基因检测芯片及其用途.pdf

本发明提供了一种用于测定IL－1B基因型的基因芯片，包含该基因芯片的试剂盒和使用该芯片或试剂盒测定IL－1B基因型的方法。本发明的产品和方法可用于检测幽门螺杆菌感染者胃癌易感基因，为预测胃癌发生危险提供必要信息。

1.  一种用于测定IL-1B基因型的基因芯片，包括固相支持物和固定在所述固相支持物上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包含以下序列中分别包括-31位和-511位在内的18-28个连续核苷酸，其中，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2包含-31，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4包含-511位，
SEQ ID NO：1：acagagaaatttctcagcctcctacttctgcttttgaaagcCataaaaacagcgagggagaaactggcagatacca
SEQ ID NO：2：acagagaaatttctcagcctcctacttctgcttttgaaagcTataaaaacagcgagggagaaactggcagatacca
SEQ ID NO：3：ctcagaggctcctgcaattgacagagagctccTgaggcagagaacagcacccaaggtagagacccacacc
SEQ ID NO：4：ctcagaggctcctgcaattgacagagagctccCgaggcagagaacagcacccaaggtagagacccacacc。

2.  如权利要求1所述的基因芯片，所述-31位和-511位分别位于所在探针的中部。

3.  如权利要求1所述的基因芯片，所述探针的5′端还包含一段氨基修饰的0-25聚的聚脱氧胸苷酸。

4.  一种非以诊断为目的测定IL-1B基因型的方法，包括以下步骤：
(1)制备染色体DNA；
(2)用聚合酶链反应方法扩增IL-1B基因中包含-31位和/或-511位的基因片段；
(3)标记以上所得扩增产物；
(4)将所得标记扩增产物与权利要求1所述基因芯片杂交；
(5)检测基因芯片的杂交信号。

5.  如权利要求4所述的测定方法，其中的步骤(2)包括分别在各自独立的扩增体系中扩增包含-31位基因的片段和包含-511位基因的片段。

6.  如权利要求4所述的测定方法，步骤(5)中检测杂交信号的方法选自碱性磷酸酶催化的四氮唑蓝显色反应，辣根过氧化物酶催化的5-溴-4-氯-3-吲哚酚-磷酸-4-甲苯胺盐显色反应或辣根过氧化物酶催化的四甲基联苯胺显色反应或荧光检测。

