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1、10申请公布号CN104046595A43申请公布日20140917CN104046595A21申请号201410292500722申请日20140626C12N7/00200601C12R1/9320060171申请人中国科学院武汉病毒研究所地址430071湖北省武汉市武昌小洪山中区44号72发明人唐霜张忠夏菡范兆军李天宪74专利代理机构沈阳晨创科技专利代理有限责任公司21001代理人张晨54发明名称一种提高禽流感病毒分离率的鸡胚胚体分离方法57摘要一种提高禽流感病毒分离率的鸡胚胚体分离方法属病毒的分离接种技术领域。按照以下步骤进行收获样品接种鸡胚的尿囊液、胚体，混合研磨，25004500R。
2、PM离心1020MIN；取上清，继续尿囊腔途径盲传，接种样品0103ML/胚。本发明在鸡胚水平的流感病毒分离的传统传代方法基础上，通过增加处理病毒可感染的靶组织，采用胚体与尿囊液混合研磨接种的传代方式，成功提高了野外样品的流感病毒分离率，尤其对因高温、强紫外线等特殊生境难以新鲜采集或质量不太理想的野外样本进行“挽救性”的病毒分离，提供了一个有效、可明显提高病毒分离率的处理方法。51INTCL权利要求书1页说明书6页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页10申请公布号CN104046595ACN104046595A1/1页21一种提高禽流感病毒分离率的鸡胚胚体分。
3、离方法，其特征在于按照以下步骤进行收获样品接种鸡胚的尿囊液、胚体，混合研磨，25004500RPM离心1020MIN；取上清，继续尿囊腔途径盲传，接种样品0103ML/胚。2按照权利要求1所述的一种提高禽流感病毒分离率的鸡胚胚体分离方法，其特征在于所述的尿囊液、胚体混合时，尿囊液的体积与胚体组织的质量比为13ML/G。权利要求书CN104046595A1/6页3一种提高禽流感病毒分离率的鸡胚胚体分离方法技术领域0001本发明涉及病毒的分离接种技术，特别涉及一种提高禽流感病毒分离率的鸡胚胚体分离方法。背景技术0002鸡胚分离病毒是一种经典的病毒分离方法，来自禽类的病毒，均可在鸡胚中繁殖，哺乳动物。
4、的病毒如蓝舌病病毒、流感病毒等也可在鸡胚中增殖，近期发现CCHFV病毒也可在鸡胚中增殖。目前鸡胚尤其是SPF鸡胚被广泛利用于分离病毒、制造疫苗和抗原等，其来源丰富，操作简便。除病毒外，衣原体、立克次氏体也可用鸡胚来培养。常用的鸡胚接种的途径一般分为3种绒毛尿囊腔接种、绒毛尿囊膜接种、尿囊腔接种、羊膜腔接种、卵黄囊接种。其中尿囊腔接种的方法适用于新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、腺病毒、禽流感病毒等病原的分离。近年来，H5N1、H1N1、H7N9等流感病毒肆虐，WHO历年在应对全球性流感病毒防控时，都推荐使用接种鸡胚尿囊腔的方法来进行流感病毒的分离。0003传统禽流感病毒鸡胚尿囊腔传代方法般采用孵。
