制备基于透明质酸的组合物的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201380031602.7 (22)申请日 2013.06.14 12004962.2 2012.07.04 EP 13000961.6 2013.02.26 EP 61/660,269 2012.06.15 US C08B 37/08(2006.01) C08L 5/08(2006.01) A61K 8/73(2006.01) A61K 31/728(2006.01) A61K 47/36(2006.01) A61L 27/52(2006.01) C08J 3/075(2006.01) A61K 9/00(2006.01) C08J 。

2、3/24(2006.01) (71)申请人莫茨药物股份两合公司 地址德国法兰克福 (72)发明人海科巴尔格 约瑟夫弗里德里希 沃尔夫冈利贝特劳 罗伯特G福格茨 蒂姆斯蒂芬里格曼 (74)专利代理机构北京品源专利代理有限公司 11332 代理人巩克栋 杨生平 (54) 发明名称 制备基于透明质酸的组合物的方法 (57) 摘要 本发明涉及一种制备组合物的方法，所述组 合物包含交联的第一聚合物，任选地第二聚合物， 所述第二聚合物可为交联的或非交联的，和水，其 中所述第一和第二聚合物选自多糖，所述方法包 含至少步骤(i)至(iv)：(i)交联含所述第一聚 合物和水的混合物；(ii)步骤(i)交联后，终。

3、止所 述交联；(iii)任选地将步骤ii)中得到的产物与 所述第二聚合物混合；(iv)透析步骤(iii)中得 到的产物。 (30)优先权数据 (85)PCT国际申请进入国家阶段日 2014.12.15 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/EP2013/001782 2013.06.14 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2013/185934 EN 2013.12.19 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书21页 (10)申请公布号 CN 104395348 A (43)申请公布日 2015.03.04 CN 10。

4、4395348 A 1/2页 2 1.制备组合物，如凝胶的方法，所述组合物包含交联的第一聚合物，任选地第二聚合 物，所述第二聚合物可为交联的或非交联的，和水，其中所述第一和第二聚合物选自多糖， 所述方法包含至少步骤(i)至(iv)： (i)交联含所述第一聚合物和水的混合物； (ii)步骤(i)交联后，终止所述交联； (iii)任选地将步骤(ii)中得到的产物与所述第二聚合物混合； (iv)透析步骤(ii)或步骤(iii)中得到的产物。 2.根据权利要求1所述方法，其中所述第一和所述第二聚合物可相同或彼此不同。 3.根据权利要求1或2所述方法，其中所述第二聚合物为非交联的。 4.根据前述权利要求。

5、任一项所述方法，其中所述第一和所述第二聚合物选自透明质酸 和/或其钠盐。 5.根据前述权利要求任一项所述方法，其中步骤(i)中使用的第一聚合物具有从 2.5MDa至小于3.0MDa的分子量Mw。 6.根据前述权利要求任一项所述方法，其中步骤(iii)中使用的所述第二聚合物具有 至少3.0MDa的分子量。 7.根据前述权利要求任一项所述方法，其中所述第二聚合物的重量以所述第一聚合物 的重量为基础为少于5，或少于4，例如在0.01-5的范围内，或在0.1-4的范围内， 或在0.1-2.5的范围内，或0.2-2.0，或0.5-1.5。 8.根据前述权利要求任一项所述方法，进一步包含步骤(v): (v。

6、)将麻醉剂和/或抗心律失常剂，如利多卡因，或盐酸利多卡因，或盐酸利多卡因一 水合物，或丁卡因，或利多卡因和丁卡因，掺到步骤(iv)得到的产物中。 9.根据前述权利要求任一项所述方法，进一步包含步骤(vi): (vi)将步骤(iv)或步骤(v)得到的产物装填到注射器中并对其杀菌。 10.根据前述权利要求任一项所述方法，其中步骤(ii)包含步骤(ii.1)，或步骤 (ii.1)和(ii.2)： (ii.1)使步骤(i)中得到的产物经受酸处理； (ii.2)挤压步骤(ii.1)中得到的产物；或 通过筛挤压步骤(ii.1)中得到的产物；或 通过具有500-600m范围如558.8m的筛孔尺寸的筛挤压步。

