 再经过真空冷冻干燥得白色粉末薏仁多糖， 制备 方法方法简单， 薏仁多糖的利率高。 0024 2、 本发明制。
14、备方法使用的薏仁， 价格低廉、 来源广泛， 不仅扩大了薏仁的使用范 围、 为以后薏仁的研究提供了依据， 提高了农副产品的应用价值， 而且对研究多糖类物质抗 肿瘤具有积极的意义。 0025 3、 本发明制备方法制备得到的薏仁多糖处理人非小细胞肺癌细胞 A549 细胞实验 表明薏仁多糖能够 A549 细胞产生凋亡小体， 造成 S 期阻滞， 通过 Annexin V-FITC 和 PI 染 色发现薏仁多糖造成 A549 细胞凋亡率显著上升， 通过单细胞凝胶电泳实验发现处理后的 A549 产生典型的凋亡型彗星图案， 同时薏仁多糖使细胞内的 caspase-3、 caspase-9 基因和 相应蛋白的相。
15、对表达量上调， 从而表明薏仁多糖能够诱导人非小细胞肺癌细胞 A549 细胞 凋亡。因此， 制备得到的薏仁多糖可以应用于制备抗肿瘤药物中， 同时， 也可以应用于制备 诱导细胞凋亡药物中。 附图说明 0026 图 1 为本发明电子扫描显微镜观察细胞形态图， 其中， 图 1-1 为正常细胞， 图 1-2 为处理后细胞 ； 0027 图 2 为本发明流式细胞仪检测细胞周期图 ； 其中， 图 2-1 为正常细胞， 图 2-1 为处 理后细胞 ； 0028 图 3 为本发明 Annexin V-FITC 检测细胞凋亡率图 ； 其中， 图 3-1 为正常细胞， 图 3-2 为处理后细胞 ； 说 明 书 CN。
16、 102977221 A 4 3/6 页 5 0029 图 4 为本发明激光共聚焦显微镜检测彗星实验图 ； 其中， 图 4-1 为正常细胞， 图 4-2 为处理后细胞 ； 0030 图 5 为本发明 RP-PCR 检测 caspase-3 和 caspase-9 基因的相对表达量图 ； 0031 图 6 为本发明 Western blotting 检测 caspase-3 和 caspase-9 蛋白的相对表达 量图。 具体实施方式 0032 下面通过具体实施例对本发明作进一步详述， 以下实施例只是描述性的， 不是限 定性的， 不能以此限定本发明的保护范围。 0033 本发明的主要思想为 ： 。
17、以薏仁为原料， 通过水提醇沉法提取薏仁粗多糖， 再经过纯 化得到薏仁多糖， 将所得到的薏仁多糖作用于非小细胞肺癌细胞 A549 细胞， 观察薏仁多糖 诱导 A549 细胞凋亡作用。 0034 本发明利用薏仁多糖处理人非小细胞肺癌细胞 A549 细胞实验表明薏仁多糖能够 A549 细胞产生凋亡小体， 造成 S 期阻滞， 通过 Annexin V-FITC 和 PI 染色发现薏仁多糖造 成 A549 细胞凋亡率显著上升， 通过单细胞凝胶电泳实验发现处理后的 A549 产生典型的凋 亡型彗星图案， 同时薏仁多糖使细胞内的 caspase-3、 caspase-9 基因和相应蛋白的相对表 达量上调， 。
18、从而表明薏仁多糖能够诱导人非小细胞肺癌细胞 A549 细胞凋亡。 0035 一、 一种薏仁多糖的制备方法， 步骤如下 ： 0036 1、 薏仁粗多糖提取 0037 （1） 挑选籽粒饱满、 色泽洁白、 无虫蛀、 无霉斑的薏仁置于超微粉碎机中， 粉碎过 40 目筛 ； 0038 （2） 使用乙酸乙酯 （料液比为 1:10， g:g） 在 80条件下采用索氏提取法脱脂 8h 和 石油醚 （料液比为 1:10， g:g） 在 70条件下采用索氏提取法脱脂 6h， 置于三角瓶中， 将脱脂 后的薏仁粉末按料液比为 1:20-30（g:g） 加入蒸馏水中并用盐酸调节 pH 到 5.2， 于水浴锅 中 90提。
19、取 4h ； 0039 （3） 酶解 ： 提取后趁热离心， 取上清液冷却， 按 20IU/g 加淀粉酶到提取液中水浴温 度 60， pH 7.0 去淀粉直到碘液检测不变色 ； 接着按 18IU/g 加糖化酶， 水浴温度 5060， pH 6.5 处理 1h， 得酶解液 ； 0040 （4） 将酶解液于 100水浴条件下灭酶 10min， 然后在 3000r/min 下离心 10min， 得 上清液， 上清液用旋转蒸发仪60-70浓缩后， 再加入3倍浓缩液体积的95%冰乙醇， 醇沉过 夜， 3000r/min 离心 15min 后得沉淀， 经真空冷冻干燥， 得薏仁粗多糖。 0041 2、 薏仁多。
