一种蝇蛆甲壳素、壳聚糖的制备工艺.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102993334 A (43)申请公布日 2013.03.27 CN 102993334 A *CN102993334A* (21)申请号 201210502403.7 (22)申请日 2010.03.30 201010135626.5 2010.03.30 C08B 37/08(2006.01) (71)申请人 甘肃农业大学 地址 730070 甘肃省兰州市安宁区营门村 1 号 (72)发明人 梁巧兰 徐秉良 师桂英 魏列新 薛应钰 杨顺义 宋文勇 (74)专利代理机构 北京中恒高博知识产权代理 有限公司 11249 代理人 高松 (54) 发明名称 一种蝇蛆甲壳。

2、素、 壳聚糖的制备工艺 (57) 摘要 本发明公开了一种蝇蛆甲壳素、 壳聚糖的制 备工艺及蝇蛆甲壳素在诱导深绿木霉 T2 菌株产 生几丁质酶中的应用， 属于生物技术领域。 其中蝇 蛆甲壳素的制备工艺主要是将传统的盐酸除钙工 艺改为 EDTA 除钙， 减少了废酸排放的环境污染， 避免了浓酸对甲壳素分子链的破坏， 获得了高品 质的甲壳素产品 ； 在蝇蛆壳聚糖的制备工艺中， 将高温浓碱回流4h的传统工艺改为氢氧化钠-戊 醇反应体系， 并采用微波加热处理两次， 提高了碱 液利用率， 极大的缩短了反应时间， 节约了能源消 耗， 获得了含水量低， 脱乙酰度较高的白色粉末状 壳聚糖产品。本发明的蝇蛆甲壳素还。

3、可以作为碳 源， 诱导深绿木霉 T2 菌株产生几丁质酶， 其诱导 效果显著。 (62)分案原申请数据 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 11 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 11 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种利用蝇蛆甲壳素制备壳聚糖的工艺， 其中， 所述蝇蛆甲壳素的制备是以蝇蛆为 原料制成粉体， 经 EDTA 除钙、 除蛋白质、 氧化及还原处理后制得甲壳素， 具体包括如下步 骤 ：（1） 原料预处理 ： 将干蝇蛆粉碎， 用水冲洗， 洗去大量的蛋白质成分， 将剩余蛆皮过滤收 集备用 ；（2。

4、） EDTA 除钙 ： 称取步骤 （1） 制得的清洁、 干燥的蝇蛆蛆皮， 用饱和 EDTA 溶液浸泡 20 30h， 除去钙质， 后过滤除去 EDTA， 并将蛆皮用水洗至中性 ；（3） 稀碱除蛋白质 ： 将步骤 （2） 处理过的蛆皮再用 8 12% NaOH 水溶液， 沸水浴 1.5 3h， 以水解蛋白质， 加热期间不 断搅拌， 且期间至少更换 4 次碱液， 加热结束， 除去碱液， 水洗至中性， 得到甲壳素粗品 ；（4） 精制制得成品 ： 将步骤 （3） 制得的甲壳素粗品， 用 0.3 0.8% KMnO4水溶液浸渍氧化 20 60min， 水洗除尽 KMnO4后， 再用 0.5 1.5% 草。

5、酸水溶液于 60 70下， 搅拌进行脱色反应 待产物变白为止， 将产物水洗至中性， 阴干， 得白色片状甲壳素 ； 其特征在于， 包括如下步骤 ： （1） 脱乙酰反应 将精制的蝇蛆甲壳素与 35 45% 的 NaOH- 戊醇溶液混合均匀， 置于 700 900W 微 波炉中， 以 95% 功率的微波条件进行脱乙酰反应， 处理 2 次， 每次 2 3min， 中途过滤更换 NaOH- 戊醇混合液一次 ； （2） 稀酸溶解 步骤 (1) 的反应结束后， 用热水洗涤产物至中性， 再用甲醇浸泡洗涤后， 将湿品溶于 4 6% 醋酸溶液中， 过滤除去不溶物 ； （3） 制得成品 将步骤 （2） 制得的产物再。

6、用 8 12% 的 NaOH 溶液中和， 析出胶体物， 离心洗涤至中性， 真空干燥， 研细， 得到白色壳聚糖粉末。 权 利 要 求 书 CN 102993334 A 2 1/11 页 3 一种蝇蛆甲壳素、 壳聚糖的制备工艺 0001 本申请是 “一种蝇蛆甲壳素、 壳聚糖的制备工艺及其在诱导深绿木酶 T2 菌株产生 几丁质酶中的应用” 的分案申请， 其申请号为201010135626.5、 申请日为2010年3月30日。 技术领域 0002 本发明涉及生物技术领域， 具体地， 一种蝇蛆甲壳素、 壳聚糖的制备工艺及其在诱 导深绿木酶 T2 菌株产生几丁质酶中的应用。 背景技术 0003 甲壳素 （。