7、骤(ii.1)中得到的产 物。 11.根据前述权利要求任一项所述方法，其中所述透析步骤(iv)包含步骤(iv.1)至 (iv.3): (iv.1)通过第一筛挤压步骤(iii)中得到的产物，并随后通过第二筛挤压所述第一筛 的挤压产物，其中所述第二筛的筛孔尺寸小于所述第一筛的筛孔尺寸；或 通过第一筛挤压步骤(iii)中得到的产物，并随后通过第二筛挤压所述第一筛的挤压 产物，并随后通过第三筛挤压所述第二筛的挤压产物，其中所述第二筛的筛孔尺寸小于所 述第一筛的筛孔尺寸，且所述第三筛的筛孔尺寸小于所述第二筛的筛孔尺寸；或 通过具有325-425m筛孔尺寸的第一筛挤压步骤(iii)得到的产物；并随后通过具。

8、有 175-225m筛孔尺寸的第二筛挤压所述第一筛的挤压产物；并随后通过具有110-170m 权 利 要 求 书CN 104395348 A 2/2页 3 筛孔尺寸的第三筛挤压所述第二筛的挤压产物； (iv.2)将步骤(iv.1)中得到的产物装填至透析膜中；或将步骤(iv.1)中得到的产物 装填到具有12,000-14,000Da的截留分子量的透析膜中； (iv.3)将步骤(iv.2)中得到的装填的膜放到透析溶液中。 12.组合物，如凝胶，所述组合物包含交联的第一聚合物，任选地第二聚合物，所述第二 聚合物可为交联的或非交联的，和水，其中所述第一和第二聚合物选自多糖，所述组合物可 通过根据权利要。

9、求1-11任一项的方法得到。 13.套件，所述套件包含注射器和根据权利要求1-11任一项中定义的方法制备的组合 物；或包含注射器和权利要求12的组合物。 14.根据权利要求1-11任一项中定义的方法制备的组合物在美容应用中的使用，或权 利要求12的组合物在美容应用中的使用；或根据权利要求1-11任一项中定义的方法制备 的组合物作为皮肤填充剂的使用，或权利要求12的组合物作为皮肤填充剂的使用。 15.用作药剂的组合物，如凝胶，所述组合物包含交联的第一聚合物，任选地第二聚合 物，所述第二聚合物可为交联的或非交联的，和水，其中所述第一和第二聚合物选自多糖， 所述组合物可通过根据权利要求1-11任一项。

10、的方法得到。 权 利 要 求 书CN 104395348 A 1/21页 4 制备基于透明质酸的组合物的方法 技术领域 0001 本发明涉及制备基于多糖如透明质酸的组合物如凝胶的方法，涉及像这样 的组合物，涉及含注射器和所述组合物的套件，并涉及所述组合物作为皮肤填充物 (dermatological ller)的应用。 背景技术 0002 已知使用凝胶如基于多糖和水的水凝胶作为皮肤填充物。此类凝胶通常通过包含 各多糖在含水介质中化学交联的方法制备。合适的多糖例如基于透明质酸，因为它在各生 物体内存在于相同或相似的组合物中。如透明质酸是皮肤的主要成分，在那里它参与组织 修复。因此，它提供最小的副。

11、作用并允许安全应用。 0003 EP 1818344涉及用于制备交联的透明质酸凝胶的方法，包括在酸性或碱性条件下 搅拌并混合含10w/v或更多透明质酸、交联剂和水的混合物。 0004 EP 2 054 039(WO 2008/018796)涉及一种粘弹性水凝胶组合物，其包含能通过立 构复合(stereocomplex)相互作用而彼此相互作用的第一微粒和第二微粒，其中所述第一 微粒包含交联的第一亲水聚合物，所述第一微粒包含第一低聚物或含第一手性部位的共聚 低聚物的外部接枝物，所述第一手性部位包含第一手性单体，且其中所述第二微粒包含交 联的第二亲水聚合物，所述第二微粒包含第二低聚物或含第二手性部位。