20、糖纯化 0042 （1） 脱蛋白 ： 将得到的薏仁粗多糖粉末溶解在蒸馏水中， 加入1/3体积的Sevage试 剂 （氯仿 : 正丁醇的体积比为 4:1） ， 剧烈震荡 30min， 3000r/min 离心 15min， 用分液漏斗出 去有机相与水相之间的变形蛋白沉淀， 水相重复上述操作， 至没有变形蛋白沉淀产生。 将水 相浓缩后， 用 3 倍体积 95% 冰乙醇醇沉， 离心， 蒸馏水溶解。 0043 （2） 脱色 ： 薏仁多糖水溶液以浓氨水调至 pH 8.0 滴加 30%H2O2至浅黄色， 于 50水 浴保温 2h。 0044 （3） 透析 ： 用截留相对分子质量为 8000 14000 的。
21、透析袋流水透析 2d。透析后将 说 明 书 CN 102977221 A 5 4/6 页 6 薏仁多糖浓缩， 真空冷冻干燥。 0045 （4） 离子交换柱层析 ： DEAE-52 纤维素柱材料在蒸馏水中充分溶涨， 用蒸馏水漂洗 3 次， 0.5mol/LNaOH 溶液浸泡 1h， 蒸馏水洗至中性， 0.5mol/L HCl 溶液浸泡 1h， 蒸馏水洗至 中性， 0.5mol/LNaOH 溶液浸泡 1h， 蒸馏水洗至中性。装柱用蒸馏水平衡过夜， 加样 5mL 以 0.1mol/L NaCl 溶液洗脱液洗脱 （恒流泵流速 ： 1.8-2.1r/min， 5ml/ 管） 。用苯酚 - 硫酸法检 测多。
22、糖含量。将含有多糖的部分合并， 上清液用旋转蒸发仪 60-70浓缩， 得到白色粉末即 为薏仁多糖。 0046 二、 薏仁多糖诱导非小细胞肺癌细胞 A549 细胞凋亡作用 0047 （1） 将载玻片置于六孔板中， 取 200L 浓度为 106个 /mL 对数期 A549 细胞接种于 载玻片上， 细胞贴壁后滴加 1mL 浓度为 300g/mL 的薏仁多糖处理 48h 后， 用 PBS 缓冲液漂 洗。按一定方向轻轻摇动。清洗 2 次， 每次 5min。细胞清洗干净后， 吸除 PBS， 加入 2.5% 的 戊二醛 （pH 为 7.2-7.4） 固定液， 置于 4冰箱内固定 1h。固定后用 PBS 再次。
23、清洗样品， 浓度 依次为 30%、 50%、 70%、 80%、 90%、 100% 的乙醇梯度脱水去除样品中水分， 每次脱水时间 5min。 将样品进行自然干燥 1.5h。15min， PBS 洗三次， 电子扫描显微镜观察下， A549 细胞产生凋 亡小体， 结果见图 1。 0048 （2） 取对数生长期的 A549 细胞， 以 4105个 /mL 密度接种于六孔细胞培养板上。 培养过夜后， 300g/mL 的薏仁多糖处理， 培养 48h。胰酶消化， 制成细胞悬液， 800r/min 离 心6min， 去上清， 加1mL PBS缓冲液重悬细胞， 再次离心弃上清。 用300L的PBS重悬细胞，。
24、 将细胞逐滴加入 700L 预冷的无水乙醇中， 乙醇终浓度为 70%， 4避光固定过夜。800r/ min 离心 10min， 去上清， PBS 清洗两次， 重悬细胞于 500L 含 100U/ml RNaseA Inhibitor 的 PBS 缓冲液中， 避光 37孵育 30min， 加 2mg/mL PI 至终浓度 50g/mL， 避光孵育 30min， 过 400 目筛。 0049 在流式细胞仪上计数细胞周期各期的细胞数目， 结果发现薏仁多糖诱导 A549 细 胞产生 S 期阻滞， 结果见图 2。 0050 （3） A549 细胞药物处理 72h， 把细胞培养液吸出至一合适离心管内， P。
25、BS 洗涤贴壁 细胞一次， 加入适量胰酶细胞消化液消化细胞。室温孵育至轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打 下来时， 吸除胰酶细胞消化液。加入收集的细胞培养液， 混匀， 转移到离心管内， 1000r/min 离心 5min， 弃上清， 收集细胞， 用 PBS 轻轻重。取 5-10 万重悬的细胞， 1000g 离心 5min， 弃上 清， 加入195L AnnexinV-FITC结合液轻轻重悬细胞。 加入5L Annexin V-FITC， 轻轻混 匀。室温 （20-25） 避光孵育 10min。可以使用铝箔进行避光。1000r/min 离心 5min， 弃上 清， 加入 190L Annexin V-F。
