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1、(10)申请公布号 CN 103173376 A (43)申请公布日 2013.06.26 CN 103173376 A *CN103173376A* (21)申请号 201210464480.8 (22)申请日 2012.11.16 CGMCC No. 5916 2012.03.16 CGMCC No. 5914 2012.03.16 CGMCC No. 5913 2012.03.16 CGMCC No. 5915 2012.03.16 C12N 1/20(2006.01) C04B 28/00(2006.01) C12R 1/07(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (。
2、71)申请人 清华大学 地址 100084 北京市海淀区 100084 信箱 82 分箱清华大学专利办公室 (72)发明人 程晓辉 化彬 (74)专利代理机构 西安智大知识产权代理事务 所 61215 代理人 贾玉健 (54) 发明名称 利用产脲酶微生物制备高强度微生物砂浆的 方法 (57) 摘要 产脲酶微生物 ： Sporosarcina antarctica UR53、Sporosarcina koreensis UR47、 Sporosarcina sp. UR31 以及 Bacillus lentus UR41 已于 2012 年 3 月 16 日保藏于中国微生物 菌种保藏管理委员会普。
3、通微生物中心， 保藏编号 分 别 为 CGMCC No.5916、 CGMCC No.5915、 CGMCC No.5913、 CGMCC No.5914， 利用产脲酶微生物制备 高强度微生物砂浆的方法， 将上述四种微生物及 微生物Sporosarcina pasteurii和Terrabacter tumescens 发酵培养基中发酵培养得到菌液， 向 砂颗粒体系多批次灌入菌液、 固定液、 胶凝液， 形 成强度最高可达 55MPa 的微生物砂浆， 该材料力 学性能优于水泥基材料 ： 劈裂抗拉强度较同等强 度水泥石灰材料高， 刚度和水泥石灰混合砂浆相 近， 但远小于混凝土的刚度， 耐受疲劳荷载。
4、和循 环荷载能力高于水泥基材料 ； 人工砂岩为无机材 料， 不会像环氧树脂等有机材料一样容易老化。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图5页 (10)申请公布号 CN 103173376 A CN 103173376 A *CN103173376A* 1/1 页 2 1.产脲酶微生物 ： Sporosarcina antarctica UR53、 Sporosarcina koreensis UR47、 Sporosarcina sp.UR31。
5、以及Bacillus lentus UR41已于2012年3月16日保藏于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏编号分别为 CGMCC No.5916、 CGMCC No.5915、 CGMCC No.5913、 CGMCC No.5914， 该保藏中心简称 CGMCC， 地址 ： 北京市朝阳区大屯路， 中国 科学院微生物研究所， 邮编 100101。 2. 根 据 权 利 要 求 1 所 述 的 产 脲 酶 微 生 物 ： Sporosarcinaantarctica UR53、 Sporosarcina koreensis UR47、 Sporosarcinasp.UR31以。
6、及Bacillus lentus UR41均呈椭 圆杆状， 有芽孢， 无荚膜， 革兰氏阳性， 在NH4-YE即酵母提取物20g/L， 硫酸铵10g/L平板上， 菌落呈圆形， 表面湿润光滑， 边缘整齐， 菌落大小为 1-2mm， 菌落呈淡黄色， 该菌在 4 -37 的培养基温度及 pH7-9.5 的范围下均能生长。 3. 利用权利要求 1 或 2 所述的产脲酶微生物制备高强度微生物砂浆的方法， 其特征在 于， 包括如下步骤 ： 步骤 1 ： 将微生物 Sporosarcina pasteurii、 Terrabactertumescens、 Sporosarcina antarctica UR5。