7、Chitin） 又名几丁质、 甲壳质、 壳多糖、 聚乙酰氨基葡萄糖等， 化学名为 1， 4-2- 乙酰氨基 -2- 脱氧 -D- 葡聚糖， 是 N- 乙酰基 -D- 葡萄糖胺 （GlcNAc） 以 -1， 4 键 结合而成的直链多聚物 （C16H26O10N2） n。 广泛存在于甲壳纲动物虾、 蟹的甲壳、 昆虫的甲壳、 真 菌 （酵母， 霉菌） 、 藻类及植物的细胞壁中。壳聚糖 （Chitosan） 则是甲壳素脱去 C2乙酰基的 产物， 又名甲壳胺、 脱乙酰甲壳素、 可溶性甲壳素、 聚葡萄糖胺等， 化学名为聚 （1， 4） -2- 氨 基 -2- 脱氧 -B-D- 葡萄糖。 0004 目前国内。

8、甲壳素和壳聚糖的生产主要集中在沿海城市， 大多以虾、 蟹壳为原料， 以 蝇蛆为原料获取甲壳素和壳聚糖的甚少。由于来源不同， 蝇蛆甲壳素和壳聚糖的获取在工 艺条件上与虾、 蟹壳同类物质的获取是有差异的， 而目前提取蝇蛆甲壳素和壳聚糖所用方 法几乎是完全的套用以虾、 蟹壳为原料的提取工艺。这种以浓酸浓碱制备甲壳素和壳聚糖 的方法， 不仅成本高、 能耗大、 产品品质差， 而且会造成严重的环境污染。 0005 木霉菌 （Trichoderma spp.） 是最有开发利用潜力因而最受关注的一类植物病害 生物防治微生物， 产生几丁质酶是其主要生防作用机制之一。木霉分泌产生的一系列细胞 壁降解酶， 如葡聚糖。

9、酶、 几丁质酶、 纤维素酶、 蛋白酶等起着重要的作用， 其中以几丁质酶 尤为重要。目前以对哈茨木霉几丁质酶研究最为深入。据报道木霉几丁质酶在非诱导条件 下表达量很少， 而在诱导条件下大量产生， 其中内切几丁质酶产生较多， 并表现出极高的抑 菌活性。关于不同营养条件对哈茨木霉、 哈茨木霉 TM 菌株、 哈茨木霉 P1 菌株几丁质酶产生 的诱导效果国内外已有报道， 而且诱导产生的几丁质酶粗提物对多种病原真菌均有显著的 拮抗活性。有关利用蝇蛆甲壳素 （几丁质） 和蝇蛆壳聚糖 （脱乙酰几丁质多糖） 对深绿木霉 T2 菌株产生几丁质酶影响的研究尚未见报道。 发明内容 0006 本发明的目的是提出一种蝇蛆。

10、甲壳素、 壳聚糖的制备工艺， 解决了以浓酸浓碱制 备甲壳素和壳聚糖的传统工艺中存在的成本高、 能耗大、 产品品质差， 而且会造成严重的环 境污染的缺点。 0007 本发明的另一个目的是提出一种蝇蛆甲壳素在诱导深绿木酶 T2 菌株产生几丁质 酶中的应用。 0008 实现上述目的的技术方案如下 ： 说 明 书 CN 102993334 A 3 2/11 页 4 一种蝇蛆甲壳素的制备工艺， 以蝇蛆为原料制成粉体， 经除钙、 除蛋白质、 氧化及还原 处理后制得甲壳素， 所述除钙过程采用 EDTA 除钙法。 0009 进一步地， 蝇蛆甲壳素的制备工艺， 具体包括如下步骤 ： （1） 原料预处理 将干蝇蛆。

11、粉碎， 用水冲洗， 洗去大量的蛋白质成分， 将剩余蛆皮过滤收集备用 ； （2） EDTA 除钙 称取步骤 （1） 制得的清洁、 干燥的蝇蛆蛆皮， 用饱和 EDTA 溶液浸泡 20 30h， 除去钙 质， 后过滤除去 EDTA， 并将蛆皮用水洗至中性 ； （3） 稀碱除蛋白质 将步骤 （2） 处理过的蛆皮再用 8 12 NaOH 水溶液， 沸水浴 1.5 3h， 以水解蛋白质， 加热期间不断搅拌， 且期间至少更换 4 次碱液， 加热结束， 除去碱液， 水洗至中性， 得到甲壳 素粗品 ； （4） 精制制得成品 将步骤 （3） 制得的甲壳素粗品， 用 0.3 0.8 KMnO4水溶液浸渍氧化 20 。

12、60min， 水 洗除尽 KMnO4后， 再用 0.5 1.5草酸水溶液于 60 70下， 搅拌进行脱色反应待产物 变白为止， 将产物水洗至中性， 阴干， 得白色片状甲壳素。 0010 采用上述制备工艺制得的蝇蛆甲壳素为原料来制备壳聚糖， 其制备工艺包括如下 步骤 ： （1） 脱乙酰反应 将精制的蝇蛆甲壳素与 35 45的 NaOH- 戊醇溶液混合均匀， 置于 700 900W 微 波炉中， 以 95功率的微波条件进行脱乙酰反应， 处理 2 次， 每次 2 3min， 中途过滤更换 NaOH- 戊醇混合液一次 ； （2） 稀酸溶解 步骤 （1） 的反应结束后， 用热水洗涤产物至中性， 再用甲醇。

