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1、(10)申请公布号 CN 102964462 A (43)申请公布日 2013.03.13 C N 1 0 2 9 6 4 4 6 2 A *CN102964462A* (21)申请号 201210488682.6 (22)申请日 2012.11.26 C08B 37/00(2006.01) A24B 15/40(2006.01) (71)申请人浙江中烟工业有限责任公司 地址 310009 浙江省杭州市上城区建国南路 288号 (72)发明人杨君 储国海 黄芳芳 蒋健 张安强 (74)专利代理机构杭州天勤知识产权代理有限 公司 33224 代理人胡红娟 (54) 发明名称 一种卤地菊多糖及其制。
2、备方法和应用 (57) 摘要 本发明公开了一种卤地菊多糖及其制备方法 和应用，卤地菊多糖的主要结构为：以26连接 的-D-果聚糖为主链，以与主链12连接的 -D-葡萄糖为端基。该多糖具有优良保湿效果 的卤地菊多糖，可作为卷烟烟丝的保湿剂。本发明 还公开了一种卤地菊多糖的制备方法，提取步骤 包括：样品干燥、粉碎浸提离心、过滤浓缩 醇沉冻干粗多糖，分离纯化步骤包括：粗 多糖离子交换柱层析收集冻干凝胶柱层 析收集冻干纯多糖，操作简单，无污染，分 离纯化效果好，杂质去除率高。 (51)Int.Cl. 权利要求书1页 说明书6页 附图4页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利。
3、要求书 1 页 说明书 6 页 附图 4 页 1/1页 2 1.一种卤地菊多糖，其特征在于，所述的卤地菊多糖的主要结构为：以26连接的 -D-果聚糖为主链，以与主链12连接的-D-葡萄糖为端基。 2.根据权利要求1所述的卤地菊多糖的制备方法，其特征在于，包括步骤： a.将干燥的卤地菊样品粉碎，得到卤地菊粉体； b.将卤地菊粉体在水中提取，得到提取液，其中，卤地菊粉体与水的质量比为1： 15-50； c.提取液冷却后经离心和真空抽滤得到滤液，滤液真空浓缩至提取液体积的三十分之 一至十分之一，得到浓缩液； d.向浓缩液中加入体积分数为95%-100%的乙醇，使体系中乙醇体积分数达到 50%-70%。
4、，搅拌，静置8h-12h，离心，收集沉淀，冷冻干燥后即得粗多糖； e.将粗多糖用水溶解，上二乙氨乙基琼脂糖凝胶离子交换柱，以水洗脱，收集洗脱液浓 缩，冻干，再用水溶解，上凝胶柱层析，以水洗脱，收集洗脱液浓缩，冻干，得到卤地菊多糖。 3.根据权利要求2所述的卤地菊多糖的制备方法，其特征在于，步骤a中，所述的卤地 菊样品选用卤地菊全株。 4.根据权利要求2所述的卤地菊多糖的制备方法，其特征在于，步骤a中，卤地菊粉体 的目数为20目-100目。 5.根据权利要求2所述的卤地菊多糖的制备方法，其特征在于，步骤b中，卤地菊粉体 在沸水中提取2小时-3小时。 6.根据权利要求2或5所述的卤地菊多糖的制备方。
5、法，其特征在于，步骤b中，卤地菊 粉体在水中提取2次-5次，每次卤地菊粉体与水的质量比为1：15-50。 7.根据权利要求1所述的卤地菊多糖在卷烟中的应用，其特征在于，所述的卤地菊多 糖作为卷烟烟丝保湿剂在卷烟中的应用。 8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的卤地菊多糖的用量为卷烟烟丝质 量的0.02-0.2。 9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述的应用方法包括：将所述的卤地 菊多糖经水溶解，配制成0.08mg/ml-0.8mg/ml的溶液喷加到卷烟烟丝上，制备卷烟。 权 利 要 求 书CN 102964462 A 1/6页 3 一种卤地菊多糖及其制备方法和应用 技术领。