7、3、 Sporosarcinakoreensis UR47、 Sporosarcina sp.UR31 以及 Bacills lentus UR41 单个菌落分别在 25 -37条件下在发酵培养基中发酵培养 12-60 小时得到 六种菌液 ； 步骤 2 ： 对结构空鼓进行闭水处理， 灌入粒径为 300-450 微米粒径的砂粒， 封闭整个空 腔， 预留进出浆口 ； 步骤 3 ： 以每立方米空鼓体积每分钟灌入 29L 菌液的速度把步骤 1 所得六种菌液由进 浆口灌入空鼓， 直至出浆口流出呈黄色的菌液 ； 步骤 4 ： 以每立方米空鼓体积每分钟灌入 29L 的速度灌入 0.05mol/L 氯化钙固定。
8、液， 所 需体积为空腔体积的 1/10 ； 步骤 5 ： 以每立方米空鼓体积每分钟灌入 4L 反应溶液的速度灌入等摩尔浓度尿素和氯 化钙混合溶液 48h， 反应液浓度为 0.5-1mol/L ； 步骤 6 ： 以每立方米空鼓体积每分钟灌入 29L 的速度灌入 0.05mol/L 氯化钙固定液， 所 需体积为空腔体积的 1/10 ； 步骤 7 ： 重复步骤 3 至步骤 6 过程 1-5 个循环。 4. 根据权利要求 3 所述的方法， 其特征在于 ： 步骤 1 所述微生物 Sporosarcina pasteurii 来自于美国模式培养物集存库 （Americantype culture coll。
9、ection） ， 编号为 ATCC11859 ； 所述微生物 Terrabacter tumescens 来自于中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心， 编号为 AS.1.2690。 5. 根据权利要求 3 所述的方法， 其特征在于 ： 步骤 1 所述发酵培养基包括酵母提取物 10-20g/L， 硫酸铵或氯化铵 10g/L， pH 为 7-9.5。 权 利 要 求 书 CN 103173376 A 2 1/5 页 3 利用产脲酶微生物制备高强度微生物砂浆的方法 技术领域 0001 本发明属于高强微生物砂浆制备领域， 具体涉及利用产脲酶微生物制备高强度微 生物砂浆的方法。 背景技术 00。
10、02 灌浆法是加固砌体结构， 特别是历史久远的文物建筑结构加固常用的方法， 而石 灰、 水泥和环氧树脂是三种常用的灌浆材料。其中石灰基灌浆材料作为传统砌体结构的勾 缝材料， 其与被加固结构的兼容性最好， 但是由于石灰基灌浆材料的硬化时间长， 硬化后强 度较低， 所以也无法起到很好的加固效果。 对于普通的水泥基灌浆材料， 由于需要保证灌浆 密实， 需要尽可能提高灌浆料的流动性， 所以浆液中砂的含量往往远低于普通砌筑砂浆， 这 使得硬化过程不可避免地会产生收缩开裂现象。 同时， 水泥基灌浆材料硬化后其刚度、 强度 与被加固结构往往不匹配， 容易产生未加固区域的二次破坏。 再者， 水泥基灌浆材料的高。
11、碱 性也会使原始砌体结构产生更容易产生酥碱破坏。 以上种种不足使水泥基灌浆材料加固砌 体结构的使用受到限制。 而环氧树脂等有机胶， 虽然有出色的力学性能和较高可灌性， 但是 由于有机材料应力、 应变性能和导热系数等基本材料性质都与原结构相差较大， 同时加固 后材料体本身透水、 透气性较低， 而且有机材料容易老化， 正如威尼斯条约里所陈述的观点 一样 ： 现代化学材料不属于珍贵的历 史建筑， 环氧树脂等有机材料不适用于大规模的砌体 结构加固。 发明内容 0003 为了解决上述现有技术存在的问题， 本发明的目的在于提供利用产脲酶微生物制 备高强度微生物砂浆的方法， 采用本发明的微生物砂浆， 可以在。
12、 1-2 个星期内到达需要的 强度， 同时结构延性较好， 透水、 透气性保持较高。 0004 为了达到上述目的， 本发明所采用的技术方案是 ： 0005 产脲酶微生物 ： 圆孢芽孢八叠球菌 Sporosarcina antarctica UR53、 韩国芽孢八 叠球菌 Sporosarcina koreensis UR47、 芽孢八叠球菌 Sporosarcina sp.UR31 以及延缓芽 孢杆菌 Bacillus lentus UR41 已于 2012 年 3 月 16 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心， 保藏编号分别为 CGMCC No.5916、 CGMCC No.。