13、浸泡洗涤后， 将湿品溶于 4 6醋酸溶液中， 过滤除去不溶物 ； （3） 制得成品 将步骤 （2） 制得的产物再用 8 12的 NaOH 溶液中和， 析出胶体物， 离心洗涤至中 性， 真空干燥， 研细， 得到白色壳聚糖粉末。 0011 本发明还提供了蝇蛆甲壳素在诱导深绿木酶 T2 菌株产生几丁质酶中的应用， 以 蝇蛆甲壳素为碳源， 最佳产酶时间为 120h。 0012 与现有技术相比， 本发明具有如下有益效果 ： （1） 在蝇蛆甲壳素的制备工艺中， 将传统的盐酸除钙工艺改为 EDTA 除钙， 减少了废酸 排放的环境污染， 避免了浓酸对甲壳素分子链的破坏， 获得了高品质的甲壳素产品。 0013 。

14、（2）在蝇蛆壳聚糖的制备工艺中， 将高温浓碱回流 4h 的传统工艺改为氢氧化 钠 - 戊醇反应体系， 并采用微波加热处理两次， 提高了碱液利用率， 极大的缩短了反应时 间， 节约了能源消耗。获得了含水量低， 脱乙酰度较高的白色粉末状壳聚糖产品。 0014 （3） 本发明的蝇蛆甲壳素、 壳聚糖的优化制备工艺及蝇蛆甲壳素在诱导深绿木霉 T2 菌株产生几丁质酶中的应用， 可以通过下述试验得到进一步的说明。 0015 1 材料方法 说 明 书 CN 102993334 A 4 3/11 页 5 1.1 蝇蛆甲壳素和壳聚糖优化后的制备工艺流程 ： 1.2 蝇蛆甲壳素和壳聚糖提取 甲壳素提取 ： 将干蛆粉。

15、碎， 用水冲洗， 洗去大量的蛋白质成分， 将剩余蛆皮过滤收集备 用。称取清洁、 干燥的蝇蛆蛆皮， 用饱和 EDTA 溶液浸泡 24h， 除去钙质， 过滤除去 EDTA（回 收性再用） 。蛆皮用水洗至中性， 再用 10 NaOH 水溶液， 沸水浴 2h， 以水解蛋白质， 加热期 间不断搅拌， 并每隔半小时更换碱液。加热结束， 除去碱液， 水洗至中性， 得到甲壳素粗品。 然后用 0.5 KMnO4水溶液浸渍氧化 30min， 水洗除尽 KMnO4 后， 再用 1草酸 （H2C2O4） 水溶 液于 60 70下， 搅拌进行脱色反应约 40min， 待产物变白为止。水洗至中性， 阴干， 得白 色片状甲。

16、壳素。 0016 壳聚糖的提取 ： 称取精制的蝇蛆甲壳素与 40的 NaOH 正戊醇溶液混合均匀， 呈糊 状物。置于 800W 微波炉中， 以 95功率的微波条件进行脱乙酰反应， 处理 2 次， 每次 3min， 中途过滤更换戊醇 - 氢氧化钠混合液一次。反应结束后， 用热水洗涤至中性， 再用甲醇浸泡 洗涤后， 将湿品溶于 5醋酸 （CH2COOH） 溶 液中， 过滤除去不溶物， 再用 10 NaOH 溶液中 和， 析出胶体物， 离心洗涤至中性， 真空干燥， 研细， 得到白色的与淀粉十分相似的壳聚糖粉 末。 0017 1.3 蝇蛆甲壳素、 壳聚糖产品品质测定 （1） 蝇蛆甲壳素灰分测定 将瓷坩。

17、埚用 25盐酸溶液煮沸 10min， 放入 500 600马福炉中灼烧 30min， 待炉温 降到 200以下时取出坩埚， 置于干燥器中， 冷却 30min， 称重， 准确到 0.001g。 0018 精确称取样品2g置于坩埚内， 在300下灼烧2h， 使其完全炭化， 再将马福炉温度 升至 600灼烧 2h， 使全部变为灰白。关闭电源， 待冷却到 200时取出置于干燥器中冷却 30min 后称重， 再置于马福炉中灼烧 1h。如此反复， 直至前后重复不超过 0.2mg 为止。记录 试验数据。按下式计算蝇蛆甲壳素灰分含量。 0019 式中 M1为坩埚 + 样品重量 ； M2为坩埚 + 灰分重量 ；。

18、 M3为灼烧至恒重时坩埚重量 （2） 蝇蛆壳聚糖脱乙酰度及水分含量测定 脱乙酰度测定 ： 准确称取 500mg 壳聚糖样品， 置于 250ml 锥形瓶中， 加入 0.3mol/L HCl 标准溶液 20ml， 振荡溶解 （20 25） 1h 后， 滴加 0.1甲基橙指示剂 2 4 滴， 然后， 用 0.1mol/L NaOH 标准溶液滴定过量的盐酸， 当溶液颜色由红变橙时， 即为滴定终点， 按下式 计算蝇蛆壳聚糖脱乙酰度。 说 明 书 CN 102993334 A 5 4/11 页 6 0020 式中 N1为 HCl 摩尔浓度 ； V1为 HCl 的加入量 ； N2为 NaOH 摩尔浓度 ； 。

