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1、(10)申请公布号 CN 104287875 A (43)申请公布日 2015.01.21 CN 104287875 A (21)申请号 201410077989.6 (22)申请日 2014.03.05 A61F 2/82(2013.01) (71)申请人 青岛尤尼科技有限公司 地址 266043 山东省青岛市李沧区四流北路 23 号 (72)发明人 王红 (54) 发明名称 一种多功能生物打印系统及基于生物打印系 统制备组织工程器官的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种多功能生物打印系统及基 于生物打印系统制备组织工程器官的方法。所述 生物打印系统包括控制系统、 打印系统和无菌恒 温系统。
2、。可根据人体器官的实际情况精确打印出 包括细胞、 营养因子和生物支架的组织工程器官 并保证打印过程中细胞的存活率和活性， 用以达 到制备人工器官的目的。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104287875 A CN 104287875 A 1/1 页 2 1. 一种多功能生物打印系统， 包括控制系统、 生物打印机和无菌恒温装置。 2. 根据权利要求 1 所述的多功能生物打印系统， 其特征在于所述的无菌恒温装 置为打印提供无菌恒温环。
3、境。 3. 根据权利要求 1 所述的多功能生物打印系统， 其特征在于所述的生物打印机包括 6 个可更换的带有电加热装置的打印喷头。 4. 根据权利要求 3 所述的打印喷头， 其特征在于可根据打印材料的不同采用微注射器 型电动喷头、 活塞开关型气动喷头和容积型压电喷头。 5. 根据权利要求 4 所述的带有电加热装置的微注射器型电动喷头， 其特征在打印高黏 度支架材料时， 能通过加热改变支架材料的黏度， 加热温度在室温到 300之间。 6. 根据权利要求 4 所述的带有电加热装置的活塞开关型气动喷头， 其特征在打印低黏 度支架材料时， 能通过加热改变支架材料的黏度， 加热温度在室温到 100之间。。
4、 7. 根据权利要求 4 所述的带有电加热装置的容积型压电喷头， 其特征在打印细胞时， 提供适合细胞存活的温度。 8. 根据权利要求 1 所述的多功能生物打印系统制备组织工程器官的方法， 其体征在于 包括以下步骤 ： 将所要打印的器官实体模型进行分层切片， 得到每层的二维信息 ； 配制打印组织工程器官所需的支架材料、 细胞液 ； 将步骤 （2） 配置好的材料分别加入到生物打印机的不同打印喷头中， 将生物打印机的 工作环境灭菌后， 温度调节到既能使支架材料固化又能使细胞成活的温度， 打印喷头在 xy 轴上移动， 将组织工程器官的二维信息在打印平台上成型， 打印完成一层后， 打印喷头 z 轴 向上。
5、移动， 打印下一层， 逐层堆积成型， 直到所打印的组织工程器官成型完成。 9. 根据权利要求 8 所述的制备方法， 其特征在于 ： 所述步骤 （3） 中的打印环境温度为 0 到 40。 10.根据权利要求8所述的制备方法， 其特征在于 ： 所述步骤 （3） 中的xy轴方向的移动 速度为 1-20mm/s。 11. 根据权利要求 8 所述的制备方法， 其特征在于 ： 所述步骤 （3） 中的支架打印喷头的 直径为 0.1-0.5mm。 12. 根据权利要求 8 所述的制备方法， 其特征在于 ： 所述步骤 （3） 中的细胞打印喷头的 直径为 0.05 到 0.2mm。 13. 根据权利要求 8 所述。
6、的制备方法， 其特征在于 ： 所述步骤 （2） 中支架材料为天然生 物材料和人工合成高分子材料。 14. 根据权利要求 13 所述的制备方法， 其特征在于， 所述天然生物材料为胶原、 细胞外 基质蛋白、 多糖以及丝素蛋白中的一种或几种。 15.根据权利要求13所述的制备方法， 其特征在于 ： 所述步骤 （2） 中细胞液含有细胞和 细胞生长所需的葡萄糖、 氨基酸、 无机盐、 细胞生长因子等。 权 利 要 求 书 CN 104287875 A 2 1/4 页 3 一种多功能生物打印系统及基于生物打印系统制备组织工 程器官的方法 技术领域 0001 本发明涉及生物医学工程和医疗技术领域， 特别涉及一。