6、域 0001 本发明涉及植物多糖领域，具体涉及一种卤地菊多糖及其制备方法和应用。 背景技术 0002 卤地菊Wedelia prostrata(Hook.Et Arn.)Hemsl.为菊科蟛蜞菊属植物，在浙江 有广泛分布，全草药用，具有清热凉血、祛痰止咳的作用。目前主要是对卤地菊的二萜、倍半 萜、黄酮类、有机酸类化合物的研究，对其多糖的研究及应用报道还没有出现。 0003 多糖是由10个以上的单糖通过糖苷键连接而成的高分子聚合物，糖类化合物的 分离和纯化是糖类研究中的难点之一，不同的提取纯化方法不仅会直接影响提取的多糖的 性质不同，也可能导致活性结构的变化，因此选择合适的方法是至关重要的，应在。
7、尽可能少 的破坏原有多糖的结构构象的基础上得到较高的提取效率，又需要尽可能的分离纯化得 到较均匀的单一多糖组分。现有的多糖制备方法较多，其中以提取法居多。如中国专利 ZL200410020591.5中公开了一种木耳多糖的提取方法，它是以木耳为原料，采用醇提、微波 或超声波处理，并结合复合酶法酶解，将木耳中的多糖物质充分溶解出来，提高了木耳多糖 的得率，保持了多糖物质的生物活性，有利于人体的吸收；同时，利用木耳多糖加工过程中 剩余的残渣提取碱性木耳多糖，最大限度地利用了原料、节约了资源，从而降低了成本；该 方法对多糖结构破坏小，多糖得率高,能最大程度地发挥出抗肿瘤、降血压、降血脂、降血 糖等功效。
8、。中国专利申请CN201110236229.1中公开了一种西洋参多糖的提取方法，按下 述步骤进行的：一、将西洋参在水中浸泡，煎煮，趁热过滤；二、再用水煎煮两次，合并水煎 液后浓缩，放置冷却；三、醇沉，过滤，滤渣挥发至无醇味，在6090条件下烘干，粉碎，即 得西洋参多糖；该方法采用水提取西洋参多糖，降低成本，提取西洋参多糖的纯度高且收率 高，多糖纯度在38.8%以上，多糖收率在4.7%以上，解决了现有工艺中经醇提后再水提制备 西洋参多糖而存在的纯度低、成本高、收率低的技术问题。可见，不同的多糖应对应适合的 制备方法进行制备。 0004 多糖的化学结构是其生物活性的基础，也是多糖化学研究的难点和关。
9、键。多糖化 学结构复杂，单糖可以多重连接位点连接，构成不同构型的直链和支链，还可以通过硫酸 化、乙酰化、磷酸化、甲基化等衍生形式形成糖衍生物。多糖的结构分类可分为一级结构和 高级结构（包括二级、三级和四级结构），这种分类是沿用蛋白质结构的分类方法。鉴于多糖 结构的复杂性，目前对多糖具体结构的研究也较少。 发明内容 0005 本发明提供了一种具有优良保湿效果的卤地菊多糖，可作为卷烟烟丝的保湿剂。 0006 本发明还提供了一种卤地菊多糖的制备方法，该方法操作简单、工艺环保，适于工 业化生产。 0007 一种卤地菊多糖，其主要结构为：以26连接的-D-果聚糖为主链，以与主链 12连接的-D-葡萄糖为。
10、端基。即所述的卤地菊多糖的主要结构为：-D-Glc-(12) 说 明 书CN 102964462 A 2/6页 4 -D-Fru-(62)-D-Fru- n ，其中，-D-Fru为-D-果聚糖，-D-Glc为-D-葡 萄糖。 0008 所述的卤地菊多糖的制备方法，包括步骤： 0009 a将干燥的卤地菊样品粉碎，得到卤地菊粉体； 0010 b将卤地菊粉体在水中提取，得到提取液，其中，卤地菊粉体与水的质量比为1： 15-50； 0011 c提取液冷却后经离心和真空抽滤得到滤液，滤液真空浓缩至提取液体积的三十 分之一至十分之一，得到浓缩液； 0012 d向浓缩液中加入体积分数为95%-100%的乙醇。