7.  一种用于测定IL-1B基因型的试剂盒，该试剂盒包含权利要求1所述的基因芯片和使用说明书。

基因检测芯片及其用途
                             技术领域
本发明涉及基因分析检测产品，具体地说是基因检测芯片，更具体的说是适用于测定IL-1B基因型的基因检测芯片。本发明还涉及测定IL-1B基因型的方法。
                             背景技术
Helicobacter pylori(幽门螺杆菌)曾感染过世界近一半的人口，也是胃癌发病机理中很重要的一点。1994年国际癌症研究中心(IARC)已把幽门螺杆菌列为I类致癌物。它首先引起胃炎，进而导致胃黏膜萎缩，再逐步演化为胃癌。幽门螺杆菌致癌作用的机理还不清楚。目前一个普遍的解释是宿主的遗传特性决定了对幽门螺杆菌诱导的免疫和炎症反应。幽门螺杆菌诱导的胃癌的关键因素是胃酸的分泌。当幽门螺杆菌存在的条件下，可以诱发宿主产生一种白细胞介素(Interleukin)-1β(即IL-1β)，它是一种对胃生理学有深刻作用的重要炎症前期细胞因子。其独特的胃酸抑制特征使其成为在宿主对幽门螺杆菌感染的反应以及幽门螺杆菌感染相关疾病中的重要参与者而倍受重视。编码IL-1β的基因是IL-1B，该基因位于人类染色体2q上。其中IL-1B中三个双等位基因的多态性已有报道，均为C-T碱基颠换，位于从转录起始位点开始的-511、-31和+3954碱基对(base pairs)处。并且在这三个位点之间存在连锁不平衡。已经发现IL-1B-31C/+、IL-1B-31C/IL-1B-511T在对幽门螺杆菌感染的反应中均可增加胃酸过少和胃萎缩甚至胃癌的危险，与肿瘤相关性高达46％(Nature.2000，404：398-402)。因此研究IL-1B-31位和IL-1B-511位的基因型可以使临床从幽门螺杆菌感染者中筛选出胃癌高危人群，将有助于预测胃癌发生危险和提前采取针对性治疗，对临床意义重大(Gut.2001，48：743-747)。目前的科研单位可以采用聚合酶链式反应-单股链构象多态性(PCR-SSCP)、手工或自动测序、异源双链分析等方法，所有这些都需经过电泳环节，不仅操作繁琐，检测周期长，而且影响检测结果的因素多，不易控制，难以满足临床检验的要求，使临床至今还无法开展有关幽门螺杆菌感染者胃癌易感基因的检测。
基因芯片是近几年在高科技领域内出现的最具时代特征的重大科技进展之一。它是将能反映样本中大量基因信息的基因探针(寡核苷酸探针、cDNA克隆、PCR产物等)，有序固定在固相支持物(如醛基、氨基、巯基、羧基等活性基团修饰的载玻片或硅片、尼龙膜、硝酸纤维素膜)上形成阵列，通过与实际样本(或扩增产物)进行杂交反应，只需一次实验，就可高通量获得所有待检基因的信息。这种平行检测、高信息通量的特点使其在基因表达、基因多态性检测等方面的应用受到广泛重视。用基因芯片检测IL-1B基因的-31位和IL-1B-511位的多态性，发挥基因芯片检测操作简单、结果准确的特点，对于临床从胃病患者中筛选出胃癌高危人群，预测胃癌发生危险具有重要的现实意义。
                             发明内容
技术问题
本发明的目的在于提供一种用于测定IL-1B基因型的基因检测芯片。
本发明的目的还在于提供一种IL-1B基因型的方法
技术方案
为了实现本发明的目的，本发明提供了一种基因芯片，包括固相支持物和有序固定在所述固相支持物上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包含以下序列中分别包括-31位和-511位在内的18-28个连续核苷酸，其中，SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2包含-31，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4包含-511位：
-31C：acagagaaatttctcagcctcctacttctgcttttgaaagcCataaaaacagcgagggagaaactggcagatacca(SEQ ID NO：1)
-31T：acagagaaatttctcagcctcctacttctgcttttgaaagcTataaaaacagcgagggagaaactggcagatacca(SEQ ID NO：2)
-511T：ctcagaggctcctgcaattgacagagagctccTgaggcagagaacagcacccaaggtagagacccacacc(SEQ ID NO：3)
-511C：ctcagaggctcctgcaattgacagagagctccCgaggcagagaacagcacccaaggtagagacccacacc(SEQ ID NO：4)。
为了增强检测信号的强度，提高检测结果的准确率，所述-31位和-511位最好位于所在探针的中部。
所述探针还可以在其5′端包含一段氨基修饰的0-25聚的聚脱氧胸苷酸(聚dT)。
所述固相支持物可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基、异硫氰酸基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。
本发明基因芯片的制备可采用生物芯片的常规制造方法。例如，如果固相支持物采用的是修饰玻片或硅片，探针的5′端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后用点样仪将其点在修饰玻片或硅片，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的基因芯片。如果寡核苷酸探针不含氨基修饰，则其制备方法也可参照：王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.L.Derisi，V.R.Iyer，P.O.Brown.Exploring themetablic and genetic control of gene expression on a genomic scale.Science，1997，278：680和马立人，蒋中华 主编.生物芯片.北京：化学工业出版社，2000，1-130。
本发明还提供了一种测定IL-1B基因型的方法，包括以下步骤：
(1)制备染色体DNA；
(2)用聚合酶链反应(PCR)方法扩增IL-1B基因中包含-31位和/或-511位的基因片段；
(3)标记以上所得扩增产物；
(4)将所得标记扩增产物与基因芯片杂交；
(5)检测基因芯片的杂交信号。
制备用于PCR扩增的染色体DNA的方法有很多，可以从全血中制备、也可以从发根中制备，还可以从口腔粘膜的脱落物中制备。具体方法可参阅文献(丁振诺，苏明权主编.《临床PCR基因诊断技术》，世界图书出版公司.1998年第一版)。
