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1、(10)申请公布号 CN 102921192 A (43)申请公布日 2013.02.13 C N 1 0 2 9 2 1 1 9 2 A *CN102921192A* (21)申请号 201210153266.0 (22)申请日 2012.05.16 B01D 15/22(2006.01) B01D 15/10(2006.01) (71)申请人中国计量科学研究院 地址 100013 北京市朝阳区北三环东路18 号 (72)发明人盛灵慧 高运华 黄峥 李佳 马康 王晶 李良 (74)专利代理机构北京海虹嘉诚知识产权代理 有限公司 11129 代理人张涛 (54) 发明名称 一种制备高纯度单不饱。
2、和脂肪酸的方法 (57) 摘要 本发明提供了一种制备高纯度单不饱和脂肪 酸顺、反式异构体的方法。本发明首次采用低压反 相C18柱层析技术对单不饱和脂肪酸混合物粗品 进行分离纯化。本方法可用于百克级到公斤级高 纯度单不饱和脂肪酸的制备，并可实现单不饱和 脂肪酸顺反异构体的拆分；实验设备简单，操作 方便，节约成本。 (51)Int.Cl. 权利要求书1页 说明书5页 附图2页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 2 页 1/1页 2 1.一种制备高纯度单不饱和脂肪酸顺、反式异构体的方法，采用低压反相柱层析方法 对单不饱和脂肪酸混合物。
3、粗品进行分离纯化，其特征为： 1）填料：十八烷基键合硅胶，填料的粒径为50m，孔径 2）洗脱液：含0.1%（V/V）甲酸和05水（V/V）的甲醇溶液； 3）监测：采用溴甲酚绿指示剂进行产物监测； 4）收集、浓缩：分段收集与溴甲酚氯反应显黄色的流份，然后分别进行减压浓缩； 5）气相色谱检测：采用气相色谱对4）中所得的浓缩的流份进行检测，通过与标准品的 比对，确定单不饱和脂肪酸顺、反式异构体及脂肪酸纯度。 2.权利要求1所述的方法，洗脱液的流速为2ml/min-5ml/min。 3.权利要求1所述的方法，柱温为：15-25。 4.权利要求1所述的方法，所述单不饱和脂肪酸选自肉豆蔻油酸、棕榈油酸、油。
4、酸或花 生油酸。 权 利 要 求 书CN 102921192 A 1/5页 3 一种制备高纯度单不饱和脂肪酸的方法 技术领域 ： 0001 本发明属于食品领域，具体涉及一种制备高纯度单不饱和脂肪酸，特别是能够制 备高纯度的单不饱和脂肪酸异构体的方法。 背景技术 ： 0002 单不饱和脂肪酸是指含分子结构中含有一个双键的脂肪酸，其种类和来源 极为丰富，如肉豆蔻油酸(Myristoleic acid)、棕榈油酸(Palmitoleic acid)、油酸 (Octadecenoic acid)、花生油酸(Eicosenoic acid)、芥酸(Docosenoic acid)的顺反异构 体等。 00。
5、03 在食品、化工、医药等行业中，往往需用高纯度的单不饱和脂肪酸作为原料和测定 标准。有关脂肪酸的提取、制备已有多篇文献报道，如： 0004 T.C.Marquardt,R.F.Wilson.An improved reversed-phase thin-layer chromatography method for separation of fatty acid methyl esters.Journal of the American Oil Chemists Society,1998,75(12):1889-1892采用银离子色谱法，实现了饱 和脂肪酸和单不饱和脂肪酸的分离。但银离子色。
6、谱填料非常昂贵，只适用于mg级别多不饱 和脂肪酸样品分离纯化，并且填料制备过程复杂耗时，并且通常使用正己烷、石油醚等低极 性有机溶剂，费用较高，产物纯度低。 0005 傅红,爱咏.分子蒸馏法制备鱼油多不饱和脂肪酸.无锡轻工大学学 报,2002,21(6):617，以及胡伟,李湘洲,吴志平,毛鹏飞.分子蒸馏法分离油茶籽油油 酸乙酯工艺研究.中国油脂,2011,36(8):49-52采用分子蒸馏法分别对不饱和脂肪酸和不 饱和脂肪酸乙酯进行了纯化，通过多级处理后所获得的最高的脂肪酸(酯)纯度为91.5%。 但是需要有专用的分子蒸馏设备，并且研究结果显示依靠单一分子蒸馏手段不能获得含量 在99%以上的。
7、不饱和脂肪酸。 0006 还有文献采用尿素包埋法，此法仅适用脂肪酸的前期纯化处理，最高含量在92% 左右，并且需要多次反复冻融，工作效率低。 0007 A.Robles Medina,A.Gimnez Gimnez,F.Garca Camacho,J.A.Sinchez Prez,E.Molina Grima,A.Contreras Gmez.Concentration and Purification of Stea ridonic,Eicosapentaenoic,and Docosahexaenoic Acids from Cod Liver Oil and the Marine Mic。