5、化911日龄的鸡胚，暗室内画出气室边缘和胚头位置，气室朝上立于卵架上，消毒操作部位，在胚头一侧气室边缘上方05CM处打一针孔；进针至尿囊腔内接种样品0102ML/胚，以融化的石蜡封孔，气室朝上立于卵架上继续孵化，弃去24H内死亡鸡胚，至96小时全部取出于4冰箱过夜。收毒无菌操作打开气室部位蛋壳，撕开壳膜、尿囊膜和羊膜,吸出尿囊液，肉眼观察鸡胚病理变化，尿囊液进行HA效价测定。对于HA效价18的样品，取上一代收获尿囊液继续以相同接种方式和剂量盲传3代。在实际应用中，我们发现对于野外样品迁徙鸟粪、禽粪等，存在外部环境的不可控性，样本质量良莠不齐，即便对于同样的一批样本，因为各种不同的因素的影响，病。
6、毒分离率不尽相同。发明内容0004针对上述问题，本发明提供一种提高禽流感病毒分离率的鸡胚胚体分离方法，采用增加处理病毒可感染的靶组织从而达到增加病毒分离几率的目的，因此提高了病毒的分离率。0005本发明一种提高禽流感病毒分离率的鸡胚胚体分离方法，按照以下步骤进行收获样品接种鸡胚的尿囊液、胚体，混合研磨，25004500RPM离心1020MIN；取上清，继续尿囊腔途径盲传，接种样品0103ML/胚。0006所述的尿囊液、胚体混合时，尿囊液的体积与胚体组织的质量比为13ML/G。0007本发明在鸡胚水平的流感病毒分离的传统传代方法基础上，通过增加处理病毒可感染的靶组织，采用胚体与尿囊液混合研磨接种。
7、的传代方式，成功提高了野外样品的流感病毒分离率，尤其对因高温、强紫外线等特殊生境难以新鲜采集或质量不太理想的野外样本进行“挽救性”的病毒分离，提供了一个有效、可明显提高病毒分离率的处理方法。说明书CN104046595A2/6页4具体实施方式0008实施例10009采用传统鸡胚尿囊腔传代法和本发明鸡胚胚体混合传代法，进行禽流感病毒分离率比较。同一份样品同时采用两种方法，分别各接种一枚鸡胚。0010样品为2008年青海省某县新鲜疑似禽流感野鸟样品196份。具体操作方法如下采用孵化911日龄的鸡胚63枚，经照视后划出气室及胚胎位置，于气室侧方打一针孔；胚胎位置朝上横置卵架上，直接进针尿囊腔内接种样。
8、品02ML/胚，以融化的石蜡封孔闭两个针孔，气室朝上立于卵架上继续孵化，弃去24小时内死亡鸡胚，至96小时全部取出于4冰箱过夜。收毒无菌操作打开气室部位蛋壳，撕开壳膜、尿囊膜和羊膜，吸出尿囊液，肉眼观察鸡胚病理变化如胚体发育不良、有出血点、充血或出血等，同时收获鸡胚胚体组织，尿囊液进行HA效价测定。传代HA实验阴性的样品，无菌取第1代尿囊液15ML，取胚体组织约1G，研磨，3000RPM离心15MIN，取上清02ML直接进针尿囊腔内接种样品，作为第2代；96小时后收毒，检测尿囊液HA效价，HA实验仍为阴性的样品，无菌取第2代尿囊液及胚胎组织，按上述同样方式进行盲传第3代，尿囊液进行HA效价测定。
9、。结果见表1。0011比较例10012样品为2008年青海省某县新鲜疑似禽流感野鸟样品196份。具体操作方法如下采用孵化911日龄的鸡胚63枚，经照视后划出气室及胚胎位置，于气室侧方打一针孔；胚胎位置朝上横置卵架上，直接进针尿囊腔内接种样品02ML/胚，以融化的石蜡封孔闭两个针孔，气室朝上立于卵架上继续孵化，弃去24小时内死亡鸡胚，至96小时全部取出于4冰箱过夜。收毒无菌操作打开气室部位蛋壳，撕开壳膜、尿囊膜和羊膜，吸出尿囊液，肉眼观察鸡胚病理变化如胚体发育不良、有出血点、充血或出血等，尿囊液进行HA效价测定。传代HA实验阴性的样品，无菌取第1代尿囊液02ML按上述同样方式进行盲传第2代，96。