用PCR方法扩增染色体基因特定片段的方法已经是本领域公知技术。其中的关键在于引物设计，有关引物设计的方法、软件均可以从商业途径获得。本发明涉及的白介素1B基因-31位和-511位的扩增引物和体系可根据上述各种方法及有关文献(KB穆里斯，F.费里，R.吉布斯等主编《PCR聚合酶链式反应》，科学出版社)记载的方法由使用者独立完成。
在所述步骤(2)中，可以扩增同时包含-31位和-511位基因的片段，此时只需采用-31位上游地上游引物和-511位下游的下游引物组成引物对即可。但是，此时，由于扩增片段较大，杂交时空间位阻大，杂交信号较弱。因此，要获得较好的扩增效果及杂交效果，可以分别在各自独立的扩增体系中扩增包含-31位基因的片段和包含-511位基因的片段。
对扩增产物进行标记可以通过采用5′端带标记基团的引物进行扩增的方法，也可通过在扩增过程中掺入带标记基团的单核苷酸的方法加以实现，所述标记基团包括但不限于：地高辛分子(DIG)、生物素分子(Bio)、荧光素及其衍生物分子(FITC等)、其他荧光分子(如Cy3、Cy5等)、碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)等。这些标记及其标记方法都已是本领域众所周知的常规技术，也可以参照王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.萨姆布鲁克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯主编，《分子克隆实验指南》，科学出版社，1995年；马立人，蒋中华主编，《生物芯片》，北京：化学工业出版社，2000，1-130。
带标记的扩增产物与基因芯片杂交前，先将扩增产物变性。此时，可采用常规变性方法变性PCR扩增产物。此类方法例如将扩增产物加热至94～98℃，并保温2～10min，然后迅速置冰上。或者，也可采用碱变性然后中和的方法。如果对-31位和-511位的两个基因片是分别扩增的，分析时两管扩增产物可以先混合，然后一起变性，也可以先一起变性，然后再混合。
将所述扩增产物与基因芯片杂交时，可以先将基因芯片与预杂交缓冲液进行预杂交。
本发明扩增产物与基因芯片之间的固相杂交按照本领域的经典方法进行，本领域一般人员依据经验容易确定有关缓冲液、探针和样品浓度、预杂交温度、杂交温度以及时间等的最适条件。或者也可参照王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.萨姆布鲁克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯主编，《分子克隆实验指南》，科学出版社，1995年。
然后根据标记信号在基因芯片上的位置、强度等信息获取待测信息。本发明所述检测基因芯片杂交信号的方法是基于与抗生物素抗体或亲合素或链亲合素或抗地高辛抗体或抗荧光素抗体复合在一起的碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶催化的四氮唑蓝(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚酚-磷酸-4-甲苯胺盐(BCIP)或四甲基联苯胺(TMB)的显色反应。具体方法可参照王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》。若扩增产物用荧光基团标记，也可以直接用荧光检测设备(如激光共聚焦扫描仪Scanarray3000等)获取待测信息。
本发明还提供一种用于测定IL-1B基因型的试剂盒，该试剂盒包含本发明所说的基因芯片和使用说明书。
有益效果
本发明提供基因芯片及其试剂盒，可用于检测幽门螺杆菌感染者胃癌易感基因，这为临床从胃病患者中筛选出胃癌高危人群，预测胃癌发生危险并提供有针对性的治疗提供了一种简便易行的解决方案。
                           附图说明
图1：本发明基因芯片上的一种点样列阵；
图2：用本发明基因芯片检测IL-B1基因型所得结果的照片。
以下实施例是对本发明的更详细的说明，而不是对本发明范围的限定。
                           具体实施方式
                        实施例1：基因芯片的制备
(1)购置醛基修饰的载玻片(产品编号：BSM03011，上海百傲科技有限公司)。人工合成(上海生工生物工程技术服务有限公司)以下探针，用水溶解成(100pmol/ul)浓度，然后用2×点样缓冲液(产品编号：BST02010，上海百傲科技有限公司)等比混合。接着，用Affymetrix公司的GSM417点样仪按说明书所述方法点制如图1的阵列。然后室温放置过夜。记为A芯片。
其中各探针序列为：
-31T：5′NH₂(dT)₂₅ tgcttttgaaagcTataaaaac 3′(22聚)(SEQ ID NO：5)
-31C：5′NH₂(dT)₂₅ tgcttttgaaagcCataaaaa 3′(21聚)(SEQ ID NO：6)
-511T：5′NH₂(dT)₂₅ agagagctccTgaggcagag 3′(20聚)(SEQ ID NO：7)
-511C：5′NH₂(dT)₂₅ gagagctccCgaggcaga 3′(18聚)(SEQ ID NO：8)
(2)购置硅片(3时抛光硅片，上海硅材料厂)，600-1000℃加热氧化，再按文献(zhen guo etal.Direct fluorescence analysis of genetic polymorphisms byhybridization with oligonucleotide qrrqys on glass supports.Nucleic Acids Research.1994，22：5456)方法进行醛基修饰，然后按(1)所述方法将以下探针点制成如图1的基因芯片。然后室温放置过夜。记为B芯片。
-31T：5′NH₂(dT)₅ tgcttttgaaagcTataaaaac 3′(22聚)(SEQ ID NO：5)
-31C：5′NH₂(dT)₅ tgcttttgaaagcCataaaaa 3′(21聚)(SEQ ID NO：6)
-511T：5′NH₂(dT)₅ agagagctccTgaggcagag 3′(20聚)(SEQ ID NO：7)
-511C：5′NH₂(dT)₅ gagagctccCgaggcaga 3′(18聚)(SEQ ID NO：8)
(3)购置尼龙膜(产品编号：Cat1209299，罗氏公司)，然后按产品说明书将以下探针点制成如图1所示的基因芯片。然后按产品说明书的方法固定探针。记为C芯片。