13、5915、 CGMCC No.5913、 CGMCC No.5914， 该保藏中心简称 CGMCC， 地址 ： 北京市朝阳区大屯路， 中国科学院微生物研 究所， 邮编 100101。 0006 所 述 的 产 脲 酶 微 生 物 ： Sporosarcina antarctica UR53、 Sporosarcina koreensis UR47、 Sporosarcina sp.UR31 以及 Bacillus lentus UR41 均呈椭圆杆状， 有芽 孢， 无荚膜， 革兰氏阳性。在 NH4-YE 即酵母提取物 20g/L， 硫酸铵 10g/L 平板上， 菌落呈圆 形， 表面湿润光滑， 。
14、边缘整齐， 菌落大小为 1-2mm， 菌落呈淡黄色， 该菌在 4 -37的培养基 温度及 pH7-9.5 的范围下均能生长。 0007 利用产脲酶微生物制备高强度微生物砂浆的方法， 包括如下步骤 ： 说 明 书 CN 103173376 A 3 2/5 页 4 0008 步 骤 1 ：将 微 生 物 Sporosarcina pasteurii、 Terrabacter tumescens、 Sporosarcina antarctica UR53、 Sporosarcinakoreensis UR47、 Sporosarcina sp.UR31 以及 Bacillus lentus UR41。
15、 单个菌落分别在 25 -37条件下在发酵培养基中发酵培养 12-60 小时得到六种菌液 ； 0009 步骤 2 ： 对结构空鼓进行闭水处理， 灌入粒径为 300-450 微米粒径的砂粒， 封闭整 个空腔， 预留进出浆口 ； 0010 步骤 3 ： 以每立方米空鼓体积每分钟灌入 29L 菌液的速度把步骤 1 所得六种菌液 由进浆口灌入空鼓， 直至出浆口流出呈黄色的菌液 ； 0011 步骤 4 ： 以每立方米空鼓体积每分钟灌入 29L 的速度灌入 0.05mol/L 氯化钙固定 液， 所需体积为空腔体积的 1/10 ； 0012 步骤 5 ： 以每立方米空鼓体积每分钟灌入 4L 反应溶液的速度灌。
16、入等摩尔浓度的尿 素和氯化钙混合溶液 48h, 反应液浓度为 0.5-1mol/L ； 0013 步骤 6 ： 以每立方米空鼓体积每分钟灌入 29L 的速度灌入 0.05mol/L 氯化钙固定 液， 所需体积为空腔体积的 1/10 ； 0014 步骤 7 ： 重复步骤 3 至步骤 6 过程 1-5 个循环。 0015 步骤 1 所述微生物 Sporosarcina pasteurii 来自于美国模式培养物集存库 （American type culture collection） ， 编号为 ATCC 11859 ； 所述微生物 Terrabacter tumescens 来自于中国微生物菌种。
17、保藏管理委员会普通微生物中心， 编号为 AS.1.2690。 0016 步骤 1 所述发酵培养基包括酵母提取物 20g/L， 硫酸铵 10g/L， pH 为 9。 0017 本发明和现有技术相比， 具有如下优点 ： 0018 1、 从已有产脲酶菌株、 土样和水样中筛选产脲酶的微生物， 并对未知细菌进行分 子鉴定， 为获得产脲酶能力强， 原位保持脲酶活性高微生物菌株提供候选资源 ； 0019 2、 反应溶液中尿素在先期灌入的微生物所产生的脲酶的作用下， 分解为铵根和二 氧化碳， 同时使细菌周围 pH 升高， 促使生成碳酸钙沉淀， 胶凝空鼓中填充的砂粒， 形成整体 强度， 随着灌浆循环次数的增加，。
18、 砂粒体系内的碳酸钙含量增加， 强度随之增加， 并且强度 是可以控制的 ； 0020 3、 经过微生物灌浆加固后的结构空鼓内形成的人工砂岩材料力学性能优于水泥 基材料 ： 劈裂抗拉强度较同等强度水泥石灰材料高， 刚度和水泥石灰混合砂浆相近， 但远小 于混凝土的刚度， 耐受疲劳荷载和循环荷载能力高于水泥基材料 ； 人工砂岩为无机材料， 不 会像环氧树脂等有机材料一样容易老化 ； 0021 3、 所用的营养液的成本低 ； 0022 4、 本发明中所利用微生物为自然环境 （土壤） 中本身存在的微生物或其中某种微 生物的培养物， 营养物质也为天然物质， 不会对环境造成二次污染。 附图说明 0023 图。
19、 1 为依据 16S rDNA 序列构建的产脲酶菌株系统发育树。 0024 图 2 为培养菌株的生物量 （用 OD600值表示） 及脲酶活性， 横坐标为不同种类的产脲 酶菌株， 纵坐标为生物量及脲酶活性。 0025 图 3 为微生物灌浆装置示意图。 说 明 书 CN 103173376 A 4 3/5 页 5 0026 图 4 为材料干密度与单轴抗压强度、 劈裂抗拉强度的关系图。 0027 图 5 为单轴抗压应力应变全曲线。 图 6 为微生物砂浆在重复荷载下的应力 - 应变关系、 破坏形态示意图， 其中图 6a 和 6b 达到峰值前分别进过了 12 和 10 个周期， 图 6c 则是 8 个周。