19、V2为 NaOH 的 加入量 ； W 为干燥样品质量 ； 0.016 为与 1ml 的 0.3mol/L 的 HCl 相当的胺基量。 0021 水分含量测定 ： 将称量瓶在 100恒温干燥箱内干燥 1h， 取出后放于干燥器中冷 却 30min， 用分析天平准确称重。随后， 在称量瓶中加入 2g 样品 （精确到 0.1mg） ， 置于恒温 干燥箱中， 在 105下干燥 2h， 取出称重， 反复干燥至恒重为止， 按下式计算蝇蛆壳聚糖水 分含量。 0022 式中 M1为样品干燥前重量 ； M2为样品干燥后重量 ； M3为称量瓶加样品重量 ； M4为 称量瓶重量 1.4 胶体几丁质 A 和胶态几丁质 。

20、B 的制备 胶体几丁质 A（用于酶活性诱导） ： 称取 2g 蝇蛆甲壳素， 加入少许蒸馏水研磨， 溶解在 35m l浓盐酸中， 4放置24h， 滤纸过滤到100mL无离子水中， 用稀氢氧化钠溶液中和， 加无 离子水补足到 200mL， 4下保存备用。 0023 胶态几丁质 B（用于酶活性测定） ： 称取 1g 蝇蛆甲壳素， 加入 4mL 丙酮研磨至糊状， 其间可适量加入丙酮， 充分研细。在 10下边研磨边缓缓加入浓盐酸 40mL， 几分钟后， 用玻 璃棉过滤， 然后将滤液缓缓加入到剧烈搅拌的 50乙醇中 （至少是滤液的 5 倍以上） ， 使胶 状几丁质沉淀析出。倾去上清液， 收集胶状几丁质， 。

21、用蒸馏水冲洗几次后使 pH 为 7， 置透析 袋透析过夜， 4下避光保存备用。 0024 1.5 蝇蛆甲壳素、 壳聚糖对深绿木霉 T2 菌株几丁质酶产生的影响 1.5.1 不同营养条件培养基的制备 PDA 培养基 （g/L） 、 PDB 液体培养基 （g/L） ： 马铃薯 200g， 葡萄糖 18g， 水 1000ml。 0025 SCMS 营养液 （mg/L） ： KH2PO4680mg， K2HPO4870mg， KCl 200mg， NH4NO31g， MgSO4 7H2O 200mg， CaCl2 200mg， FeSO42mg， ZnSO47H2O 2mg， Mn2SO4H2O 2m。

22、g， 蔗糖 5g， 蒸馏水定容至 1000ml， 用盐酸调 pH 值至 6.5。 0026 蝇蛆甲壳素培养基 （mg/L） ： 在 SCMS 营养液中加入胶态几丁质 A 200mL（含有蝇蛆 甲壳素成分 2g） 。 0027 壳聚糖培养基 （mg/L） ： 在 SCMS 营养液基础上加入 1蝇蛆壳聚糖溶液 100mL。 0028 1.5.2 孢子悬浮液的配制 挑取 PDA 平板上培养 3d 的深绿木霉 T2 菌株孢子， 采用血球计数板倍量稀释法进行孢 子量的计数， 用无菌水调配成 11010个 /mL 的孢子悬浮液。 0029 1.5.3 不同营养条件对深绿木霉 T2 菌株几丁质酶产生的影响 。

23、将配制好的 PDB、 SCMS 营养液、 蝇蛆甲壳素培养基和蝇蛆壳聚糖培养基培养基分别装 入 150mL 三角瓶， 每瓶 60mL 高压蒸汽灭菌， 冷却后于超净工作台上用移液枪吸取 1mL 深 绿木霉孢子悬浮液接种到装有不同培养基的三角瓶中， 在 28、 150r/min 的恒温摇床上培 养 9d， 从第 2d 开始每天取 30mL 制备几丁质酶粗提液， 30mL 培养液 4下 5000r/min 离心 10min， 取上清液。 在上清液中缓慢加入磨碎的分析纯硫酸铵晶体15g， 玻璃棒搅拌。 室温静 置过夜， 取沉淀。加 5mL 磷酸盐缓冲溶液溶解沉淀， 若出现浑浊， 再离心，（4， 8000。

24、r/min， 说 明 书 CN 102993334 A 6 5/11 页 7 10min） 取上清液， 用 0.2m 微孔滤膜过滤除分生孢子即得几丁质酶粗提液， 标记并在 4 下保存备用。 0030 1.5.4 深绿木霉 T2 菌株几丁质酶活性测定 1.5.4.1- 乙酰氨基葡萄糖量与吸光度标准曲线 ： 参照李华的方法。 0031 1.5.4.2 几丁质酶活性测定 将胶状几丁质B溶液1.5mL （含4mg几丁质） 、 0.1mol/L的乙酸缓冲液 （pH4.5） 0.5mL分 别加入编号的 4 组试管中， 再加入分别加入四种培养条件下几丁质酶粗提液 0.4mL， 37下 反应 3h 后， 10。

