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1、10申请公布号CN104046612A43申请公布日20140917CN104046612A21申请号201410261919622申请日20140613C12N13/00200601C12N1/20200601C12N1/18200601C12R1/19200601C12R1/225200601C12R1/86520060171申请人华侨大学地址362000福建省泉州市丰泽区城东华侨大学72发明人陈国林檬74专利代理机构泉州市文华专利代理有限公司35205代理人陈智海54发明名称一种从发酵液或细胞悬液中快速分离细胞的方法57摘要本发明提供一种从发酵液或细胞悬液中快速分离细胞的方法，步骤如下将。
2、表面羧基化的超顺磁性纳米粒子溶解于去离子水中，制成浓度为580MG/ML的磁流体溶液；将6ML80ML表面羧基化的超顺磁性纳米粒子溶液，加入1L发酵液或细胞悬液中；然后，加入浓度为1MOL/L的盐酸溶液或氢氧化钠溶液，调节其PH为26；最后将其置于400高斯4000高斯磁场中，35分钟后收集磁分离的细胞。本发明方法过程简单、耗能小、耗时短、设备简单、可连续操作、对分离的细胞活性影响较小，在生物催化、细胞固定化等领域有着广泛的应用前景。51INTCL权利要求书1页说明书4页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页10申请公布号CN104046612ACN10404。
3、6612A1/1页21一种从发酵液或细胞悬液中快速分离细胞的方法，其特征在于所述方法步骤如下步骤1、将表面羧基化的超顺磁性纳米粒子溶解于去离子水中，制成浓度为580MG/ML的磁流体溶液；步骤2、将6ML80ML步骤1制得的表面羧基化的超顺磁性纳米粒子溶液，加入1L发酵液或细胞悬液中；步骤3、再向步骤2所得溶液中加入浓度为1MOL/L的盐酸溶液或氢氧化钠溶液，调节其PH为26；步骤4、将步骤3所得的发酵液或细胞悬液置于400高斯4000高斯磁场中，35分钟后收集磁分离的细胞。2如权利要求1所述的一种从发酵液或细胞悬液中快速分离细胞的方法，其特征在于所述步骤1中表面羧基化的超顺磁性纳米粒子制备方。
4、法如下将81G的FECL36H2O溶于1425ML去离子水，搅拌加热至70；将44G的FECL24H2O溶于10ML去离子水，过滤；将两种溶液混合后剧烈搅拌,快速加入18ML浓氨水，之后逐滴加入466G油酸，继续在70的温度下快速搅拌1小时；制得的溶液用酒精沉淀、洗涤23次，再用去离子水洗涤至中性，然后加入160ML的浓度为10MG/MLKMNO4溶液，超声波清洗仪超声振荡8H，最后将制得的溶液用去离子水洗涤23次，冷冻干燥后得表面羧基化的超顺磁性纳米粒子。3如权利要求1所述的一种从发酵液或细胞悬液中快速分离细胞的方法，其特征在于所述步骤2中的发酵液或细胞悬液为单细胞悬液。4如权利要求3所述的。
5、一种从发酵液或细胞悬液中快速分离细胞的方法，其特征在于所述步骤2中的发酵液或细胞悬液为乳酸菌细胞悬液、大肠杆菌细胞悬液或酵母细胞悬液。5如权利要求1所述的一种从发酵液或细胞悬液中快速分离细胞的方法，其特征在于所述步骤4中的所述磁场可为永磁场或电磁场。权利要求书CN104046612A1/4页3一种从发酵液或细胞悬液中快速分离细胞的方法【技术领域】0001本发明涉及一种从发酵液或细胞悬液中快速分离细胞的方法。【背景技术】0002细胞分离是发酵、生物催化转化、细胞固定化等过程中经常需要进行的单元操作，快速连续的细胞分离方法具有重要的意义。目前，实验室或工业中多采用离心、沉淀或过滤的方法实现细胞从液。
6、体中的分离，操作过程难以在封闭体系中连续操作，再分离大量细胞时需要耗费较长时间，细胞活性损失较大。本研究提供一种简便快速的方法，从溶液中分离细胞。0003磁性纳米粒子粒径小，比表面积大，具有较大的吸附量；粒径均一，物理化学性质稳定，不会因为通透性问题对底物和产物产生的扩散较大的影响；磁相响应性强，通过磁力可控制其在处理场中的运动；在外加磁场的作用下便于细胞与底物及产物的分离。本研究将其用于细胞修饰，使普通细胞变成具磁响应特性的细胞，进而在外磁场作用下，细胞迅速从溶液中分离出来。0004磁性纳米粒子具有的特殊性能使其广泛应用于医药工业、生物工程级环境保护等；在生物分离领域，较之传统的离心法或过滤。