-31T：5′tctgcttttgaaagcTataaaaacagcg 3′(28聚)(SEQ ID NO：9)
-31C：5′tctgcttttgaaagcCataaaaacagc 3′(27聚)(SEQ ID NO：10)
-511T：5′gacagagagctccTgaggcagagaa 3′(25聚)(SEQ ID NO：11)
-511C：5′acagagagctccCgaggcagaga 3′(23聚)(SEQ ID NO：12)
                 实施例2：染色体DNA的制备
用一次性无菌注射针头抽取幽门螺杆菌感染阳性的患者全血500μl，收集于含50ul的2％EDTA溶液的无菌1.5ml离心管中，盖上管盖，上下颠倒数次，混匀。取无菌的1.5ml离心管，向其中加入混匀的待检全血100μl和纯水300μl，充分混匀，室温静置8分钟；将离心管置离心机中，6000g离心1分钟；取出离心管，倾去上清液，离心管底部可见少量白色沉淀；向离心管中加入抽提液(产品编号：BST01010，上海百傲科技有限公司)60μl，充分振荡使沉淀溶解；沸水浴中15分钟；取出离心管，置离心机中，12,000g离心15分钟。离心后上清液可直接用于PCR扩增。
                           实施例3：
      用PCR方法分别扩增并标记IL-1B基因含-31位的基因片段
                       和含-511位的基因片段
委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成以下引物：
-31位：
上游引物：Bio-ttccatgaaccagagaattatc    (SEQ ID NO：13)
下游引物：Bio-gcctcgaagaggtttggtatct    (SEQ ID NO：14)
-511位：
上游引物：Bio-gaaaggtcaattttctcctc      (SEQ ID NO：15)
下游引物：Bio-acaaagtggaagacacac        (SEQ ID NO：16)
然后用水溶解并稀释至10pmol/μl。将购置的Taq酶(产品编号：Lot，CE1101-1，TaKaRa)、10×缓冲液(产品编号：Lot，A2401-2，TaKaRa)、dNTP(产品编号：D0056，上海生工生物工程技术服务有限公司)、纯水以及实施例2获得的PCR扩增模板按以下配方分别配制针对-31位和-511位的PCR扩增体系：
反应体系(-31位/-511位)      体积(μl)
10×缓冲液                  2.5
dNTP(各2.5mM)               2.5
引物1(10pmol/ul)            1
引物2(10pmol/ul)            1
Taq酶(1U/ul)                1
H₂O                        14
模板                        3
总体积                      25μl
用PCR扩增仪Tc-25/H(杭州大和热磁电子有限公司)按以下程序扩增：94℃，5min，然后按94℃25sec，58℃25sec，72℃25sec做35个循环，最后72℃5min。
                             实施例4
                      用PCR扩增并标记IL-1B基因
                    中同时包含-31位和-511位的基因片段
委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成以下引物：
上游引物：Bio-gaaaggtcaattttctcctc      (SEQ ID NO：15)
下游引物：Bio-gcctcgaagaggtttggtatct    (SEQ ID NO：14)
然后用水溶解并稀释至10pmol/μl。将购置的Taq酶(产品编号：Lot，CE1101-1，TaKaRa)、10×缓冲液(产品编号：Lot，A2401-2，TaKaRa)、dNTP(产品编号：D0056，上海生工生物工程技术服务有限公司)、纯水以及实施例2获得的PCR扩增模板按以下配方配制针对-31位和-511位的PCR扩增体系：
反应体系                           体积(μl)
10×缓冲液                          2.5
dNTP(各2.5mM)                       2.5
引物1(10pmol/ul)                    1
引物2(10pmol/ul)                    1
Taq酶(1U/ul)                        1
H₂O                                14
模板                                3
总体                                25μl
用PCR扩增仪Tc-25/H(杭州大和热磁电子有限公司)按以下程序扩增：94℃，5min，然后按94℃25sec，58℃25sec，72℃25sec做35个循环，最后72℃5min。
                             实施例五
                   标记的PCR产物与基因芯片的杂交
采用上海百傲科技有限公司的芯片杂交试剂盒与芯片显色试剂盒进行此杂交试验。所述芯片杂交试剂盒(产品编号：BST05010，上海百傲科技有限公司)包含：预杂交液，杂交缓冲液，洗液1，反应舱。所述芯片显色试剂盒(产品编号：BST06010，上海百傲科技有限公司)包含：抗体液，洗液2，洗液3，显色液。
(1)将实施例一的基因芯片用预杂交液预杂交5min，然后除去预杂交液。A芯片和B芯片的预杂交温度为42℃，C芯片用杂交缓冲液进行预杂交，预杂交温度为58℃。
(2)将实施例三获得的带生物素标记的-31位和-511位PCR扩增产物混合后先98℃变性5min，然后取20μl加至200μl杂交缓冲液中混匀，与预杂交完毕的基因芯片进行30分钟杂交反应，A芯片和B芯片的杂交温度为42℃，C芯片的杂交温度为58℃。
(3)将杂交完毕的基因芯片用已预热至杂交温度的洗液1洗两次，每次10分钟；
(6)然后用洗液2室温洗2分钟；
(7)将基因芯片与抗体液室温反应20分钟；
(8)然后将基因芯片用洗液2室温洗5分钟，再重复此步骤一次；再用洗液3室温洗2分钟。
(10)在基因芯片上加显色液200μl，42℃放置40分钟。然后用水冲洗干净，晾干。
                             实施例六
