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1、(10)申请公布号 CN 104073902 A (43)申请公布日 2014.10.01 CN 104073902 A (21)申请号 201410229105.4 (22)申请日 2014.05.28 D01F 4/00(2006.01) C07K 14/78(2006.01) (71)申请人 中国科学院烟台海岸带研究所 地址 264003 山东省烟台市莱山区春晖路 17 号 (72)发明人 闫鸣艳 秦松 李杰 (74)专利代理机构 沈阳科苑专利商标代理有限 公司 21002 代理人 周秀梅 李颖 (54) 发明名称 一种水产胶原自组装形成纤维的方法 (57) 摘要 本发明涉及生物材料领域。
2、， 具体的说一种水 产胶原自组装形成纤维的方法。将胶原溶解于醋 酸溶液中， 离心取上清液， 上清液与磷酸盐缓冲 液在冰浴中混合， 搅拌均匀， 调节溶液 pH， 使其在 20-30水浴锅中， 水浴 12-48h， 即得呈现明暗相 间横纹的自组装体胶原纤维。由本方法所得水产 胶原自组装体为丝状纤维， 在原子力显微镜下可 观察到胶原纤维呈现明暗相间的横纹， 与鱼皮中 天然存在的胶原纤维形态极其相似， 在医用生物 材料领域具有潜在的应用前景。本发明方法简单 易操作， 未采用有机溶剂， 无毒害作用， 符合绿色 化学的要求。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 2 页 (19。
3、)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 (10)申请公布号 CN 104073902 A CN 104073902 A 1/1 页 2 1. 一种水产胶原自组装形成纤维的方法， 其特征在于 ： 将胶原溶解于醋酸溶液中， 离心取上清液， 上清液与磷酸盐缓冲液在冰浴中混合， 搅拌均匀， 调节溶液 pH， 使其在 20-30水浴锅中， 水浴 12-48h， 即得呈现明暗相间横纹的自组装体胶原纤维。 2. 按权利要求 1 所述的水产胶原自组装形成纤维的方法， 其特征在于 ： (1) 将水产胶原用 0.1-0.5mol/L 的醋酸溶液搅拌溶解 24-7。
4、2h， 配制成浓度 1-4mg/mL 的胶原溶液 ； (2) 将步骤 (1) 溶液于 20,000-30,000g 的条件下离心 30-60min， 取上清液， 待用 ； (3) 配制 40-80mM 的含有 65-520mM 的氯化钠的磷酸盐缓冲液， 滤纸过滤， 待用 ； (4) 将步骤 (3) 所得溶液在冰浴条件下缓慢加入到步骤 (2) 溶液中， 并不断搅拌， 使二 者最终体积比为 1:3-1:1 ； (5) 用氢氧化钠溶液调节步骤 (4) 溶液的 pH 至 7.4-8.4 ； (6) 将步骤 (5) 所得溶液置于 20-30水浴锅中， 水浴 12-48h， 期间在溶液略见浑浊时 取出振荡。
5、后立即放回， 即得胶原纤维。 3. 按权利要求 1 或 2 所述的水产胶原自组装形成纤维的方法， 其特征在于 ： 所述的水 产胶原来源于罗非鱼皮、 鲤鱼皮、 草鱼皮、 青鱼皮、 鲢鱼皮或鳙鱼皮的酸溶性胶原或酶促溶 性胶原。 4. 按权利要求 2 所述的水产胶原自组装形成纤维的方法， 其特征在于 ： 所述步骤 (1) 和 (2) 的在 4条件下进行。 5. 按权利要求 2 所述的水产胶原自组装形成纤维的方法， 其特征在于 ： 所述磷酸盐缓 冲液为磷酸氢二钠磷酸二氢钠缓冲液， pH7.4。 6. 按权利要求 2 所述的水产胶原自组装形成纤维的方法， 其特征在于 ： 所述氢氧化钠 溶液是摩尔浓度为 。