12、的共聚低聚物的外 部接枝物，所述第二手性部位包含第二手性单体，所述第二手性单体具有与所述第一手性 单体手性相反的手性，其中所述第一手性部位和所述第二手性部位彼此非共价相互作用。 所述亲水聚合物可为透明质酸。 0005 EP 2 178 923(WO 2009/018076)涉及用于制备交联的透明质酸的方法，所述方法 包含将透明质酸与聚乙二醇基交联剂接触。 0006 WO 2011/119468涉及用于软组织增强的水凝胶，其包含具有零长度交联部分的交 联的生物相容性聚合物和任选地至少一种嵌入到所述交联的生物相容性聚合物中的其它 活性成分。 0007 EP 2 152 329(WO 2008/06。

13、8297)涉及可以单相水凝胶形式皮下或皮内注射的植 入物，其包含由交联的透明质酸组成的凝胶和它的生理学上可接受的盐中的一种。 0008 EP 2 170 961(WO 2009/021526)涉及用在美容医学和整形外科学中的透明质酸 分散液，其中所述分散相包含由交联的透明质酸制成的颗粒，且所述连续相大体上包含线 性透明质酸。 0009 EP 1 699 500(WO 2005/067994)涉及包含交联的、水不溶的、水化的透明质酸凝 胶颗粒的透明质酸组合物。所述组合物可用于在需要组织增强的受试者中增强组织，涉及 一种稳定交联的HA的方法，所述方法包括用含局部麻醉剂的生理兼容的水溶液使水不溶 的。

14、、脱水的交联HA水化，其中稳定组合物的储能模量值G为非稳定组合物的G值的至少 约110，并涉及所述稳定的HA组合物。 0010 WO 2010/015900涉及基于透明质酸和其药学上可接受的盐的软组织装填物，例 说 明 书CN 104395348 A 2/21页 5 如真皮和真皮下装填物，其中所述透明质酸基组合物可包括治疗上有效量的至少一种麻醉 剂，例如，利多卡因。所述包含利多卡因的透明质酸基组合物相对于包含利多卡因的传统的 组合物具有增强的稳定性，例如当进行杀菌技术或长时间储存时。也提供了制备此类透明 质酸基组合物的方法和过程。 0011 FR 2 919 999涉及化妆用组合物或药物组合物。

15、，其包含透明质酸和二价阳离子。 所述组合物可用于处理皱纹。 0012 EP 2 254 584(WO 2009/098127)涉及能释放锌和/或至少一种锌形式的糖盐的 生物相容的可注射产品，涉及含所述产品的组合物，并涉及其用途，尤其是用于装填或增加 生物组织的体积或用于代替或补充生物流体。 0013 EP 2 155 212(WO 2008/139122)涉及透明质酸和至少一种透明质酸降解抑制剂 的组合，其尤其是旨在用在人类的皮肤科和整形外科中。 0014 EP 0 839 159 B1公开了用于制备交联的生物相容的多糖凝胶组合物的方法。所 述方法包含在多官能交联剂存在下多糖的交联，其中形成了。

16、粘弹性的凝胶。 0015 EP 1 711 552 B1涉及一种用于生产生物相容的交联凝胶的方法，包括交联生物 相容的聚合物，用非交联的聚合物稀释所述交联的聚合物，和终止所述交联反应的步骤。 0016 EP 0 466 300 B1涉及一种获得生物相容的粘弹性凝胶悬浮液的方法，所述方法 包含将含交联的透明质酸的生物相容凝胶和可例如为透明质酸的第二聚合物混合，以形成 两相混合物，并涉及像这样的凝胶。 0017 发明目的 0018 本发明的一个目的是提供用于制备基于多糖的组合物如凝胶的方法，所述组合物 可用作皮肤填充物，其中所述组合物应具有优异的稳定性，即在应用后不改变它的性质，尤 其是它的粘弹性。