20、期。 图 7 为微生物砂浆压汞实验结果示意图。 图 8 为微生物砂浆形成的胶凝体系样品 SEM 扫描图。 具体实施方式 0028 下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。实施例 ： 0029 产脲酶具有诱导生成人工砂岩能力菌株的分离筛选 0030 1、 样品采集 0031 Sporosarcina pasteurii 来 自 于 美 国 模 式 培 养 物 集 存 库 （American type culture collection） ， 编号为ATCC11859， Terrabacter tumescens来自于中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心， 编号为 AS.1.。
21、2690。 0032 2、 产脲酶菌株的分离和筛选 0033 产脲酶菌株分离自清华大学花圃采集土壤样品。 0034 细菌具有尿素分解酶， 能分解尿素产生大量的氨， 使培养基呈碱性， 显红色。本 实验利用这一特性， 将试验样品先在 37 C、 5M 高浓度尿素条件下富集培养 24h 后， 杀 死不能耐受和利用高浓度尿素的各种微生物营养体细胞， 再将处理后的培养液进行梯 度稀释， 涂布脲酶筛选培养平板， 37 C 下培养， 挑取使培养基颜色变红的菌株， 划 线分 离单菌落， 获得的微生物为产脲酶微生物， 并利用 16S rDNA 方法进行鉴定， 分别命名为 Sporosarcina antarct。
22、ica UR53， Sporosarcina koreensis UR47,Sporosarcina sp.UR31， Bacilluslentus UR41 ； 参照图 1， 图 1 为依据 16S rDNA 序列构建的产脲酶菌株系统发育 树。 0035 利用产脲酶微生物制备高强度微生物砂浆的方法， 包括如下步骤 ： 0036 步骤 1 ： 配制发酵培养基 ： 酵母提取物 20g/L， 硫酸铵 10g/L， pH 为 7-9.5， 将 100ml 发酵培养基装入 500ml 培养瓶中灭菌， 分别从平板中挑取单个菌落 Sporosarcina pasteurii、 Terrabactertum。
23、escens、 Sporosarcina antarctica UR53、 Sporosarcina koreensisUR47、 Sporosarcina sp.UR31 以及 Bacillus lentus UR41 分别接种于发酵培养 基中， 在 30温度下培养， 转速为 150rpm-250rpm。培养 16 小时后收集菌液， 检测六种菌液 的生物量 （用 OD600值表示） 和脲酶活性， 检测结果如图 2 所示 ； 0037 步骤 2 ： 对结构空鼓进行闭水处理， 灌入粒径为 300-450 微米粒径的砂粒， 封闭整 个空腔， 预留进出浆口， 如图 3 所示 : ； 0038 步骤 。
24、3 ： 以每立方米空鼓体积每分钟灌入 29L 菌液的速度把步骤 1 所得六种菌液 从进浆口 : 灌入空鼓， 直至从出浆口流出黄色的菌液 ； 0039 步骤 4 ： 以每立方米空鼓体积每分钟灌入 29L 的速度灌入 0.05mol/L 氯化钙固定 液， 所需体积为空腔体积的 1/10: ； 0040 步骤 5 ： 以每立方米空鼓体积每分钟灌入 4L 反应溶液的速度灌入等摩尔浓度尿素 和氯化钙混合溶液 48h, 反应液浓度根据不同强度 等级选择 0.5-1mol/L 不等 : ； 说 明 书 CN 103173376 A 5 4/5 页 6 0041 步骤 6 ： 以每立方米空鼓体积每分钟灌入 2。
25、9L 的速度灌入 0.05mol/L 氯化钙固定 液， 所需体积为空腔体积的 1/10 ； 0042 步骤 7 ： 根据加固强度等级要求不同， 重复步骤 3 至步骤 6 过程 1-5 个循环。 0043 微生物加固强度等级 0044 利用灌浆循环次数和营养盐浓度， 控制生成微生物砂浆的强度从单轴抗压强度 2MPa 到 55MPa 不等， 如图 4 所示。 0045 对所形成微生物砂浆的分析 0046 1、 力学性能分析 0047 对这些试样进行单轴抗压测试和劈裂抗拉测试。 正如水泥砂浆强度和其水灰比密 切相关一样， 微生物灌浆形成材料的强度与体系内碳酸钙的含量有关， 我们在灌浆开始前 准备的砂。