6、10-15mol/L 的氢氧化钠溶液， 滤纸过滤。 权 利 要 求 书 CN 104073902 A 2 1/4 页 3 一种水产胶原自组装形成纤维的方法 技术领域 0001 本发明涉及生物材料领域， 具体的说一种水产胶原自组装形成纤维的方法。 背景技术 0002 胶原是动物组织中的一类结构蛋白， 约占总蛋白量的 1/3， 广泛分布于动物的皮 肤、 骨骼、 软骨、 结缔组织、 腱、 角膜、 内脏细胞间质、 肌腔、 韧带、 巩膜等部位。因其具有独特 的三螺旋结构、 低抗原性、 无毒性、 良好的生物相容性和生物可降解性等特点， 已被广泛应 用于组织工程支架材料、 止血海绵、 药物控缓释系统、 基因。
7、传递载体、 美容外科等生物医用 领域。但是， 目前使用的胶原蛋白主要来源于猪皮、 牛皮和猪骨、 牛骨， 近年来由于疯牛病、 口蹄疫等人畜交叉流行病的频发， 猪和牛中来源的胶原蛋白的应用受到了限制。此外， 在 某些宗教人群中， 猪来源的胶原蛋白被禁止使用。 在这种情况下， 水产胶原蛋白由于原料丰 富、 易于提取、 低抗原性、 低致敏性、 高度可溶性、 没有传染病危险和宗教障碍而受到广泛的 关注。 0003 自组装性是胶原的重要特性。 通常， 溶解于溶液中的胶原是游离的多肽链， 而不是 三股螺旋链。 胶原通过自组装能够形成三股螺旋结构， 进而形成纤维等， 这是其在生物材料 领域应用的基础。以往关于。
8、胶原自组装性的研究多针对陆生哺乳动物胶原， 对水产胶原的 探讨较少。 发明内容 0004 本发明目的在于提供一种水产胶原自组装形成纤维的方法。 0005 为实现上述目的， 本发明采用技术方案为 ： 0006 一种水产胶原自组装形成纤维的方法， 将胶原溶解于醋酸溶液中， 离心取上清液， 上清液与磷酸盐缓冲液在冰浴中混合， 搅拌均匀， 调节溶液 pH， 使其在 20-30水浴锅中， 水浴 12-48h， 即得呈现明暗相间横纹的自组装体胶原纤维。 0007 具体是 ： 0008 (1)将水产胶原用0.1-0.5mol/L的醋酸溶液搅拌溶解24-72h， 配制成浓度1-4mg/ mL 的胶原溶液 ； 。
9、0009 (2) 将步骤 (1) 溶液于 20,000-30,000g 的条件下离心 30-60min， 取上清液， 待 用 ； 0010 (3) 配制 40-80mM 的含有 65-520mM 的氯化钠的磷酸盐缓冲液， 滤纸过滤， 待用 ； 0011 (4) 将步骤 (3) 所得溶液在冰浴条件下缓慢加入到步骤 (2) 溶液中， 并不断搅拌， 使二者最终体积比为 1:3-1:1 ； 0012 (5) 用氢氧化钠溶液调节步骤 (4) 溶液的 pH 至 7.4-8.4 ； 0013 (6) 将步骤 (5) 所得溶液置于 20-30水浴锅中， 水浴 12-48h， 期间在溶液略见浑 浊时取出振荡后立。
10、即放回， 即得胶原纤维。 0014 所述的水产胶原来源于罗非鱼皮、 鲤鱼皮、 草鱼皮、 青鱼皮、 鲢鱼皮或鳙鱼皮的酸 说 明 书 CN 104073902 A 3 2/4 页 4 溶性胶原或酶促溶性胶原。 0015 所述步骤 (1) 和 (2) 的在 4条件下进行。 0016 所述磷酸盐缓冲液为磷酸氢二钠磷酸二氢钠缓冲液， pH7.4。 0017 所述氢氧化钠溶液是摩尔浓度为 10-15mol/L 的氢氧化钠溶液， 滤纸过滤。 0018 本发明的优点效果 ： 0019 1. 本发明通过模拟水产动物生理条件， 探讨水产胶原自组装形成纤维的方法。通 过本发明方法所得胶原纤维为丝状纤维， 在原子力显。