11、，使体系中乙醇体积分数达到 50%-70%，搅拌，静置8h-12h，离心，收集沉淀，冷冻干燥后即得粗多糖； 0013 e将粗多糖用水溶解，上二乙氨乙基琼脂糖凝胶离子交换柱，以水洗脱，收集洗脱 液浓缩，冻干，再用水溶解，上凝胶柱层析，以水洗脱，收集洗脱液浓缩，冻干，得到卤地菊多 糖。 0014 步骤a中，所述的卤地菊样品选用卤地菊全株。 0015 为进一步保证提取的效果，优选： 0016 步骤a中，卤地菊粉体的目数为20目-100目。 0017 步骤b中，卤地菊粉体在100沸水中提取2小时-3小时。 0018 步骤b中，卤地菊粉体在水中提取2次-5次，每次卤地菊粉体与水的质量比为1： 15-50。
12、。 0019 所述的体积分数为95%-100%的乙醇可采用市售产品。 0020 所述的离心的条件优选为：转速为10000rmp，时间为15min，温度为25。在此条 件下，沉淀比较完全。 0021 步骤e中，所述的二乙氨乙基琼脂糖凝胶离子交换柱可选用市售产品，如 DEAE-Sepharose Fast Flow离子柱，柱型为XK 26100cm。 0022 所述的凝胶柱可选用市售产品，如为Sephacryl S-200系列柱，柱型为XK 26100cm。 0023 所述的卤地菊多糖可作为卷烟烟丝保湿剂应用于卷烟中，应用时不需要改变卷烟 原有的加工工艺。 0024 所述的卤地菊多糖的用量优选为卷。
13、烟烟丝质量的0.02-0.2。 0025 所述的卤地菊多糖在卷烟中的应用方法包括：将所述的卤地菊多糖经水溶解，配 制成0.08mg/ml-0.8mg/ml的溶液喷加到卷烟烟丝上，制备卷烟。卷烟的制备采用现有的卷 烟的制备方法如经混丝、平衡、卷烟等工序后，将含卤地菊多糖的烟丝制成卷烟。 0026 本发明结构鉴别时采用以下仪器：高效液相为Waters1525高效液相仪，红外全扫 描采用Nicolet 6700型傅立叶红外光谱仪，气相采用Agilent7890A气相色谱，气质联用采 用Finnigan Trace Ultra-DSQ 气-质联用色谱仪，核磁采用AVANCE （500MHz）傅立 叶超。
14、导核磁共振谱仪。 0027 与现有技术相比，本发明具有如下优点： 0028 本发明卤地菊多糖具有优良的保湿性能，实验证明，卤地菊多糖对卷烟有较好的 保湿性。 说 明 书CN 102964462 A 3/6页 5 0029 本发明卤地菊多糖的制备方法，提取步骤包括：样品干燥、粉碎浸提离心、过 滤浓缩醇沉冻干粗多糖，分离纯化步骤包括：粗多糖离子交换柱层析收集 冻干凝胶柱层析收集冻干纯多糖，操作简单，无污染，分离纯化效果好，杂质去除 率高。结构分析运用多重手段，确保结果的准确性。对卷烟运用研究也具有实际生产意义 和价值。 0030 附图表说明 0031 图1为实施例2中成品的高效液相谱图； 0032。