25、00r/min 离心 2mim， 取 1.5ml 上清液， 加入 0.1ml 的 3脱盐蜗牛酶和 0.15ml 的 1mol/L 磷酸缓冲液 （pH7.1） ， 37反应 1h， 以进一步水解内切几丁质酶、 几丁二糖酶所产 生的几丁质片段。并以同样处理的包括底物和酶 （加热失活） 的反应液为标准对照。紫外分 光光度计测定 420nm 处的光密度值 （OD） ， 根据标准曲线求得产生的 N- 乙酰氨基葡萄糖量。 以每小时分解胶体几丁质产生 1gN- 乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活单位 （U） 。 0032 1.6 不同营养条件下诱导培养的深绿木霉对 4 种病原菌抑制作用 采用平板对峙法测定经蝇蛆。

26、甲壳素培养基、 壳聚糖培养基培养的深绿木霉 T2 对草 坪草根腐病菌瓜果腐霉 Pythium.aphaniderma tum（Edson） Fitzpatrick 、 番茄灰霉 病菌 （Botrytis cinerea） 、 黄瓜黑星病菌 （Cladosporium cucvmerinum） 、 百合根腐病菌 （Fusarium.oxysporum） 的抑菌效果， 待供试菌长好后， 用直径 6mm 的打孔器取菌饼， 将以上 两种培养基培养的深绿木霉T2和供试病原菌同时置于PDA培养基的两边， 置于25条件下 培养， 以 PDA 培养基培养的深绿木霉 T2 和供试菌的对峙培养为对照， 每处理重复。

27、 3 次。对 峙培养 72 小时后， 记录菌落半径并观察抑菌作用， 统计拮抗系数。 0033 拮抗系数分级标准为 ： I 深绿木霉菌丝占据平皿 100， H 深绿木霉菌丝占据平皿 5/6， III深绿木霉菌丝占据平皿5/6， 2/3， IV深绿木霉菌丝占据平皿2/3， 1/2， V 深绿木霉菌丝占据平皿 1/2， 1/3， VI 病原菌菌丝占据平皿 100。 0034 2 结论 2.1 蝇蛆甲壳素和壳聚糖优化后的提取工艺流程与传统方法的比较 蝇蛆甲壳素提取中用 EDTA 代替盐酸 ： 虽然成本较盐酸高， 但容易回收， 可重复使用， 总 体成本并不增加， 而且还解决了使用盐酸后废酸处理、 环境污。

28、染及设备损耗等问题。 0035 蝇蛆甲壳素制备中脱乙酰过程在醇相溶液中进行， 并将回流加热装置改为微波炉 加热。 0036 醇相溶液的优势 ： 甲壳素脱乙酰反应实质上是酰胺的水解过程， 是 OH- 作为亲核 试剂进攻甲壳素中乙酰氨基， 并将其水解为氨基的过程。因此， OH- 亲核性越强， 越有利于 脱乙酰反应的进行。在水及低级醇类等极性溶剂中， 亲核试剂 OH- 被溶剂化了， 大大降低了 OH- 的亲核活性。而采用极性弱、 沸点较高的正戊醇， 可使反应中 OH- 的亲核性远强于在水 溶液或其他低级醇类溶液， 促进反应的正向进行。 0037 醇相反应体系加热最高可升温至139， 可极大的促进脱乙。

29、酰反应的进行。 一方面 反应需要一定的活化能， 所以温度升高有利于反应的进行， 另一方面， 温度低时 NaOH 不溶 于戊醇， 反应属固 - 固 - 液反应体系， 高温增加了 NaOH 在戊醇中的溶解度， 增大了反应物的 接触面积， 提高了反应发生的速率。 0038 微波加热的优势 ： 壳聚糖生产的传统工艺是在大量浓碱溶液中沸腾反应， 或在较 说 明 书 CN 102993334 A 7 6/11 页 8 低温度下反应数十小时之久， 才能得到脱乙酰度较高的产品。因此， 减少碱用量， 降低反应 温度， 缩短反应时间， 是减少原料消耗和能耗， 降低壳聚糖生产成本的关键。 0039 采用了 NaOH。

30、- 戊醇反应体系， 以半干法微波方式制备壳聚糖， 可获得脱乙酰度为 95.5的高质量壳聚糖产品， 且碱用量下降 10左右， 反应时间可由 4h 缩短为 6min。 0040 2.2 蝇蛆甲壳素、 壳聚糖产品品质 利用蝇蛆提取甲壳素提取率为 75； 经测定制备的蝇蛆甲壳素灰分含量为 17.3； 制 备的蝇蛆壳聚糖脱乙酰度为 95.5， 含水量为 8.36。 0041 2.3N- 乙酰氨基葡萄糖量与吸光度标准曲线 表 1 为在 420nm 处测定的不同浓度 N- 乙酰氨基葡萄糖的吸光值， 同时， 如图 1 所示， 以0.85减去吸光值的差值为纵坐标， 以N-乙酰氨基葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线，。

