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1、10申请公布号CN104046688A43申请公布日20140917CN104046688A21申请号201410251419422申请日20140607C12Q1/68200601A61K48/00200601A61P29/00200601A61P25/0420060171申请人徐州医学院地址221004江苏省徐州市铜山璐209号72发明人郭羽白尹翠韩文灿74专利代理机构徐州市三联专利事务所32220代理人周爱芳54发明名称MIR27B化合物作为慢性疼痛标志物的用途和在制备治疗慢性疼痛药物中的用途57摘要本发明涉及一种MIR27B化合物作为慢性疼痛标志物的用途和在制备治疗慢性疼痛药物中的用途。
2、。包括1筛选MIR27B靶标基因并通过报告基因进行验证，利用完全弗氏佐剂CFA制作炎性慢疼痛模型小鼠；2利用MIR27B模拟物增加该MIRNA在炎症慢性疼痛小鼠脊髓表达量；3利用WESTERNBLOT法检测MIR27B对CFA致炎症慢性疼痛的DOT1L蛋白表达的抑制作用；4利用热激法对疼痛行为进行检测。本发明工艺简单成本低，采用MIR27B有效的抑制了炎性慢性疼痛，为防治慢性疼痛提供有效干预药物。具体是MIR27B化合物作为慢性疼痛标志物的用途和在制备治疗慢性疼痛药物中的用途。进一步对慢性疼痛病人的血液临床标本进行了定量分析，表明MIR27B能作为慢性疼痛发生的标志物。51INTCL权利要求书。
3、1页说明书3页序列表1页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书3页序列表1页附图2页10申请公布号CN104046688ACN104046688A1/1页21一种MIR27B化合物作为慢性疼痛标志物的用途。2一种应用MIRNA制备抑制炎症性性疼痛药物，包括1筛选MIR27B靶标基因，并进行验证，利用完全弗氏佐剂对小鼠足底进行注射，制作炎性慢疼痛模型小鼠；2利用MIR27B模拟物增加该MIRNA在小鼠脊髓的表达量；3利用WESTERNBLOT法检测MIR27B模拟物对CFA诱导的DOT1L蛋白表达的抑制作用；4利用热激法对小鼠疼痛阈值进行测定。3根据权利要求。
4、1所述的一种应用MIRNA制备抑制炎症性性疼痛药物，其特征在于所述步骤1中的CFA注射量为40微升。4根据权利要求1所述的种应用MIRNA制备抑制炎症性性疼痛药物，其特征在于所述步骤2中的MIR27B模拟物为包含MIR27B核酸序列“茎一环”结构的发夹状结构，其主序列如下5UUCACAGUGGCUAAGUUCUGC3。权利要求书CN104046688A1/3页3MIR27B化合物作为慢性疼痛标志物的用途和在制备治疗慢性疼痛药物中的用途技术领域0001本发明涉及一种微小RNA分子的用途,尤其是涉及MIR27B化合物的用途,具体是MIR27B化合物作为慢性疼痛标志物的用途和在制备治疗慢性疼痛药物中。
5、的用途。属于生物医学材料技术领域。背景技术0002疼痛是临床上最常见的症状之一，长期存在的病理性疼痛伴发着心理和情绪疾病给慢性疼痛患者在生活上带来了难以忍受的折磨。据统计，全球慢性疼痛的患者高达32亿，全世界各国政府投入了大量的人力及每年上千亿美元的财力试图去攻克这一难题，仅在中国就存在数以亿计的疼痛患者，这无疑是人类目前迫不及待需要解决的难题。0003神经细胞中含MIRNA较其他组织细胞多，MIRNA在突触部位的选择性聚集或缺失，可以调节突触局部的基因表达和蛋白合成，影响神经细胞突触功能。神经系统疾病，比如帕金森、精神分裂症、老年痴呆、亨廷顿病、神经母细胞瘤等都与MIRNA表达和功能异常相关。
6、。0004关于MIR27B作为一种抑制慢性疼痛基因靶点的用途和作为慢性疼痛诊断的一种标志物的用途目前尚未见报道。发明内容0005为解决上述问题，本发明提供一种MIR27B化合物作为慢性疼痛标志物和在制备治疗慢性疼痛药物中的应用,该方法工艺简单，成本低，采用MIR27B有效降低了炎性慢疼痛小鼠热激疼痛阈值，从而达到预防和治疗炎性慢性疼痛的目的。具体0006一种应用MIRNA制备抑制炎症性性疼痛药物，包括00071筛选MIR27B靶标基因，并进行验证，利用完全弗氏佐剂对小鼠足底进行注射，制作炎性慢疼痛模型小鼠；00082利用MIR27B模拟物增加该MIRNA在小鼠脊髓的表达量；00093利用WES。
7、TERNBLOT法检测MIR27B模拟物对CFA诱导的DOT1L蛋白表达的抑制作用；00104利用热激法对小鼠疼痛阈值进行测定。0011所述步骤1中的CFA注射量为40微升。0012所述步骤2中的MIR27B模拟物为包含MIR27B核酸序列“茎一环”结构的发夹状结构，其主序列如下5UUCACAGUGGCUAAGUUCUGC3。0013本发明首次发现MIR27B在慢性疼痛发生和维持过程中均能通过调控DOT1L信号传导通路进行。作为疼痛抑制基因，MIR27B能显著抑制慢性疼痛的发生。研究结果表明通过检测或干涉中枢神经中MIR27B的表达可为慢性疼痛的诊断或治疗提供新的方案。0014有益效果0015。