15、 图2为实施例2中成品的红外全扫描谱图； 0033 图3为实施例2中成品的气相分析谱图； 0034 图4为实施例2中成品的气质联用分析谱图； 0035 图5为实施例2中成品的 1 H核磁谱图； 0036 图6为实施例2中成品的C谱核磁谱图； 0037 图7为实施例4中成品卤地菊多糖、蒸馏水及丙二醇的保湿率随时间变化图。 具体实施方式 0038 本发明结合以下实施例做进一步描述。 0039 保湿率（%）=M/M 0 100%； 0040 其中，M o 为样品放置前水溶液重量，M为某时刻样品的即时重量。 0041 实施例1 0042 将干燥的卤地菊全株样品粉碎至40目，按料液比（质量比）1：20加。
16、入一定量的蒸 馏水，100沸水提取2次，每次3小时，合并2次提取液得到总提取液； 0043 总提取液冷却后经25高速（10000转/分）离心15min和真空抽滤后，真空浓缩 至原总提取液体积的1/10，向浓缩液中加入体积分数95%的乙醇水溶液，使体系中乙醇体 积分数达50%，搅拌，静置10h，离心，收集沉淀，冷冻干燥后即得粗多糖； 0044 将粗多糖用水溶解，上DEAE-Sepharose Fast Flow离子柱（柱型为XK 26100cm 的二乙氨乙基琼脂糖凝胶离子交换柱），以蒸馏水洗脱，收集洗脱液浓缩，冻干，再用水溶 解，上Sephacryl S-200系列凝胶柱（柱型为XK 26100。
17、cm）层析，以蒸馏水洗脱，收集洗脱 液浓缩，冻干得成品卤地菊多糖。 0045 采用高效液相、红外全扫描、气相分析、气质联用及核磁分析成品结构：高效液相 出峰时间为10.502分钟；红外全扫描显示几个特征峰均为-D-果聚糖特征峰；气相分析 显示该糖单糖组成为果糖；气质联用显示了果聚糖的连接方式为26连接；核磁数据与 表1一致。表明：该卤地菊多糖的主要结构为：以26连接的-D-果聚糖为主链，以与 主链12连接的-D-葡萄糖为端基，即-D-Glc-(12)-D-Fru-(62)-D-Fr u- n 。 0046 称取卤地菊多糖2mg，配成0.8mg/ml水溶液，均匀喷洒到平衡好的烟丝20g中，以 等。
18、量蒸馏水及丙二醇做对照，将烟丝放入恒温恒湿箱中，平衡。检测保湿率。保湿率结果显 示：等量的卤地菊多糖、蒸馏水及丙二醇用于烟丝保湿剂时，卤地菊多糖的保湿效果最好， 37小时后保湿率仍高于丙二醇，其比目前常用的保湿效果显著的丙二醇的保湿效果还要 好，且明显高于蒸馏水的保湿效果。表明卤地菊多糖具有优良的保湿效果。 说 明 书CN 102964462 A 4/6页 6 0047 实施例2 0048 将干燥的卤地菊全株样品粉碎至40目，按料液比（质量比）1：30加入一定量的蒸 馏水，100沸水提取2次，每次3小时，合并2次提取液得到总提取液； 0049 总提取液冷却后经25高速（10000转/分）离心1。
19、5min和真空抽滤后，真空浓缩 至原总提取液体积的1/20，向浓缩液中加入体积分数95%的乙醇水溶液，使体系中乙醇体 积分数达60%，搅拌，静置10h，离心，收集沉淀，冷冻干燥后即得粗多糖； 0050 将粗多糖用水溶解，上DEAE-Sepharose Fast Flow离子柱（柱型为XK 26100cm） 离子交换柱，以蒸馏水洗脱，收集洗脱液浓缩，冻干，再用水溶解，上Sephacryl S-200系列 凝胶柱（柱型为XK 26100cm）层析，以蒸馏水洗脱，收集洗脱液浓缩，冻干得成品卤地菊多 糖。 0051 采用高效液相、红外全扫描、气相分析、气质联用及核磁分析成品结构：高效液相 出峰时间为1。