7、法，磁性载体分离技术耗能小、耗时短、设备简单、对分离目标活性影响较小。【发明内容】0005本发明要解决的技术问题，在于提供一种从发酵液或细胞悬液中快速分离细胞的方法，该方法过程简单、耗能小、耗时短、设备简单、可连续操作、对分离的细胞活性影响较小，在生物催化、细胞固定化等领域有着广泛的应用前景。0006本发明是这样实现上述技术问题的0007一种从发酵液或细胞悬液中快速分离细胞的方法，所述方法步骤如下0008步骤1、将表面羧基化的超顺磁性纳米粒子溶解于去离子水中，制成浓度为580MG/ML的磁流体溶液；0009步骤2、将6ML80ML步骤1制得的表面羧基化的超顺磁性纳米粒子溶液，加入1L发酵液或细。
8、胞悬液中；0010步骤3、再向步骤2所得溶液中加入浓度为1MOL/L的盐酸溶液或氢氧化钠溶液，调节其PH为26；0011步骤4、将步骤3所得的发酵液或细胞悬液置于400高斯4000高斯磁场中，35分钟后收集磁分离的细胞。0012进一步地，所述步骤1中表面羧基化的超顺磁性纳米粒子制备方法如下0013将81G的FECL36H2O溶于1425ML去离子水，搅拌加热至70；将44G的FECL24H2O溶于10ML去离子水，过滤；将两种溶液混合后剧烈搅拌,快速加入18ML浓氨水，之后逐滴加入466G油酸，继续在70的温度下快速搅拌1小时；制得的溶液用酒精沉说明书CN104046612A2/4页4淀、洗涤。
9、23次，再用去离子水洗涤至中性，然后加入160ML的浓度为10MG/MLKMNO4溶液，超声波清洗仪超声振荡8H，最后将制得的溶液用去离子水洗涤23次，冷冻干燥后得表面羧基化的超顺磁性纳米粒子。0014进一步地，所述步骤2中的发酵液或细胞悬液为单细胞悬液。0015进一步地，所述步骤2中的发酵液或细胞悬液为乳酸菌细胞悬液、大肠杆菌细胞悬液或酵母细胞悬液。0016进一步地，所述步骤4中的所述磁场可为永磁场或电磁场。0017本发明具有如下优点00181、本发明可在数分钟内实现细胞从溶液中的快速分离，克服了传统生物分离方法分离大量细胞时耗费时间长、细胞活性损失大的缺陷。00192、本发明提供得分离细胞。
10、的方法，该法操作简便、设备简单、对细胞活性影响较小，可实现细胞的连续分离和快速重复利用。0020总之，本发明方法过程简单、耗能小、耗时短、设备简单、可连续操作、对分离的细胞活性影响较小，在生物催化、细胞固定化等领域有着广泛的应用前景。【具体实施方式】0021本发明涉及一种从发酵液或细胞悬液中快速分离细胞的方法，所述方法步骤如下0022步骤1、将表面羧基化的超顺磁性纳米粒子溶解于去离子水中，制成浓度为580MG/ML的磁流体溶液；0023步骤2、将6ML80ML步骤1制得的表面羧基化的超顺磁性纳米粒子溶液，加入1L发酵液或细胞悬液中；0024步骤3、再向步骤2所得溶液中加入浓度为1MOL/L的盐。
11、酸溶液或氢氧化钠溶液，调节其PH为26；0025步骤4、将步骤3所得的发酵液或细胞悬液置于400高斯4000高斯磁场中，35分钟后收集磁分离的细胞。0026所述步骤1中表面羧基化的超顺磁性纳米粒子制备方法如下0027将81G的FECL36H2O溶于1425ML去离子水，搅拌加热至70；将44G的FECL24H2O溶于10ML去离子水，过滤；将两种溶液混合后剧烈搅拌,快速加入18ML浓氨水，之后逐滴加入466G油酸，继续在70的温度下快速搅拌1小时；制得的溶液用酒精沉淀、洗涤23次，再用去离子水洗涤至中性，然后加入160ML的浓度为10MG/MLKMNO4溶液，超声波清洗仪超声振荡8H，最后将制。
12、得的溶液用去离子水洗涤23次，冷冻干燥后得表面羧基化的超顺磁性纳米粒子。0028所述步骤2中的发酵液或细胞悬液为单细胞悬液，较优的为乳酸菌细胞悬液、大肠杆菌细胞悬液或酵母细胞悬液。0029所述步骤4中的所述磁场可为永磁场或电磁场。0030以下结合具体实施例对本发明作进一步的描述。0031实施例1表面富含羧基的超顺磁性纳米粒子的制备方法0032将81G的FECL36H2O溶于1425ML去离子水，搅拌加热至70；说明书CN104046612A3/4页50033将44G的FECL24H2O溶于10ML去离子水,过滤；0034将两种溶液混合，在剧烈搅拌的条件下,快速加入18ML浓氨水,之后逐滴加入4。