                      基因芯片杂交信号的检测
将杂交并洗涤完毕的基因芯片置于Baio BE3.0生物芯片识读仪(BSE01021，上海百傲科技有限公司)上扫描后得到如图2所示的检测结果。其中2a为实施例三扩增产物与基因芯片的杂交结果，2b为实施例四扩增产物与基因芯片的杂交结果。结果表明幽门螺杆菌感染阳性的受检者的白介素1B基因-31位为C、-511位为T，属于胃癌易感的高危人群，建议彻底根治幽门螺杆菌。检测结果经测序结果验证完全符合。
                             序列表
<110>上海百傲科技有限公司
<120>基因检测芯片及其用途
<130>035160
<160>16
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>76
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
acagagaaat ttctcagcct cctacttctg cttttgaaag ccataaaaac agcgagggag    60
aaactggcag atacca                                                    76
<210>2
<211>76
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>2
acagagaaat ttctcagcct cctacttctg cttttgaaag ctataaaaac agcgagggag    60
aaactggcag atacca                                                    76
<210>3
<211>70
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>3
ctcagaggct cctgcaattg acagagagct cctgaggcag agaacagcac ccaaggtaga    60
gacccacacc                                                           70
<210>4
<211>70
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>4
ctcagaggct cctgcaattg acagagagct cccgaggcag agaacagcac ccaaggtaga    60
gacccacacc                                                           70
<210>5
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>探针
<400>5
tgcttttgaa agctataaaa ac                                             22
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>探针
<400>6
tgcttttgaa agccataaaa a                                              21
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>探针
<400>7
agagagctcc tgaggcagag                                                 20
<210>8
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>探针
<400>8
gagagctccc gaggcaga                                                   18
<210>9
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>探针
<400>9
tctgcttttg aaagctataa aaacagcg                                        28
<210>10
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>探针
<400>10
tctgcttttg aaagccataa aaacagc                                        27
<210>11
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>探针
<400>11
 gacagagagc tcctgaggca gagaa                                         25
<210>12
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>探针
<400>12
acagagagct cccgaggcag aga                                            23
<210>13
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>13
ttccatgaac cagagaatta tc                                             22
<210>14
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>14
gcctcgaaga ggtttggtat ct                                             22
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>15
gaaaggtcaa ttttctcctc                                                20
<210>16
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>16
acaaagtgga agacacac                                                    18