7、种多喷头、 多材料的生物 打印系统及基于生物打印系统制备组织工程器官的方法。 背景技术 0002 由各种事故、 创伤或疾病造成的人体器官缺损会导致功能障碍， 传统的修复方法 是采用异体器官移植术， 虽然这种方法可以取得满意疗效， 但是供体器官来源极为有限， 另 外， 因免疫排斥反应需长期使用免疫抑制剂， 所以可能会导致很多并发症及附加损伤。 自80 年代科学家首次提出 “组织工程学” 概念以后， 组织工程技术已经为众多的组织缺损、 器官 功能衰竭病人的治疗带来了曙光， 组织工程中的三要素主要包括种子细胞、 支架材料以及 细胞生长的微环境， 而其中支架材料是用于支撑细胞成长为一个完整的组织的框架。
8、材料， 因此成为组织工程研究及其临床应用的关键之一。 用于器官打印的组织工程支架材料应具 有以下特点 ： 良好的生物组织相容性， 不引起机体的免疫排斥反应， 无毒性 ； 具有生物可降 解性及降解可调节性， 可塑性和一定的机械强度 ； 有一定孔隙率， 良好的表面活性， 维持生 长其上的细胞形态和表型 ； 并能增进细胞的黏附和增殖， 诱导组织再生。目前， 组织工程生 物支架材料主要分两大类 ： 天然生物材料 ( 如脱细胞细胞外基质， 多糖， 丝素蛋白及胶原 等 ) 和人工合成的可降解材料 ( 如聚羟基乙酸及其复合物、 聚乳酸、 聚乳酸和聚羟基乙酸 共聚物等 )。天然生物材料突出的优点在于 ： 生物。
9、相容性好， 与细胞外基质结构相似， 利于 细胞的黏附、 增殖和分化， 毒性小， 易降解， 降解产物被人体吸收后不产生炎症， 所以在组织 工程中作为细胞培养的支架材料具有人工合成材料所不可比拟的优势。鉴于上述原因， 采 用天然生物材料制备适用于人体神经再生的组织工程支架已经成为人们研究的热点， 但大 多数文献中报导的支架成型方法 （如粒子致孔法、 静电纺丝法、 冻干法等） 往往存在着制备 时间长， 有机溶剂残留以及力学性能差等问题， 在一定程度上限制了其应用 近年来， 三维打印技术在制备组织工程用天然生物材料支架方面得到了快速发展和 应用。三维打印技术最早是由美国麻省理工学院 Emanual S。
10、achs 等人于 1989 年开发的， 是一项基于喷射型的快速成型技术， 它首先借助计算机辅助设计 （CAD） 技术制备所打印物 体的 STL 电子文档模型， 然后依据 “逐层打印， 层层叠加” 的原理来打印具有特殊外形或 复杂内部结构的物体。其成型过程不受任何几何形状的限制， 打印位置、 打印次数和打印 速度都可以随意控制， 不同的材料可以通过不同喷头打印， 打印的物质可以是溶液、 悬浮液 或乳液， 因此， 三维打印可以很容易控制局部材料组成、 微观结构以及表面特性。另外该技 术具有操作方便、 加工过程灵活、 成型速度快、 运行费用低且可靠性高的特点， 现在已成为 快速成型技术领域最有生命力。
11、的新技术之一。文献 Porous Ti6Al4V scaffold directly fabricating by rapid prototyping （Jia Ping Li.Biomaterials 2006, 27 12231235） 公开了将 Ti6Al4V 粉末溶解于有机溶剂中制备获得 Ti6Al4V 胶状物， 然后将该胶状物放 入打印机 “墨盒” 中， 按照三维打印机中的 CAD 模型， 成功打印出了纤维状的 Ti6Al4V（容易 说 明 书 CN 104287875 A 3 2/4 页 4 干燥成型） ， 并制备了具有多孔结构的矩形块状体， 最后进一步对该多孔块状体进行烧结成 型。