26、岩， 其初始密度是相同的， 所以用灌浆结束后的去除其中可溶物烘干的干密度值， 可以表示各样品的碳酸钙含量， 其与单轴抗压强度和劈裂抗拉的关系如图 4 所示。可以看 到， 材料的单轴抗压强度和劈裂抗拉强度都是随其干密度提高而增大， 而其干密度可以由 灌浆配方与次数控制。 0048 对其中部分样品的单轴抗压应力应变全曲线进行分析 （如图 5 所示） ， 可知除 UCS 强度较低的HSS1B外， 微生物灌浆材料的弹性段刚度相差不大， 表现在图5中各应力应变全 曲线初始段基本重合， 且与水泥石灰混合砂浆也基本重合。 材料在破坏前， 一般都会出现一 个小峰， 此时对应材料的可见裂缝的出现， 此时的应力值。
27、为强度的 65 -90 不等。然而， 可见裂缝的出现并没有显著降低材料的刚度和抗载荷能力， 随着加载的继续， 材料应力、 应 变继续增加， 直至到达峰值。峰后段表现为强度越大的材料， 强度退化越快， 表现为这种材 料高强时脆性越明显。这种材料如果应用于结构灌浆加固， 峰前开裂而不显著降低材料强 度、 刚度， 可根据开裂强度确定正常使用应力， 而开裂后的强度储备， 则是必要的安全冗余。 0049 为研究微生物砂浆在重复荷载下的应力 - 应变关系、 破坏形态， 并与混合砂浆在 相同条件下的性能做比较， 其结果如图 6 所示。对于强度相近的微生物砂浆和混合砂浆在 相同过程的重复荷载作用下， 存在以下。
28、主要区别 ： 0050 1. 达到峰值前， 微生物砂浆较混合砂浆能耐受的循环荷载周期数较多 （如图 6a 和 6b 达到峰值前分别进过了 12 和 10 个周期， 如图 6c 则是 8 个周期） ， 这表明微生物灌浆材料 抵抗重复荷载能力较混合砂浆高 ； 0051 2. 到达峰值后， 微生物砂浆在峰后 3-4 个荷载周期内仍然能有一定承载能力， 在 这个阶段的加载段， 应力随应变增加而增加， 而此时混合砂浆加载段部分与包络线重合， 表 现为加载段部分时间应变增加时应力持续下降。 这说明微生物材料较混合砂浆在峰后残余 强度方面优于混合砂浆 ； 0052 3. 在样品破坏形貌上， 微生物砂浆峰值后。
29、圆柱体试样逐渐开裂成一个个分开的短 柱， 如图6a和6b， 短柱在很长时间内并不断裂， 而混合砂浆峰值后开裂成薄片如图6c， 且很 快薄片从中间折断。这可 以解释微生物材料能在峰值后继续耐受 3-4 个循环的荷载， 而混 合砂浆直接进入不可逆的劣化阶段， 即在峰值后的每个应力 - 应变循环中， 在应变控制段， 应力达到包络线后， 应变仍然增加， 而此次应力快速降低。 0053 4. 进行测试的微生物砂浆样品重复荷载抗压极限强度较混和砂浆的低。 0054 2、 孔隙结构和微观形貌分析 说 明 书 CN 103173376 A 6 5/5 页 7 0055 压汞实验结果如图 7 所示。微生物灌浆过。
30、程使原来松散堆积的砂颗粒间的孔隙慢 慢变小， 孔隙率急剧降低。2 个批次的微生物灌浆后， 材料中孔隙直径基本都小于 100m。 随着灌浆批次的进一步增加， 材料中孔隙直径进一步减小， 但是孔径减小幅度降低， 经过 7 个批次灌浆后， 仍存在不少孔径在 7m 左右的孔隙， 总的来讲， 微生物灌浆材料的孔径主 要分布在10-100m范围内， 而混合砂浆微孔主要分布0.01-1m范围内， 相对于微生物灌 浆材料的孔径要小得多。 微生物砂浆中这种相对较大孔隙给砌体结构内外水汽平衡提供了 必要的通道， 同时却能有效阻断毛细水入侵， 有利于加固后砌体结构耐久性的提高。 0056 对微生物灌浆形成的胶凝体系。
31、样品进行SEM扫描， 其结果如图8所示。 其中图8a、 8b 是样品 HSS9B 中提取的， 可以看出除了少量孔隙， 砂颗粒周围均被碳酸钙包裹、 填充， 在 放大的碳酸钙表面上可以清楚的看到许多直径1m左右， 长约3-4m的孔洞， 这些空洞大 小与 S.pasteurii 相近， 应该是微生物体留下的痕迹。 说 明 书 CN 103173376 A 7 1/5 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103173376 A 8 2/5 页 9 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103173376 A 9 3/5 页 10 图 5 说 明 书 附 图 CN 103173376 A 10 4/5 页 11 图 6 说 明 书 附 图 CN 103173376 A 11 5/5 页 12 图 7 图 8 说 明 书 附 图 CN 103173376 A 12 。