26、ITC 结合液轻轻重悬细胞。加入 10L 碘化丙啶染色液， 轻轻 混匀， 冰浴， 避光放置。 0051 随即进行流式细胞仪检测， 结果见图 3。A549 细胞凋亡率为 17.05% 0052 （4）分离制备单细胞悬液， 将载玻片的磨砂面向上， 40预热， 将预热 45的 100L 的 0.5% 正常熔点琼脂糖 （NMA） 铺于载玻片上， 盖上干净的盖玻片， 再置 4下 10min 使 NMA 凝固。将 10L 细胞 （约 104个） 和 75L 的 0.7% 低溶点琼脂糖 （LMA） （在 37下水 浴加热至少 20min 使之完全溶化） 混合均匀。轻轻揭去盖玻片， 迅速将含细胞的 LMA 滴。
27、到第 1 层琼脂糖上， 立即盖上另一干净盖玻片， 置 4 10min 使第 2 层 LMA 凝固。第 2 层 LMA 凝 固后， 室温下移去盖玻片， 滴加预热 37的 75L 的 0.7% 低溶点琼脂糖 LMA， 如上盖上盖玻 说 明 书 CN 102977221 A 6 5/6 页 7 片 4下凝固。移去盖玻片， 将玻片置于平皿中， 倒入预冷的细胞裂解液， 4裂解 12h， 取 出载玻片用 PBS 漂洗。将载玻片置于水平电泳槽。倒入新配制的碱性电泳缓冲， 约覆过载 玻片胶面 0.25cm 左右， 室温放置 2060min。在电压 25V， 电泳 2030min。电泳后将载玻片 置于平皿内。加。
28、入 0.4mmol/L Tris-HCl（pH7.5） 缓冲液， 将载玻片没入， 4中和三次， 每 次 10min， 弃去 Tris-HCl 缓冲液。每个载玻片加 20L 的 PI 染液， 盖上盖玻片， 避光染色 10min。激光共聚焦显微镜 543nm 波长的激发光观察。 0053 观察结果 ： 能够观察到典型的细胞凋亡型彗星图案， 结果见图 4。 0054 （5） 按总 RNA 提取试剂盒说明书抽提， 参照 Fermentas 试剂盒说明书对总 RNA 进行 反转录， 向逆转录后的 cDNA 添加 PCR 反应体系按下列条件进行 PCR。 0055 PCR 反应体系为 ： 0056 005。
29、7 PCR 循环条件 ： 93预变性 3min 后， 进行 35 个循环 （94变性 30s， 58退火 30s， 72延伸 45s） ， 72延伸 10min。 0058 PCR 结束后取 5uL 扩增产物溶液加入含 0.05 Goldview 的 2% 琼脂糖凝胶中， 并 加 Marker 作参照。在 1TAE 缓冲液中 100V 恒压电泳 30min。caspase-3、 caspase-9 和 -actin 引物序列见表 1。 0059 分析结果表明 ： 使用 300g/mL 薏仁多糖处理 A549 细胞增加了 caspase-3 和 caspase-9 基因的相对表达量， 表达结果见。
30、图 5。 0060 表 1 引物序列表 0061 0062 说 明 书 CN 102977221 A 7 6/6 页 8 0063 （6）使用免疫印迹实验 （Western blotting）测定薏仁多糖处理 A549 细胞后 caspase-3和caspase-9蛋白的相对表达量。 分析结果表明薏仁多糖处理增加了caspase-3 和 caspase-9 两种蛋白的相对表达量， 结果见图 6。 0064 薏仁多糖能够使 A549 细胞产生凋亡小体， 造成 S 期阻滞， 通过 Annexin V-FITC 和 PI 染色发现薏仁多糖造成 A549 细胞凋亡率显著上升， 通过单细胞凝胶电泳实验发。
31、现处理 后的 A549 产生典型的凋亡型彗星图案， 同时薏仁多糖使细胞内的 caspase-3、 caspase-9 基因和相应蛋白的相对表达量上调， 从而表明薏仁多糖能够诱导人非小细胞肺癌细胞 A549 细胞凋亡。 0065 因此， 由上述薏仁多糖的制备方法所制备得到的薏仁多糖可以应用在制备抗肿瘤 药物中及制备诱导细胞凋亡药物中。 说 明 书 CN 102977221 A 8 1/2 页 9 0001 0002 序 列 表 CN 102977221 A 9 2/2 页 10 序 列 表 CN 102977221 A 10 1/5 页 11 图 1 说 明 书 附 图 CN 102977221 A 11 2/5 页 12 图 2 说 明 书 附 图 CN 102977221 A 12 3/5 页 13 图 3 说 明 书 附 图 CN 102977221 A 13 4/5 页 14 图 4 说 明 书 附 图 CN 102977221 A 14 5/5 页 15 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 102977221 A 15 。