12、， 并证实了该打印的多孔状 Ti6Al4V 块状体具有促进骨细胞粘附和生长的功能， 在组织 工程领域具潜在应用价值。 文献3D Fiber-Deposited Electrospun IntegratedScaffolds Enhance Cartilage Tissue Formation （Lorenzo Moroni. Adv. Funct.Mater. 2008, 18, 5360） 公开了联合应用三维打印技术和熔融静电纺丝法则成功制备出了 PEOT/PBT 聚合 物的多孔状结构 , 该多孔状聚合物结构同样具有较好的促进细胞生长的作用。此外， 文献 Incorporation of g。
13、rowth factor containing Matrigel promotesvascularization of porous PLGA scaffolds（M. W. Laschke, J Biomed Mater Res85A:397407, 2008） 报 导了将熔融的 PLGA 用三维打印机打印成多孔网状结构， 并负载生长因子用于血管再生， 发 现负载生长因子的多孔 PLGA 网状支架能较快的促进组织工程化血管的构建 上述用到的材料主要涉及无机材料以及人工合成高分子材料， 这类材料往往具有较 好的力学性能、 耐高温性能以及容易加工成型等特点， 所以比较容易用于三维打印成型制 备领。
14、域。利用三维打印成型的这类材料已被尝试用于骨组织、 皮肤组织、 神经组织以及心 血管组织等的修复， 且取得了一定的初步研究成果。但是， 对于一些天然生物材料 （细胞外 基质蛋白、 多糖类分子以及丝素蛋白类分子等） 来说， 由于其性质的特殊性， 如不耐高温、 易变性、 配制溶液后具有流动性等不易加工成型的特点， 在很大程度上限制了其在三维打 印成型领域的应用。目前用于组织工程的天然生物材料三维打印技术主要包括热注入打 印技术、 压电打印技术、 激光打印等方法， 其打印成型方法主要包括沉淀法、 热固法、 注入模 塑法和交联法。其中， 只有少量文献报导了将天然生物材料跟人工合成材料复合用以三 维打印。
15、成型的研究， 文献 “Fabrication of 3D chitosanhydroxyapatite scaffolds ” （ T.H.Ang. Materials Science and Engineering C 2002, 20: 3542） 采用三维打印 技术和沉淀法相结合的方法， 利用不可溶解性的特点， 将壳聚糖和羟基磷灰石混合液打印 到 NaOH 和乙醇的混合溶液中， 形成一种类似水凝胶的沉淀物， 然后对该沉淀物进行冻干成 型， 获得了壳聚糖和羟基磷灰石的复合支架。 尽管将天然生物材料壳聚糖进行了打印成型， 但是在打印的过程中主要还是借助了羟基磷灰石的作用来提高成型物的力学性能。
16、， 而且由 于是直接打印在溶液里成型， 因此难以控制成型物形状的稳定性， 支架形态易发生变化， 另 外， 由于天然生物材料具有特定的生物学特性 （构象变化， 容易变性等） ， 因此不是所有这类 材料都适用于沉淀法成型。目前， 尚无文献报道将三维打印技术专门应用于单独一种天然 生物材料。 发明内容 0003 本发明针对现有技术不足， 提供了一种多喷头、 多材料的生物打印体统及基于生 物打印系统制备组织工程器官的方法， 通过无菌恒温装置控制打印环境的温度， 既能使支 架材料固化又能保证细胞的成活率。 0004 本发明具体技术方案如下 ： 一种多功能生物打印系统， 包括控制系统、 生物打印机和无菌恒。
17、温装置 上述控制系统可采用本领域常规使用的方法进行计算机辅助设计 (CAD) 建模。这些 设计可来源于对天然器官或组织的数字化图像重构。 例如可通过对人体非侵害的扫描( 如 MRI 或 CT) 或精细分层的三维重构等得到图像数据， 也可利用一些理论上的原理、 法则进 说 明 书 CN 104287875 A 4 3/4 页 5 行空间结构的设计， 得到组织的数据结构 上述生物打印机包括 6 个可更换的打印喷头， 带有电加热装置的微注射器型电动喷 头、 活塞开关型气动喷头和容积型压电喷头 （图1） 。 本发明的带有电加热装置微注射器型电 动喷头是为打印高黏度的支架材料研制的， 通过电加热装置， 。