11、微镜下可观察到胶原纤维呈现明暗相 间的横纹， 与鱼皮中天然存在的胶原纤维形态极其相似， 在医用生物材料领域具有潜在的 应用前景。 0020 2. 本发明所用胶原来源于水产品加工下脚料， 充分利用水产品加工下脚料， 不仅 可以减少环境污染和资源的浪费， 而且可以增加水产品加工的附加值， 提高经济效益。 0021 3. 本发明所用胶原为水产胶原， 相对于陆生动物胶原具有无污染、 无病源 ( 如疯 牛病、 口蹄疫、 禽流感等 ) 隐患等优点。 0022 4. 本发明方法简单易操作， 未采用有机溶剂， 无毒害作用， 符合绿色化学的要求。 附图说明 0023 图 1 为本发明实施例提供的水产胶原自组装纤。
12、维扫描电镜图。 0024 图 2 为本发明实施例提供的水产胶原自组装纤维原子力显微镜图像， 其中， A ： 高 度图像 ； B ： 相位图像。 0025 图 3 为本发明实施例提供的鱼皮天然胶原纤维透射电镜图。 具体实施方式 0026 下面用具体实施例来进一步说明本发明的实质性内容， 但本发明的内容并不局限 于此。 0027 下述实施例中各鱼皮的酸溶性胶原或酶促溶性胶原的制备均可按照常规技术获 得。 0028 实施例 1 0029 (1)将罗非鱼皮酶促溶性胶原用0.5mol/L的醋酸溶液在4条件下搅拌溶解24h， 配制成浓度 2mg/mL 的胶原溶液 ； 0030 其中， 罗非鱼皮酶促溶性胶原。
13、的制备可按照常规技术获得。 0031 (2)将步骤(1)溶液于4下， 以20,000g的条件下离心30min， 取上清液， 待用 ； 0032 (3) 配制 40mM 的磷酸盐缓冲液， 其中含有 260mM 的氯化钠， 滤纸过滤， 待用 ； 其中， 磷酸氢二钠磷酸二氢钠缓冲液， pH7.4 ； 0033 (4) 将步骤 (3) 所得溶液在冰水浴条件下缓慢加入到步骤 (2) 溶液中， 并不断搅 拌， 使二者最终体积比为 1:1 ； 0034 (5) 摩尔浓度为 12mol/L 的氢氧化钠溶液， 滤纸过滤， 而后用过滤后的氢氧化钠溶 液调节步骤 (4) 溶液的 pH 至 7.4 ； 0035 (6。
14、) 将步骤 (5) 所得溶液置于 30水浴锅中， 水浴 24h， 期间在溶液略见浑浊时取 出振荡后立即放回， 即得胶原纤维 ( 参见图 1-3)。 说 明 书 CN 104073902 A 4 3/4 页 5 0036 上述所得胶原纤维体貌特征如图 1 和 2 所示， 可以看出胶原纤维是呈现明暗相间 横纹的丝状结构， 与图 3 显示的鱼皮中天然存在的胶原纤维形态极其相似。 0037 实施例 2 0038 (1) 将罗非鱼皮酸溶性胶原用 0.1mol/L 的醋酸溶液搅拌溶解 72h， 配制成浓度 1mg/mL 的胶原溶液 ； 0039 其中， 罗非鱼皮酸溶性胶原可按照现有常规的方式制备所得。 0。
15、040 (2) 将步骤 (1) 溶液于 30,000g 的条件下离心 40min， 取上清液， 待用 ； 0041 (3) 配制 80mM 的磷酸盐缓冲液， 其中含有 520mM 的氯化钠， 滤纸过滤， 待用 ； 0042 (4) 将步骤 (3) 所得溶液在冰浴上缓慢加入到步骤 (2) 溶液中， 并不断搅拌， 使二 者最终体积比为 1:3 ； 0043 (5) 摩尔浓度为 12mol/L 的氢氧化钠溶液， 滤纸过滤， 而后用过滤后的氢氧化钠溶 液调节步骤 (4) 溶液的 pH 至 8.0 ； 0044 (6) 将步骤 (5) 所得溶液置于 25水浴锅中， 水浴 24h， 期间在溶液略见浑浊时取。