10、小时后收毒，检测尿囊液HA效价，HA实验仍为阴性的样品，无菌取第2代尿囊液02ML按上述同样方式进行盲传第3代，尿囊液进行HA效价测定。结果见表1。0013表12008年青海省某县新鲜疑似禽流感野鸟样品病毒分离方法比较实验结果00140015注00161传统传代法简称“传统法”，改进传代法简称“改进法”。00172N为待检样品的数量。说明书CN104046595A3/6页500183结果判断HA效价132判为分离获得流感病毒。0019实施例20020采用传统鸡胚尿囊腔传代法和本发明鸡胚胚体混合传代法，进行禽流感病毒分离率比较。同一份样品同时采用2种方法，分别各接种一枚鸡胚。0021样品为200。
11、9年浙江某县非新鲜疑似禽流感野鸟样品63份。具体操作方法如下采用孵化911日龄的鸡胚63枚，经照视后划出气室及胚胎位置，于气室侧方打一针孔；胚胎位置朝上横置卵架上，直接进针尿囊腔内接种样品02ML/胚，以融化的石蜡封孔闭两个针孔，气室朝上立于卵架上继续孵化，弃去24小时内死亡鸡胚，至96小时全部取出于4冰箱过夜。收毒无菌操作打开气室部位蛋壳，撕开壳膜、尿囊膜和羊膜，吸出尿囊液，肉眼观察鸡胚病理变化如胚体发育不良、有出血点、充血或出血等，同时收获鸡胚胚体组织，尿囊液进行HA效价测定。传代HA实验阴性的样品，无菌取第1代尿囊液15ML，取胚体组织约1G，研磨，3000RPM离心15MIN，取上清0。
12、2ML直接进针尿囊腔内接种样品，作为第2代；96小时后收毒，检测尿囊液HA效价，HA实验仍为阴性的样品，无菌取第2代尿囊液及胚胎组织，按上述同样方式进行盲传第3代，尿囊液进行HA效价测定。结果见表2。0022比较例20023样品为2009年浙江某县疑似禽流感野鸟样品63份。具体操作方法如下采用孵化911日龄的鸡胚63枚，经照视后划出气室及胚胎位置，于气室侧方打一针孔；胚胎位置朝上横置卵架上，直接进针尿囊腔内接种样品02ML/胚，以融化的石蜡封孔闭两个针孔，气室朝上立于卵架上继续孵化，弃去24小时内死亡鸡胚，至96小时全部取出于4冰箱过夜。收毒无菌操作打开气室部位蛋壳，撕开壳膜、尿囊膜和羊膜，吸。
13、出尿囊液，肉眼观察鸡胚病理变化如胚体发育不良、有出血点、充血或出血等，尿囊液进行HA效价测定。传代HA实验阴性的样品，无菌取第1代尿囊液02ML按上述同样方式进行盲传第2代，96小时后收毒，检测尿囊液HA效价，HA实验仍为阴性的样品，无菌取第2代尿囊液02ML按上述同样方式进行盲传第3代，尿囊液进行HA效价测定。结果见表2。0024表22009年浙江某县非新鲜疑似禽流感野鸟样品病毒分离方法比较实验结果00250026实施例30027采用传统鸡胚尿囊腔传代法和本发明鸡胚胚体混合传代法，进行禽流感病毒分离率比较。同一份样品同时采用两种方法，分别各接种一枚鸡胚。说明书CN104046595A4/6页。
14、60028样品为2013年江西某县非新鲜疑似禽流感野鸟样品106份。每一份样品同时采用两种方法分别各接种一枚鸡胚。具体操作方法如下采用孵化911日龄的鸡胚63枚，经照视后划出气室及胚胎位置，于气室侧方打一针孔；胚胎位置朝上横置卵架上，直接进针尿囊腔内接种样品02ML/胚，以融化的石蜡封孔闭两个针孔，气室朝上立于卵架上继续孵化，弃去24小时内死亡鸡胚，至96小时全部取出于4冰箱过夜。收毒无菌操作打开气室部位蛋壳，撕开壳膜、尿囊膜和羊膜，吸出尿囊液，肉眼观察鸡胚病理变化如胚体发育不良、有出血点、充血或出血等，同时收获鸡胚胚体组织，尿囊液进行HA效价测定。传代HA实验阴性的样品，无菌取第1代尿囊液1。