31、 并 对出该曲线进行拟合， 发现其呈现对数增长关系。根据以上曲线拟合的方程可求得不同糖 量对应的吸光度的关系， 关系式为 ： y 0.3651ln（x） +0.0029 表 1 不同浓度 N- 乙酰氨基葡萄糖量吸光值 2.4 蝇蛆甲壳素、 壳聚糖对深绿木霉 T2 菌株几丁质酶产生的影响 2.4.1 四种培养基对深绿木霉 T2 菌株几丁质酶产生的影响 通过四种不同营养条件的培养基对深绿木霉 T2 菌株几丁质酶产生影响试验， 结果表 明蝇蛆甲壳素培养基中深绿木霉 T2 菌株几丁质酶活性明显高于其他三种培养基的， 经方 差分析发现， 蝇蛆甲壳素培养基中几丁质酶活性与 PDB 培养基中几丁质酶活性之间。

32、存在极 显著差异， 其它两种培养基的酶活性介于二者之间， 表明蝇蛆甲壳素具有诱导深绿木霉 T2 菌株几丁质酶产生的作用 （表 2） 。 0042 表 2 四种培养基对深绿木霉 T2 菌株几丁质酶活性的影响 注 ： 大、 小写字母分别表示在 0.01、 0.05 水平上的显著性。 0043 2.4.2 四种培养基不同培养时间对深绿木霉 T2 菌株几丁质酶产生的影响 培养时间是影响深绿木霉几丁质酶产量的一个重要因素， 不同营养条件下培养 5d （第 120h测定） 的酶活性均出现高峰值， 其中蝇蛆甲壳素培养基的酶活性最高为1.8340U/mL， 对 说 明 书 CN 102993334 A 8 7。

33、/11 页 9 照培养基 （PDB 培养基） 的酶活性最低， 为 1.0967U/mL， 而壳聚糖培养基和 SCMS 营养液的酶 活值介于二者之间， 并且相差不大， 随后酶活值下降， 在第 7d 四种不同培养基深绿木霉几 丁质酶活值出现另一峰值， 但均低于第 5d 的酶活值， 同时蝇蛆甲壳素培养基的酶活性与其 他三种培养基的酶活值相差不大 ； 方差分析结果表明四种培养条件下深绿木霉几丁质酶在 第 5d 的酶活值均较其他培养天数的达极 显著差异。由此可以断定深绿木霉产几丁质酶的 最佳培养时间应为 120h（表 3） 。 0044 表 3 不同培养时间对深绿木霉 T2 菌株几丁质酶活性影响 注 ：。

34、 大、 小写字母分别表示在 0.01、 0.05 水平上的显著性。 0045 2.5 不同营养条件下培养的深绿木霉对 4 种病原菌抑制作用 对峙培养 72 小时后， 不同营养条件下诱导培养的深绿木霉 T2 菌株对草坪草根腐病 菌瓜果腐霉 Pythium.aphaniderma tum（Edson） Fitzpatrick 、 番茄灰霉病菌 （Botrytis cinerea） 、 黄 瓜 黑 星 病 菌 （Cladosporium cucvmerinum） 、 百 合 根 腐 病 菌 （Fusarium. oxysporum） 的生长均有抑制作用， 其中甲壳素培养基培养的深绿木霉 T2 菌株对。

35、四种病原 菌菌丝的生长抑制作用最为明显， 除对黑星菌的拮抗系数为 II 外， 其余均为 I ； 而壳聚糖培 养基培养的深绿木霉 T2 菌株对四种病原菌菌丝的生长抑制作用相差不大， 除了对灰霉菌 的拮抗系数为 III 外， 其余均为均为 II， 详见表 4。 0046 表 4 不同营养条件下深绿木霉 T2 对 3 种病原菌的抑制效果 附图说明 0047 图 1 为不同浓度 N- 乙酰氨基葡萄糖光密度图。 说 明 书 CN 102993334 A 9 8/11 页 10 具体实施方式 0048 实施例 1 本实施例为蝇蛆甲壳素的制备工艺， 按如下步骤进行制备 ： （1） 原料预处理 将干蝇蛆粉碎，。

36、 用水冲洗， 洗去大量的蛋白质成分， 将剩余蛆皮过滤收集备用 ； （2） EDTA 除钙 称取步骤 （1） 制得的清洁、 干燥的蝇蛆蛆皮， 用 （0.3mol/L） 饱和 EDTA 溶液浸泡 24h， 除 去钙质， 后过滤除去 EDTA（回收性再用） ， 并将蛆皮用水洗至中性 ； （3） 稀碱除蛋白质 将步骤 （2） 处理过的蛆皮再用 10 NaOH 水溶液， 沸水浴 2h， 以水解蛋白质， 加热期间 不断搅拌， 并每隔半小时更换碱液， 加热结束， 除去碱液， 水洗至中性， 得到甲壳素粗品 ； （4） 精制制得成品 将步骤 （3） 制得的甲壳素粗品， 用 0.5 KMnO4水溶液浸渍氧化 30。

37、min， 水洗除尽 KMnO4 后， 再用 1草酸 （H2C2O4） 水溶液于 60 70下， 搅拌进行脱色反应待产物变白为止， 将产 物水洗至中性， 阴干， 得白色片状甲壳素。 0049 实施例 2 本实施例为蝇蛆甲壳素的制备工艺， 按如下步骤进行制备 ： （1） 原料预处理 将干蝇蛆粉碎， 用水冲洗， 洗去大量的蛋白质成分， 将剩余蛆皮过滤收集备用 ； （2） EDTA 除钙 称取步骤 （1） 制得的清洁、 干燥的蝇蛆蛆皮， 用饱和 EDTA 溶液浸泡 20h， 除去钙质， 后过 滤除去 EDTA（回收性再用） ， 并将蛆皮用水洗至中性 ； （3） 稀碱除蛋白质 将步骤 （2） 处理过的蛆。