8、本发明工艺简单，成本低，采用化学合成的MIR27B有效的降低了炎症慢性疼痛说明书CN104046688A2/3页4热激阈值，从而进一步明确了炎性慢性疼痛的发病机制，为防治提供有效的干预靶点。附图说明0016图1是MIR27B在CFA疼痛模型小鼠脊髓中的差异表达；0017图2是鞘内注射MIR27B模拟物对CFA炎性疼痛模型小鼠痛行为学影响。制备CFA炎性慢疼痛模型小鼠，第三天开始隔天微注射MIR27B模拟物，注射2小时后测定小鼠对热激疼痛反应，发现注射MIR27B后明显减轻CFA小鼠疼痛反应。可看出人为增加MIR27B可以减轻CFA小鼠疼痛行为，起镇痛作用；0018图3为计算机软件分析显示DOT。
9、1L的3非翻译区存在1个MIR27B的作用靶点；0019图4为MIR27B能够抑制携带DOT1L靶序列萤光素酶的相对活性；0020图5为MIR27B能够抑制CFA诱导的DOT1L在蛋白质水平的表达；具体实施方式00211、CFA慢性关节炎疼痛模型制备及脊髓水平MIR27B表达0022SPF级雄性6周昆明雄性小鼠在异氟醚麻醉下，围绕左后足足跖关节部选择两点皮内注射无菌完全弗氏佐剂COMPLETEFREUNDSADJUVANT,CFA；SIGMA公司40L,该注射浓度可诱导产生关节炎。在注射后的24小时即出现热和机械痛觉阈值的降低并可维持3周以上。0023MIR27B的表达分析运用MIRNA检测试。
10、剂盒对MIR27B进行荧光定量分析，结果显示，CFA三天小鼠脊髓表达量发生显著下调表达附图1。00242、采用MIR27B模拟物在体过量表达脊髓MIRNA。0025采用合成MIR27B的RNA序列。先将MIR27B用脂质体包裹脂质体与5葡萄糖液按23比例混匀后，迅速加入等体积的MIR27B25M溶液，充分混匀，室温下静置10分钟后应用，即为脂质体MIR27B混合物。再将混合物进行鞘内注射每只小鼠每天麻醉后，注射2次MIR27B25M，每次10L，每次时间12小时，注射后注射器停留组织内60S，共2天，最后一次注射2H后开始检测。0026疼痛行为监测热痛觉过敏将有机玻璃箱置于3MM厚的玻璃板上，。
11、按HARGREAVES法用热辐射刺激以照射大鼠足底紧贴玻璃板部位。记录照射开始至大鼠出现抬足时间，截止时间为20S。每只动物测定3次，取其平均值，每次测定时间间隔5MIN。结果表明，鞘内注射MIR27B模拟物后可显著降低疼痛阈值附图2。00273、MIR27B靶标基因的筛选方法0028运用TARGETSCAN,PICTAR等软件检索MIR27B可能的靶基因，发现DOT1L基因的3非翻译区3UTR含有MIR27B的靶位点附图3，靶标序列见附表12。选定该基因作为候选基因。00294、报告基因验证DOT1L是MIR27B的靶基因0030构建PSICHECK2DOT1L3UTR重组质粒，与MIR27。
12、B模拟物共转染工具细胞293T，转染24H后冻融细胞一次，用专用裂解液裂解细胞，每孔100U1，吹打均匀，充分裂解后样品备用。采用PROMEGA公司的萤光素酶检测试剂盒，在15M1离心管中加入LAR工工50U1和裂解液5U1混匀，酶标仪检测萤火虫萤光素酶；加入50U1STOPGLO溶液灭活萤火虫萤光素酶，说明书CN104046688A3/3页5酶标仪检测海肾萤光素酶。结果显示，转染SCRNA对萤光素的表达无影响。而转染MIR27B模拟物后萤光素的表达分别下降了约40左右见附图4。00315、利用WESTERNBLOT法检测MIR27B模拟物对CFA诱导的DOT1L蛋白表达的抑制作用0032制备。
13、CFA炎性慢疼痛小鼠，鞘内注射MIR27B模拟物，2天后取小鼠脊髓腰膨大区蛋白样品进行电泳。电泳时，按每孔20UG蛋白上样量等量上样。以150V电泳15H,100V电压下转膜1H。将膜放入自封袋中，加入5脱脂奶粉/TBST，完全浸泡膜并封口，于室温下振荡封闭1H。加入TBST稀释后DOT1L或对照GAPDH抗体一抗抗血管紧张素1型受体抗体按11000稀释，抗GAPDH抗体按11000稀释，4振荡孵育过夜。吸净一抗，TBST漂洗膜5MINX3；加入稀释后的二抗均为15000稀释，水平摇床室温孵育1H。吸净二抗，TBST漂洗膜，5MINX3，等体积混合ECLAB液，充分覆盖湿润NC膜表面，静置LMIN；于暗室中用保鲜膜将NC膜封好，将X光片平放于NC膜上显影并记录数据。结果可见，在CFA的刺激下，脊髓腰膨大区DOT1L蛋白的表达量明显升高。然而鞘内增加了MIR27B模拟物的表达量后，CFA诱导的DOT1L蛋白的表达量明显下降。见附图5说明书CN104046688A1/1页6序列表序列表CN104046688A1/2页7图1图2图3说明书附图CN104046688A2/2页8图4图5说明书附图CN104046688A。