20、0.502分钟；红外全扫描显示几个特征峰均为-D-果聚糖特征峰；气相分析 显示该糖单糖组成为果糖；气质联用显示了果聚糖的连接方式为26连接；核磁数据见 表1。表明：该卤地菊多糖的主要结构为：以26连接的-D-果聚糖为主链，以与主链 12连接的-D-葡萄糖为端基，即-D-Glc-(12)-D-Fru-(62)-D-Fru- n 。 0052 称取卤地菊多糖2mg，配成0.08mg/ml水溶液，均匀喷洒到平衡好的烟丝20g中， 以等量蒸馏水及丙二醇做对照，将烟丝放入恒温恒湿箱中，平衡。检测保湿率。保湿率结 果显示：等量的卤地菊多糖、蒸馏水及丙二醇用于烟丝保湿剂时，卤地菊多糖的保湿效果最 好，37小。
21、时后保湿率仍高于丙二醇，其比目前常用的保湿效果显著的丙二醇的保湿效果还 要好，且明显高于蒸馏水的保湿效果。表明卤地菊多糖具有优良的保湿效果。 0053 表1实施例2中成品的核磁谱图数据 0054 0055 实施例3 0056 将干燥的卤地菊全株样品粉碎至80目，按料液比（质量比）1：40加入一定量的蒸 馏水，100沸水提取2次，每次3小时，合并2次提取液得到总提取液； 0057 总提取液冷却后经25高速（10000转/分）离心15min和真空抽滤后，真空浓缩 至原总提取液体积的1/10，向浓缩液中加入体积分数95%的乙醇水溶液，使体系中乙醇体 说 明 书CN 102964462 A 5/6页 。
22、7 积分数达65%，搅拌，静置10h，离心，收集沉淀，冷冻干燥后即得粗多糖； 0058 将粗多糖用水溶解，上DEAE-Sepharose Fast Flow离子柱（柱型为XK 26100cm） 离子交换柱，以蒸馏水洗脱，收集洗脱液浓缩，冻干，再用水溶解，上Sephacryl S-200系列 凝胶柱（柱型为XK 26100cm）层析，以蒸馏水洗脱，收集洗脱液浓缩，冻干得成品卤地菊多 糖。 0059 采用高效液相、红外全扫描、气相分析、气质联用及核磁分析成品结构：高效液相 出峰时间为10.502分钟；红外全扫描显示几个特征峰均为-D-果聚糖特征峰；气相分析 显示该糖单糖组成为果糖；气质联用显示了果。
23、聚糖的连接方式为26连接；核磁数据与 表1一致。表明：该卤地菊多糖的主要结构为：以26连接的-D-果聚糖为主链，以与 主链12连接的-D-葡萄糖为端基，即-D-Glc-(12)- D-Fru-(62)-D-Fr u- n 。 0060 称取卤地菊多糖2mg，配成0.5mg/ml水溶液，均匀喷洒到平衡好的烟丝20g中，以 等量蒸馏水及丙二醇做对照，将烟丝放入恒温恒湿箱中，平衡。检测保湿率。保湿率结果显 示：等量的卤地菊多糖、蒸馏水及丙二醇用于烟丝保湿剂时，卤地菊多糖的保湿效果最好， 37小时后保湿率仍高于丙二醇，其比目前常用的保湿效果显著的丙二醇的保湿效果还要 好，且明显高于蒸馏水的保湿效果。表。
24、明卤地菊多糖具有优良的保湿效果。 0061 实施例4 0062 将干燥的卤地菊全株样品粉碎至80目，按料液比（质量比）1：15加入一定量的蒸 馏水，100沸水提取2次，每次3小时，合并2次提取液得到总提取液； 0063 总提取液冷却后经25高速（10000转/分）离心15min和真空抽滤后，真空浓缩 至原总提取液体积的1/20，向浓缩液中加入体积分数95%的乙醇水溶液，使体系中乙醇体 积分数达60%，搅拌，静置10h，离心，收集沉淀，冷冻干燥后即得粗多糖； 0064 将粗多糖用水溶解，上DEAE-Sepharose Fast Flow离子柱（柱型为XK 26100cm） 离子交换柱，以蒸馏水洗。