16、 出振荡后立即放回， 即得胶原纤维。 0045 实施例 3 0046 (1) 将鲤鱼皮酶促溶性胶原用 0.2mol/L 的醋酸溶液搅拌溶解 48h， 配制成浓度 4mg/mL 的胶原溶液 ； 0047 其中， 鲤鱼皮酶促溶性胶原可按照现有常规的方式制备所得。 0048 (2) 将步骤 (1) 溶液于 30,000g 的条件下离心 60min， 取上清液， 待用 ； 0049 (3) 配制 60mM 的磷酸盐缓冲液， 其中含有 260mM 的氯化钠， 滤纸过滤， 待用 ； 0050 (4) 将步骤 (3) 所得溶液在冰浴上缓慢加入到步骤 (2) 溶液中， 并不断搅拌， 使二 者最终体积比为 1:。
17、2 ； 0051 (5) 摩尔浓度为 10mol/L 的氢氧化钠溶液， 滤纸过滤， 而后用过滤后的氢氧化钠溶 液调节步骤 (4) 溶液的 pH 至 8.4 ； 0052 (6) 将步骤 (5) 所得溶液置于 20水浴锅中， 水浴 48h， 期间在溶液略见浑浊时取 出振荡后立即放回， 即得胶原纤维。 0053 实施例 4 0054 (1) 将青鱼皮酶促溶性胶原用 0.4mol/L 的醋酸溶液搅拌溶解 36h， 配制成浓度 3mg/mL 的胶原溶液 ； 0055 (2) 将步骤 (1) 溶液于 25,000g 的条件下离心 50min， 取上清液， 待用 ； 0056 (3) 配制 40mM 的磷。
18、酸盐缓冲液， 其中含有 65mM 的氯化钠， 滤纸过滤， 待用 ； 0057 (4) 将步骤 (3) 所得溶液在冰浴上缓慢加入到步骤 (2) 溶液中， 并不断搅拌， 使二 者最终体积比为 1:1 ； 0058 (5) 摩尔浓度为 15mol/L 的氢氧化钠溶液， 滤纸过滤， 而后用过滤后的氢氧化钠溶 液调节步骤 (4) 溶液的 pH 至 8.0 ； 0059 (6) 将步骤 (5) 所得溶液置于 25水浴锅中， 水浴 24h， 期间在溶液略见浑浊时取 出振荡后立即放回， 即得胶原纤维。 0060 实施例 5 0061 (1) 将鳙鱼皮酸溶性胶原用 0.5mol/L 的醋酸溶液搅拌溶解 48h，。
19、 配制成浓度 4mg/ 说 明 书 CN 104073902 A 5 4/4 页 6 mL 的胶原溶液 ； 0062 (2) 将步骤 (1) 溶液于 20,000g 的条件下离心 60min， 取上清液， 待用 ； 0063 (3) 配制 60mM 的磷酸盐缓冲液， 其中含有 130mM 的氯化钠， 滤纸过滤， 待用 ； 0064 (4) 将步骤 (3) 所得溶液在冰浴上缓慢加入到步骤 (2) 溶液中， 并不断搅拌， 使二 者最终体积比为 1:2 ； 0065 (5) 摩尔浓度为 10mol/L 的氢氧化钠溶液， 滤纸过滤， 而后用过滤后的氢氧化钠溶 液调节步骤 (4) 溶液的 pH 至 7.4 ； 0066 (6) 将步骤 (5) 所得溶液置于 30水浴锅中， 水浴 12h， 期间在溶液略见浑浊时取 出振荡后立即放回， 即得胶原纤维。 说 明 书 CN 104073902 A 6 1/2 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104073902 A 7 2/2 页 8 图 3 说 明 书 附 图 CN 104073902 A 8 。