8、roalga Isochrysis galbana.Journal of the American Oil ChemistsSoci ety,1995,72(5):575-583，采用了反相C18色谱，但是对象为多不饱和脂肪酸，所获得的脂 肪酸最高纯度为96%,且只适用于g级别制备量； 0008 以上这些研究采用的方式主要有尿素包埋、分子蒸馏、正相银离子色谱等技术手 段，目标脂肪酸的得率在30-60%之间，最高纯度在95%左右，并且没有实现顺反异构体的完 全分离。并且正相银离子色谱柱层析方法填料不能反复使用，如果拿到同样量的样品，不仅 纯度难以满足要求，同时花费也更多。同时分子蒸馏需要有专用的。
9、昂贵仪器设备，并且同尿 素包埋一样只适用于样品的初次提纯。因此采用以上的技术手段很难获得含量在99%以上 说 明 书CN 102921192 A 2/5页 4 的单不饱和脂肪酸原料，并且需多次重复才能获得既定纯度的目标脂肪酸。 0009 虽然脂肪酸的分离纯化技术已有大量报道，但多为分离混合脂肪酸甲酯和多不饱 和脂肪酸，很少涉及单不饱和脂肪酸分离，特别没有有关于获取高纯度的单不饱和脂肪酸 的报道。 0010 单不饱和脂肪酸具有一个双键，因此均存在顺反式异构体。 0011 研究发现顺式单不饱和脂肪酸具有重要的生理功能，如对胆固醇有明显的降低作 用，可以减少心脑血管疾病的患病几率，修复神经元细胞等，。
10、已经在药品和保健食品行业得 到了广泛的应用，但是目前含量在99%以上的单不饱和脂肪酸很难从市场获取。 0012 反式单不饱和脂肪酸对人有不利的影响，可以改变人体的正常代谢途径，干扰和 影响婴幼儿的必需脂肪酸吸收，导致心脏病和糖尿病等疾病。目前各国已经对食品中的反 式脂肪酸提出了2%的限量要求，并要求含有反式脂肪酸食品必须进行强制标示。 0013 因此，不仅需要有获取高纯度的单不饱和脂肪酸的方法，而且需要有拆分顺、反式 单不饱和脂肪酸的方法，以用于获取食品、药品分析检测标准和原料。 发明内容 ： 0014 本发明的目的是提供一种制备高纯度单不饱和脂肪酸的方法，特别是研究出一种 获得高纯度的单不饱。
11、和脂肪酸顺、反式异构体的方法。 0015 本发明首次采用低压反相C18柱层析技术进行分离纯化，达到了发明目的。 0016 发明人通过对层析柱填料、洗脱试剂等条件进行反复筛选，优化出了合适的分离 条件，具体的技术方案如下： 0017 1）填料：十八烷基键合硅胶（C18），填料的粒径为50m，孔径 0018 2）洗脱液：含0.1%（V/V）甲酸和水的甲醇溶液，根据单不饱和脂肪酸种类的不同 调节水和甲醇在洗脱液中体积比，通常水的体积为05； 0019 3）监测：采用溴甲酚绿指示剂进行产物监测； 0020 4）收集、浓缩：分段收集与溴甲酚氯反应显黄色的流份，然后分别进行减压浓缩； 0021 5）气相色。
12、谱检测：采用气相色谱对4）中所得的浓缩的流份进行检测，通过与标准 品的比对，确定单不饱和脂肪酸顺、反式异构体及脂肪酸纯度。 0022 通过比较所收集到的脂肪酸洗脱流份与顺反油酸标准品在气相色谱上的保留时 间和峰面积，实现单不饱和脂肪酸顺、反式异构体流份的定性和定量。 0023 用本发明的方法已制备出了多种单不饱和脂肪酸，下表是部分单不饱和脂肪酸标 准品的名称、结构及含量。 0024 说 明 书CN 102921192 A 3/5页 5 0025 由于顺反式脂肪酸在C18固定相上分配系数的不同，在本发明人选择的层析条件 下，如在一定的柱温和水的比例条件下，两种异构体洗脱时间会有不同，通常顺式脂肪。
13、酸会 先于反式脂肪酸被洗脱出来。通过气相色谱检测可以对单不饱和脂肪酸顺、反式的异构体 实现准确的定性和定量。 0026 本发明方法所用的层析柱和待纯化样品的上样量可根据单不饱和脂肪酸的不制 备量选择。 0027 例如，当使用7.3cm120cm(I.D.L)层析柱，将市售的含量在70%-80%之间的脂 肪酸原料配制成0.5g/ml的样品溶液，上样量为100ml时，可得到数十克级的高纯度单不饱 和脂肪酸。 0028 根据制备量及待分离样品的不同种类，确定洗脱液的流速和层析柱的柱温，通常， 洗脱液的流速为2ml/min-5ml/min；柱温：15-25。 0029 本方法的创新点和优点是： 003。