38、皮再用 8 NaOH 水溶液， 沸水浴 1.5h， 以水解蛋白质， 加热期间 不断搅拌， 并每隔半小时更换碱液， 加热结束， 除去碱液， 水洗至中性， 得到甲壳素粗品 ； （4） 精制制得成品 将步骤 （3） 制得的甲壳素粗品， 用 0.3 KMnO4水溶液浸渍氧化 60min， 水洗除尽 KMnO4 后， 再用 0.5草酸 （H2C2O4） 水溶液于 60 70下， 搅拌进行脱色反应待产物变白为止， 将 产物水洗至中性， 阴干， 得白色片状甲壳素。 0050 实施例 3 本实施例为蝇蛆甲壳素的制备工艺， 按如下步骤进行制备 ： （1） 原料预处理 将干蝇蛆粉碎， 用水冲洗， 洗去大量的蛋白质。

39、成分， 将剩余蛆皮过滤收集备用 ； （2） EDTA 除钙 称取步骤 （1） 制得的清洁、 干燥的蝇蛆蛆皮， 用饱和 EDTA 溶液浸泡 30h， 除去钙质， 后过 滤除去 EDTA（回收性再用） ， 并将蛆皮用水洗至中性 ； （3） 稀碱除蛋白质 将步骤 （2） 处理过的蛆皮再用 12 NaOH 水溶液， 沸水浴 3h， 以水解蛋白质， 加热期间 不断搅拌， 并每隔半小时更换碱液， 加热结束， 除去碱液， 水洗至中性， 得到甲壳素粗品 ； 说 明 书 CN 102993334 A 10 9/11 页 11 （4） 精制制得成品 将步骤 （3） 制得的甲壳素粗品， 用 0.8 KMnO4水溶液。

40、浸渍氧化 20min， 水洗除尽 KMnO4 后， 再用 1.5草酸 （H2C2O4） 水溶液于 60 70下， 搅拌进行脱色反应待产物变白为止， 将 产物水洗至中性， 阴干， 得白色片状甲壳素。 0051 实施例 4 本实施例为蝇蛆壳聚糖的制备工艺， 按如下步骤进行 ： （1） 脱乙酰反应 将精制的蝇蛆甲壳素与 40的 NaOH- 正戊醇溶液混合均匀， 置于 800W 微波炉中， 以 95功率的微波条件进行脱乙酰反应， 处理 2 次， 每次 3min， 中途过滤更换 NaOH- 正戊醇混 合液一次 ； （2） 稀酸溶解 步骤 （1） 的反应结束后， 用热水洗涤产物至中性， 再用甲醇浸泡洗涤后。

41、， 将湿品溶于 5醋酸溶液中， 过滤除去不溶物 ； （3） 制得成品 将步骤 （2） 制得的产物再用 10的 NaOH 溶液中和， 析出胶体物， 离心洗涤至中性， 真空 干燥， 研细， 得到白色壳聚糖粉末。 0052 实施例 5 本实施例为蝇蛆壳聚糖的制备工艺， 按如下步骤进行 ： （1） 脱乙酰反应 将精制的蝇蛆甲壳素与 35的 NaOH- 正戊醇溶液混合均匀， 置于 700W 微波炉中， 以 95功率的微波条件进行脱乙酰反应， 处理 2 次， 每次 2min， 中途过滤更换 NaOH- 正戊醇混 合液一次 ； （2） 稀酸溶解 步骤 （1） 的反应结束后， 用热水洗涤产物至中性， 再用甲醇。

42、浸泡洗涤后， 将湿品溶于 4醋酸溶液中， 过滤除去不溶物 ； （3） 制得成品 将步骤 （2） 制得的产物再用 8的 NaOH 溶液中和， 析出胶体物， 离心洗涤至中性， 真空 干燥， 研细， 得到白色壳聚糖粉末。 0053 实施例 6 本实施例为蝇蛆壳聚糖的制备工艺， 按如下步骤进行 ： （1） 脱乙酰反应 将精制的蝇蛆甲壳素与 35的 NaOH- 正戊醇溶液混合均匀， 置于 900W 微波炉中， 以 95功率的微波条件进行脱乙酰反应， 处理 2 次， 每次 2min， 中途过滤更换 NaOH- 正戊醇混 合液一次 ； （2） 稀酸溶解 步骤 （1） 的反应结束后， 用热水洗涤产物至中性， 。