25、脱，收集洗脱液浓缩，冻干，再用水溶解，上Sephacryl S-200系列 凝胶柱（柱型为XK 26100cm）层析，以蒸馏水洗脱，收集洗脱液浓缩，冻干得成品卤地菊多 糖。 0065 采用高效液相、红外全扫描、气相分析、气质联用及核磁分析成品结构：高效液相 出峰时间为10.502分钟；红外全扫描显示几个特征峰均为-D-果聚糖特征峰；气相分析 显示该糖单糖组成为果糖；气质联用显示了果聚糖的连接方式为26连接；核磁数据与 表1一致。表明：该卤地菊多糖的主要结构为：以26连接的-D-果聚糖为主链，以与 主链12连接的-D-葡萄糖为端基，即-D-Glc-(12)-D -Fru-(62)-D-Fr u-。
26、 n 。 0066 称取卤地菊多糖2mg，配成0.2mg/ml水溶液，均匀喷洒到平衡好的烟丝20g中，以 等量蒸馏水及丙二醇做对照，将烟丝放入恒温恒湿箱中，平衡。检测保湿率，如图7。图7显 示，等量的卤地菊多糖、蒸馏水及丙二醇用于烟丝保湿剂时，卤地菊多糖的保湿效果最好， 37小时后保湿率仍高达44%，其比目前常用的保湿效果显著的丙二醇的保湿效果还要好， 且明显高于蒸馏水的保湿效果。 0067 实施例5 0068 将干燥的卤地菊全株样品粉碎至100目，按料液比（质量比）1：50加入一定量的蒸 说 明 书CN 102964462 A 6/6页 8 馏水，100沸水提取5次，每次2小时，合并2次提取。
27、液得到总提取液； 0069 总提取液冷却后经25高速（10000转/分）离心15min和真空抽滤后，真空浓缩 至原总提取液体积的1/30，向浓缩液中加入体积分数100%的乙醇水溶液，使体系中乙醇体 积分数达70%，搅拌，静置8h，离心，收集沉淀，冷冻干燥后即得粗多糖； 0070 将粗多糖用水溶解，上DEAE-Sepharose Fast Flow离子柱（柱型为XK 26100cm） 离子交换柱，以蒸馏水洗脱，收集洗脱液浓缩，冻干，再用水溶解，上Sephacryl S-200系列 凝胶柱（柱型为XK 26100cm）层析，以蒸馏水洗脱，收集洗脱液浓缩，冻干得成品卤地菊多 糖。 0071 采用高效。
28、液相、红外全扫描、气相分析、气质联用及核磁分析成品结构：高效液相 出峰时间为10.502分钟；红外全扫描显示几个特征峰均为-D-果聚糖特征峰；气相分析 显示该糖单糖组成为果糖；气质联用显示了果聚糖的连接方式为26连接；核磁数据与 表1一致。表明：该卤地菊多糖的主要结构为：以26连接的-D-果聚糖为主链，以与 主链12连接的-D-葡萄糖为端基，即-D-Glc-(12)-D-Fru-(62)-D-Fr u- n 。 0072 称取卤地菊多糖0.4mg，配成0.4mg/ml水溶液，均匀喷洒到平衡好的烟丝20g中， 以等量蒸馏水及丙二醇做对照，将烟丝放入恒温恒湿箱中，平衡。检测保湿率。保湿率结 果显示。
29、：等量的卤地菊多糖、蒸馏水及丙二醇用于烟丝保湿剂时，卤地菊多糖的保湿效果最 好，37小时后保湿率仍高于丙二醇，其比目前常用的保湿效果显著的丙二醇的保湿效果还 要好，且明显高于蒸馏水的保湿效果。表明卤地菊多糖具有优良的保湿效果。 0073 本发明中，提取溶剂选用水，在水中提取可保证有效成分的提取，提取的次数并没 有严格的限制，可适当增加或减少。本发明制备方法中参数的变化并不影响卤地菊多糖的 制备，因此本发明制备方法中任意参数的组合均可实现卤地菊多糖的制备。在此不再赘述。 说 明 书CN 102964462 A 1/4页 9 图1 图2 说 明 书 附 图CN 102964462 A 2/4页 10 图3 图4 说 明 书 附 图CN 102964462 A 10 3/4页 11 图5 图6 说 明 书 附 图CN 102964462 A 11 4/4页 12 图7 说 明 书 附 图CN 102964462 A 12 。