14、0 1、首次采用低压反相C18柱层析技术对单不饱和脂肪酸进行分离纯化； 0031 2、比现有技术制备量大，所获得的产品纯度高；本方法可用于百克级到公斤级高 纯度单不饱和脂肪酸的制备，经一次分离产品纯度可以达到99%； 0032 3、可实现单不饱和脂肪酸顺反异构体的拆分； 说 明 书CN 102921192 A 4/5页 6 0033 4、实验设备简单，操作方便； 0034 5、层析柱中所使用的填料可反复多次使用，节约成本。 附图说明 ： 0035 图1为采用本方法所制备的反式油酸气相色谱图； 0036 图2为采用本方法所制备的顺式油酸气相色谱图； 0037 图3为采用本方法所制备的顺式花生油酸。
15、气相色谱图。 具体实施方式 0038 以下所有实施例中所进行的气相色谱的条件如下： 0039 气相色谱检测前样品的处理： 0040 1、准确称量2mg脂肪酸样品，加入到磨口瓶中 0041 2、加入2%氢氧化钠甲醇溶液8ml 0042 3、在80水浴上回流，直至油滴消失； 0043 4、从冷凝器顶端加入15%三氟化硼甲醇溶液7mL，在80水浴中继续回流2min； 0044 5、从水浴上取下烧瓶，迅速冷却至室温，准确加入10mL正己烷，振荡萃取4min 0045 6、再加入饱和氯化钠水溶液10ml，静置分层，吸取上层正己烷提取溶液1mL，过滤 上机测定。 0046 气相色谱条件： 0047 色谱柱。
16、：毛细管色谱柱（交联键合固定相，含50%氰丙基） 0048 柱长：60m内径0.25mm膜厚0.25m 0049 检测器：氢火焰检测器（FID） 0050 进样器温度：240 0051 检测器温度：260 0052 程序升温： 0053 载气：氮气 0054 分流比：50:1 0055 进样体积：1L 0056 以下所有实施例中所用的材料和仪器如下： 0057 层析柱：7.3cm120cm(I.D.L) 0058 填料：十八烷基键合硅胶（C18）填料，填料的粒径50m，孔径(SiliCycle） 0059 所用试剂甲醇、溴甲酚氯、正己烷、甲酸均为分析纯。 0060 正相薄层板； 0061 气相。
17、色谱仪FID检测器 0062 流份收集器 说 明 书CN 102921192 A 5/5页 7 0063 旋转蒸发仪 0064 恒温水浴锅 0065 万分之一天平 0066 实施例1、顺式油酸和反式油酸的制备 0067 准确称取油酸原料50g（经测定，含顺式油酸40g，反式油酸5g）于烧杯中，加入 100mL甲醇，使油酸原料样品配制成浓度为0.5g/mL的甲醇溶液。 0068 通过移液管将已经配制好的样品均匀缓慢的注入到C18低压制备柱上层，打开层 析柱截止活塞，使样品均匀充分的吸附到C18填料上，待吸附完成后采用流动相进行洗脱。 0069 流动相为含0.1甲酸的甲醇/水(95：5，V/V）混。
18、合溶液，等度洗脱，流速为3mL/ min。 0070 采用流份收集器进行自动收集，每份收集体积为150ml。 0071 通过溴甲酚绿显色反应对收集的洗脱液流份进行显色分析，将在薄层板上与溴甲 酚氯显黄色反应的流份减压浓缩，并通过气相色谱检测分析。 0072 图1为采用本方法所制备的反式油酸气相色谱图；图2为采用本方法所制备的顺 式油酸气相色谱图。 0073 通过比较所收集到的脂肪酸流份与顺反油酸标准品在气相色谱上的保留时间和 峰面积，实现顺反油酸流份的定性和定量。合并纯度在99的流份，进一步在80减压浓 缩，除去其中的甲醇、水和甲酸，分别得到高纯度的32g油酸样品和4.3g反式油酸样品。油 酸。
19、和反式油酸的收率分别为80%和86%，纯度均大于99。 0074 实施例2、高纯度顺式花生油酸制备 0075 准确称取花生油酸原料50g（经测定，含花生油酸37.5g）于烧杯中，加入100mL甲 醇，使花生油酸样品浓度为0.5g/mL。 0076 通过移液管将已经配制好的样品均匀缓慢的注入到C18低压制备柱上层，打开层 析柱截止活塞，使样品均匀充分的吸附到C18填料上，待吸附完成后采用流动相进行洗脱。 0077 流动相为含0.1甲酸的甲醇溶液，等度洗脱，流速为3mL/min。 0078 采用流份收集器进行自动收集，每份收集体积为150ml。 0079 通过溴甲酚绿显色反应对收集的洗脱液流份进行显色分析，将在薄层板上与溴甲 酚氯显黄色反应的流份减压浓缩，并通过气相色谱检测分析。 0080 通过比较所收集到的脂肪酸流份与花生油酸标准品在气相色谱上的保留时间和 峰面积，实现花生油酸流份的定性和定量。合并纯度在99的流份，进一步在80减压浓 缩，除去其中的甲醇和甲酸，得到29g高纯度的顺式花生油酸样品。样品收率为78%，纯度大 于99。 0081 图3为采用本方法所制备的顺式花生油酸气相色谱图。 说 明 书CN 102921192 A 1/2页 8 图1 图2 说 明 书 附 图CN 102921192 A 2/2页 9 图3 说 明 书 附 图CN 102921192 A 。