43、再用甲醇浸泡洗涤后， 将湿品溶于 6醋酸溶液中， 过滤除去不溶物 ； （3） 制得成品 将步骤 （2） 制得的产物再用 12的 NaOH 溶液中和， 析出胶体物， 离心洗涤至中性， 真空 说 明 书 CN 102993334 A 11 10/11 页 12 干燥， 研细， 得到白色壳聚糖粉末。 0054 实施例 7 本实施例为蝇蛆甲壳素和蝇蛆壳聚糖对深绿木霉 T2 菌株几丁质酶产生的影响。 0055 （1） 制备 PDB、 SCMS 营养液、 蝇蛆甲壳素培养基和蝇蛆壳聚糖培养基 ： PDA 培养基 （g/L） 、 PDB 液体培养基 （g/L） ： 马铃薯 200g， 葡萄糖 18g， 水 1。

44、000ml。 0056 SCMS 营养液 （mg/L） ： KH2PO4680mg， K2HPO4870mg， KCl 200mg， NH4NO31g， MgSO47H2O 200mg， CaCl2200mg， FeSO42mg， ZnSO47H2O 2mg， Mn2SO4H2O 2mg， 蔗 糖 5g， 蒸 馏 水 定 容 至 1000ml， 用盐酸调 pH 值至 6.5。 0057 蝇蛆甲壳素培养基 （mg/L） ： 在 SCMS 营养液中加入胶态几丁质 A 200mL （含有蝇蛆 甲壳素成分 2g） 。 0058 壳聚糖培养基 （mg/L） ： 在 SCMS 营养液基础上加入 1蝇蛆壳聚。

45、糖溶液 100mL。 0059 （2） 几丁质酶粗提液 ： 将步骤 （1） 中配制好的蝇蛆甲壳素培养基和蝇蛆壳聚糖培养基分别装入 150mL 三角 瓶， 每瓶 60mL 高压蒸汽灭菌， 冷却后于超净工作台上用移液枪吸取 1mL 深绿木霉孢子悬浮 液接种到装有不同培养基的三角瓶中， 在 28、 150r/min 的恒温摇床上培养 9d， 从第 2d 开 始每天取 30mL 制备几丁质酶粗提液， 30mL 培养液 4下 5000r/min 离心 10min， 取上清液。 在上清液中缓慢加入磨碎的分析纯硫酸铵晶体 15g， 玻璃棒搅拌。室温静置过夜， 取沉淀。 加 5mL 磷酸盐缓冲溶液溶解沉淀， 。

46、若出现浑浊， 再离心，（4， 8000r/min， 10min） 取上清液， 用 0.2m 微孔滤膜过滤除分生孢子即得几丁质酶粗提液， 标记并在 4下保存备用。 0060 （3） 几丁质酶活性测定 ： 将胶状几丁质 B 溶液 1.5mL（含 4mg 几丁质） 、 0.1mol/L 的乙酸缓冲液 （pH4.5） 0.5mL 分别加入编号的 4 组试管中， 再分别加入四种培养条件下几丁质酶粗提液 0.4mL， 37下反 应 3h 后， 1000r/min 离心 2mim， 取 1.5ml 上清液， 加入 0.1ml 的 3脱盐蜗牛酶和 0.15ml 的 1mol/L 磷酸缓冲液 （pH7.1） ，。

47、 37反应 1h， 以进一步水解内切几丁质酶、 几丁二糖酶所产生 的几丁质片段。并以同样处理的包括底物和酶 （加热失活） 的反应液为标准对照。紫外分光 光度计测定 420nm 处的光密度值 （OD） ， 根据标准曲线求得产生的 N- 乙酰氨基葡萄糖量。以 每小时分解胶体几丁质产生 1g N- 乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活单位 （U） 。 0061 通过四种不同营养条件的培养基对深绿木霉 T2 菌株几丁质酶产生影响试验， 结 果表明蝇蛆甲壳素培养基中深绿木霉 T2 菌株几丁质酶活性明显高于其他三种培养基的， 比 PDB 液体培养基中深绿木霉 T2 菌株几丁质 酶活性高 1.13 倍， 且与其它。

48、三种培养基中深 绿木霉 T2 菌株几丁质酶活性之间存在极显著差异。 0062 实施例 8 本实施例为不同营养条件下培养的深绿木霉对 4 种病原菌抑制作用 （1） 四种供试病原菌 采用常规 PDA 平板培养基在 25恒温箱中培养草坪草根腐病菌瓜果腐霉 Pythium. aphaniderma tum（Edson） Fitzpatrick 、 番茄灰霉病菌 （Botrytis cinerea） 、 黄瓜黑星病 菌 （Cladosporium cucvmerinum） 、 百合根腐病菌 （Fusarium.oxysporum） 4 种供试病原菌。 0063 （2） 不同营养条件下培养的深绿木霉 T2 与四种病原菌的对峙培养 待供试菌长好后， 用直径 6mm 的打孔器取菌饼， 将以上两种培养基培养的深绿木霉 T2 说 明 书 CN 102993334 A 12 11/11 页 13 和供试病原菌同时置于PDA培养基的两边， 置于25条件下培养， 以PDA培养基培养的深绿 木霉 T2 和供试菌的对峙培养为对照， 每处理重复 3 次。对峙培养 72 小时后， 记录菌落半径 并观察抑菌作用， 统计拮抗系数。 0064 拮抗系数分级标准为 ： I 深绿木霉菌丝占据平皿 100， II 深绿木霉菌丝占据平皿 5/6， III深绿木。