18、能根据需要加热改变支架材 料的黏度， 获得所需喷射性能的流体。 喷头为全不锈钢结构， 喷射推力大， 性能稳定， 易拆卸 清洗消毒。 但微注射器型电动喷头打印低黏度支架材料时， 由于材料运动惯性较大， 停喷以 后少量材料会从喷嘴流出， 产生 “流延” 现象， 因此这对这一不足， 又研制了活塞开关型气动 喷头用于打印低黏度的支架材料。细胞打印采用 MicroFab 公司的容积型压电喷头， 对细胞 液控制能力强， 容易实现高精度喷射， 对细胞伤害小， 细胞存活率大于90%。 针对不同的组织 工程器官的支架材料和细胞不同选用合适的打印喷头 本发明设计了生物打印机的无菌恒温装置， 使其带有灭菌功能， 打。
19、印材料加装完成后 可进行灭菌， 达到净化打印环境的目的， 并且可以使打印环境保持使支架材料固化又能使 细胞成活的温度。 0005 本发明还提供了利用上述多功能生物打印机系统制备组织工程器官的方法， 包括 以下步骤 ： （1） 建立要打印的植入体的计算机实体模型， 所述实体模型来源于人体的不同组织和 器官， 对其进行切片分层， 得到每层的形状信息， 并将平面信息通过软件栅格化 ； （2） 配制需要进行组织工程器官打印的多种支架材料和多种细胞液 ； （3） 将所有喷头拆卸清洗消毒 ； （4） 将步骤 （2） 配制好的支架材料和细胞液分别加入到打印该材料的喷头中， 封闭打 印环境后， 进行紫外线消毒。
20、 30 分钟 ； （5） 将步骤 （1） 设计好的含有器官形状信息的文件输入到控制系统的软件中， 控制生物 打印机工作 ； （6） 将生物打印机的工作环境温度控制在 0 到 40之间， 打印机喷头在打印平台上沿 xy 轴移动， 移动速度为 1-20mm， 形成支架的回形平面结构 （图 2-（1） ） ， 打完一层后， 打印喷 头沿z轴方向向上移动0.15-0.2mm， 打印下一层， 打印的回形平面结构与上一层成90度， 两 层打印完成后成为栅格化结构 （图 2-（2） ） ， 在栅格的空隙位置喷射细胞液 （图 2-（3） ） ， 完 成后， 打印喷头沿 z 轴方向向上移动 0.15-0.2mm。
21、， 如此反复， 逐层堆积成型 （图 2-（4） ） ， 直 到整个组织工程器官打印完成 上述步骤 （2） 中的支架材料可以为天然生物材料和人工合成高分子材料， 优选天然生 物材料， 更优选胶原、 细胞外基质蛋白、 多糖和丝素蛋白中的一种或几种 上述步骤 （2） 中的细胞液为细胞液含有细胞和细胞生长所需的葡萄糖、 氨基酸、 无机 盐、 细胞生长因子等。 0006 本发明的有益效果 （1） 本发明采用多喷头、 多材料的方式打印组织工程器官， 将器官所需的多种细胞直接 打印到生物支架中， 实现了不同的细胞在生物支架中的精准定位和精确控制该位置所需要 的细胞量。本发明可以广泛应用与各类组织工程器官的打。
22、印成型， 并且可以精确控制组织 工程器官的形态和相应参数 （2） 本发明能够打印具有复杂的外部和内部形态的组织工程器官， 能满足临床需要 说 明 书 CN 104287875 A 5 4/4 页 6 （3） 本发明能根据人体组织或器官的不同需要， 调整打印参数， 结合支架和多种细胞联 合打印的优势， 能直接成型天然生物材料和人工合成高分子材料的支架， 并在需要的位置 直接打印该位置所需要的细胞， 用于组织工程和再生医学。 附图说明 图 1 为包括 6 个可更换的打印喷头的生物打印机示意图 ； 图 2 为生物打印机打印喷头 的工作过程示意图 ： 图 2 中 （1） 即打完一层形成支架的回形平面结构， 图 2 中 （2） 即两层打 印完成后成为栅格化结构， 图 2 中 （3） 即在栅格的空隙位置喷射细胞液， 图 2 中 （4） 即逐层 堆积成型。 说 明 书 CN 104287875 A 6 1/1 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104287875 A 7 。