15、5ML，取胚体组织约1G，研磨，3000RPM离心15MIN，取上清02ML直接进针尿囊腔内接种样品，作为第2代；96小时后收毒，检测尿囊液HA效价，HA实验仍为阴性的样品，无菌取第2代尿囊液及胚胎组织，按上述同样方式进行盲传第3代，尿囊液进行HA效价测定。结果见表3。0029比较例30030样品为2013年江西某县非新鲜疑似禽流感野鸟样品106份。每一份样品同时采用两种方法分别各接种一枚鸡胚。具体操作方法如下采用孵化911日龄的鸡胚63枚，经照视后划出气室及胚胎位置，于气室侧方打一针孔；胚胎位置朝上横置卵架上，直接进针尿囊腔内接种样品02ML/胚，以融化的石蜡封孔闭两个针孔，气室朝上立于卵架。
16、上继续孵化，弃去24小时内死亡鸡胚，至96小时全部取出于4冰箱过夜。收毒无菌操作打开气室部位蛋壳，撕开壳膜、尿囊膜和羊膜，吸出尿囊液，肉眼观察鸡胚病理变化如胚体发育不良、有出血点、充血或出血等，尿囊液进行HA效价测定。传代HA实验阴性的样品，无菌取第1代尿囊液02ML按上述同样方式进行盲传第2代，96小时后收毒，检测尿囊液HA效价，HA实验仍为阴性的样品，无菌取第2代尿囊液02ML按上述同样方式进行盲传第3代，尿囊液进行HA效价测定。结果见表3。0031表32013年江西省某县非新鲜疑似禽流感野鸟样品病毒分离方法比较实验结果00320033从以上实施例可以看出，采用本发明“改进法”分离病毒增加。
17、了接种处理病毒可感染的靶组织研磨上清。结果显著提高了病毒分离率，经统计学分析表1，表2，表3“改进法”病毒分离率比传统接种方法提高了1447倍，其中非新鲜野外样品的病毒分离率的提高更加显著。0034实施例4说明书CN104046595A5/6页70035采用本发明鸡胚尿囊接种法与实施例3相同，不同点在于无菌取第1代尿囊液1ML，取胚体组织约1G，研磨，2500RPM离心20MIN，取上清03ML直接进针尿囊腔内接种样品，作为第2代；96小时后收毒，检测尿囊液HA效价，HA实验仍为阴性的样品，无菌取第2代尿囊液及胚胎组织，按上述同样方式进行盲传第3代，尿囊液进行HA效价测定。0036比较例400。
18、37采用传统鸡胚尿囊接种法传代与实施例3相同，不同点在于HA实验阴性的样品，无菌取第1代尿囊液03ML按上述同样方式进行盲传第2代，96小时后收毒，检测尿囊液HA效价，HA实验仍为阴性的样品，无菌取第2代尿囊液03ML按上述同样方式进行盲传第3代，尿囊液进行HA效价测定。0038结果如下00390040实施例50041鸡胚尿囊接种法与实施例3相同，不同点在于无菌取第1代尿囊液3ML，取胚体组织约1G，研磨，4500RPM离心10MIN，取上清01ML直接进针尿囊腔内接种样品，作为第2代；96小时后收毒，检测尿囊液HA效价，HA实验仍为阴性的样品，无菌取第2代尿囊液及胚胎组织，按上述同样方式进行盲传第3代，尿囊液进行HA效价测定。0042比较例50043采用传统鸡胚尿囊接种法传代与实施例3相同，不同点在于HA实验阴性的样品，无菌取第1代尿囊液01ML按上述同样方式进行盲传第2代，96小时后收毒，检测尿囊液HA效价，HA实验仍为阴性的样品，无菌取第2代尿囊液01ML按上述同样方式进行盲传第3代，尿囊液进行HA效价测定。0044结果如下0045说明书CN104046595A6/6页8说明书CN104046595A。