13、66G油酸,继续在70的温度下快速搅拌1小时；制得的溶液用酒精沉淀、洗涤2次，再用去离子水洗涤至中性；0035向制得的溶液里然后加入160ML的KMNO4溶液10MG/ML,超声波清洗仪超声振荡8H，将制得的溶液用去离子水洗涤3次,加入适量的去离子水,超声2H,冷冻干燥后得表面羧基化的超顺磁性纳米粒子。0036实施例2利用实施例1制备的超顺磁性纳米粒子从发酵液中分离罗伊氏乳杆菌细胞0037取培养24小时后的菌液1000ML，逐滴加入6ML浓度60MG/ML的表面羧基化的超顺磁性纳米粒子，充分摇匀，调节溶液的PH为2；置于磁场强度约为400高斯的永磁体磁场中，磁分离10MIN；测磁分离后的上清液。
14、中的细胞浓度，结果表明98的罗伊氏乳杆菌细胞被有效磁分离。0038将上述中磁分离后的沉淀物重悬于去离子水中，得到磁修饰细胞悬液，重新置于磁场强度约为4000高斯的永磁体磁场中，磁分离10MIN；测磁分离后的上清液中的细胞浓度，结果表明100的罗伊氏乳杆菌细胞被有效磁分离。0039实施例3利用实施例1制备的表面羧基化的超顺磁性纳米粒子从发酵液中分离罗伊氏乳杆菌细胞0040取培养24小时后的菌液1000ML，逐滴加入80ML浓度5MG/ML的表面羧基化的超顺磁性纳米粒子，充分摇匀，调节溶液的PH为4；置于磁场强度约为4000高斯的永磁体磁场中，磁分离10MIN；测磁分离后的上清液中的细胞浓度，结果。
15、表明96的罗伊氏乳杆菌细胞被有效磁分离。0041将上述中磁分离后的沉淀物重悬于去离子水中，得到磁修饰细胞悬液，重新置于磁场强度约为4000高斯的永磁体磁场中，磁分离10MIN；测磁分离后的上清液中的细胞浓度，结果表明100的罗伊氏乳杆菌细胞被有效磁分离。0042实施例4利用实施例1制备的表面羧基化的超顺磁性纳米粒子从大肠杆菌细胞悬液中分离大肠杆菌细胞0043取培养12小时后的菌液1000ML，在4下8000R/MIN离心分离出大肠杆菌细胞；离心10MIN后弃上清液，用去离子水水洗涤菌体后再次离心，并重复两次；将离心的菌体重悬于1000ML超纯水中，得到大肠杆菌细胞悬液，并向其中添加116G氯化。
16、钠。0044逐滴加入60ML浓度20MG/ML的表面羧基化的超顺磁性纳米粒子，充分摇匀；置于磁场强度约为2000高斯的电磁磁场中，磁分离10MIN；测磁分离后的上清液中的细胞浓度，结果表明97的大肠杆菌细胞被有效磁分离。0045实施例5利用实施例1制备的表面羧基化的超顺磁性纳米粒子从发酵液中分离大肠杆菌细胞0046取培养24小时后的菌液1000ML，逐滴加入40ML浓度80MG/ML的表面羧基化的超顺磁性纳米粒子，充分摇匀，调节溶液的PH为3；置于磁场强度约为4000高斯的永磁体磁场中，磁分离10MIN；测磁分离后的上清液中的细胞浓度，结果表明85的大肠杆菌细胞被有效磁分离。说明书CN1040。
17、46612A4/4页60047实施例6利用实施例1制备的表面羧基化的超顺磁性纳米粒子从酿酒酵母细胞悬液中分离酿酒酵母细胞0048取培养24小时后的菌液1000ML，在4下4000R/MIN离心分离出酿酒酵母细胞；离心10MIN后弃上清液，用去离子水水洗涤菌体后再次离心，并重复两次；将离心的菌体重悬于超纯水中，得到酿酒酵母细胞悬液，并向其中添加116G氯化钠。0049逐滴加入80ML浓度60MG/ML的表面羧基化的超顺磁性纳米粒子，充分摇匀；置于磁场强度约为4000高斯的电磁磁场中，磁分离10MIN；测磁分离后的上清液中的细胞浓度，结果表明96的酿酒酵母细胞被有效磁分离。0050实施例7利用实施。
18、例1制备的表面羧基化的超顺磁性纳米粒子从发酵液中分离酿酒酵母细胞0051取培养24小时后的菌液1000ML，逐滴加入80ML浓度80MG/ML的表面羧基化的超顺磁性纳米粒子，充分摇匀，调节溶液的PH为6；置于磁场强度约为3000高斯的永磁体磁场中，磁分离10MIN；测磁分离后的上清液中的细胞浓度，结果表明80的酵母细胞被有效磁分离。0052综上可知，本发明通过共沉淀法制得超顺磁性纳米粒子，对超顺磁性纳米粒子修饰使其表面羧基功能化。然后将羧基功能化的磁性纳米粒子加入细胞悬浮液或发酵液中，可对细胞进行快速的磁修饰，经磁修饰后的细胞在外磁场的作用下，可在几分钟内从溶液中快速分离。0053本发明可在数。
19、分钟内实现细胞从溶液中的快速分离，克服了传统生物分离方法分离大量细胞时耗费时间长、细胞活性损失大的缺陷。本发明提供得分离细胞的方法，该法操作简便、设备简单、对细胞活性影响较小，可实现细胞的连续分离和快速重复利用。0054总之，本发明方法过程简单、耗能小、耗时短、设备简单、可连续操作、对分离的细胞活性影响较小，在生物催化、细胞固定化等领域有着广泛的应用前景。0055虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。说明书CN104046612A。