17、质，且可以根据皮肤学要求以特制的方式调整所述组合物。此外，所述凝胶 应具有优异的皮肤组织相容性。 0019 发明简述 0020 用制备组合物如凝胶的方法实现该目的，所述组合物包含交联的第一聚合物，任 选地可为交联的或非交联的第二聚合物，和水，其中所述第一和第二聚合物选自多糖；和用 根据上述方法制备的组合物实现该目的。 0021 特别地，根据第一方面，本发明涉及制备组合物如凝胶的方法，所述组合物包含交 联的第一聚合物，任选的第二聚合物，所述第二聚合物可为交联的或非交联的，和水，其中 所述第一和第二聚合物选自多糖，所述方法包含至少步骤(i)至(iv)： 0022 (i)交联含所述第一聚合物和水的混。

18、合物； 0023 (ii)步骤(i)交联后，终止所述交联； 0024 (iii)任选地将步骤(ii)中得到的产物与所述第二聚合物混合； 0025 (iv)透析步骤(ii)或步骤(iii)中得到的产物。 0026 在一个实施方案中，所述第二聚合物的存在是强制性的。在该实施方案中，所述方 法要求根据步骤(iii)将步骤(ii)中得到的产物与所述第二聚合物混合。 0027 在一个实施方案中，所述第二聚合物的存在不是必须的。在该实施方案中，所述方 法不要求根据步骤(iii)将步骤(ii)中得到的产物与所述第二聚合物混合。 0028 在一个实施方案中，所述第一和第二聚合物可相同。 说 明 书CN 104。

19、395348 A 3/21页 6 0029 在一个实施方案中，所述第一和第二聚合物可彼此不同。 0030 在一个实施方案中，所述第一聚合物为交联的且所述第二聚合物为非交联的。 0031 在一个实施方案中，所述第一和第二聚合物选自透明质酸及其盐。 0032 在一个实施方案中，所述第一和第二聚合物选自透明质酸或其盐。 0033 在一个实施方案中，所述透明质酸盐为钠盐。 0034 在一个实施方案中，步骤(i)中使用的第一聚合物具有从1.5MDa至小于3.5MDa 或从2.0MDa至小于3.5MDa或从2.5MDa至小于3.0MDa的分子量Mw。 0035 在一个实施方案中，步骤(iii)中使用的第二。

20、聚合物具有至少3.0MDa或至少 3.5MDa的分子量。 0036 在一个实施方案中，所述第二组合物的重量基于所述第一组合物的重量为少于 5，或少于4，例如在0.01-5的范围内，或在0.1-4的范围内，或在0.1-2.5的范围 内，或0.2-2.0，或0.5-1.5。 0037 在一个实施方案中，所述方法包含在步骤(iv)后进一步的步骤(v)： 0038 (v)将麻醉剂或抗心律失常剂，如利多卡因，或盐酸利多卡因，或盐酸利多卡因一 水合物，或丁卡因，掺和到步骤(iv)得到的产物中。 0039 在一个实施方案中，所述方法包含在步骤(iv)后，或步骤(v)后，进一步的步骤 (vi)： 0040 (。

21、vi)将步骤(iv)或步骤(v)得到的产物装填到注射器中并对其杀菌。 0041 在一个实施方案中，步骤(i)中混合物进一步包含碱性磷酸盐缓冲剂。 0042 在一个实施方案中，在步骤(iii)中以具有磷酸盐缓冲剂的混合物的形式提供所 述第二聚合物。 0043 在一个实施方案中，以具有磷酸盐缓冲剂的混合物的形式提供步骤(v)中提供的 所述麻醉剂或抗心律失常剂，如利多卡因或丁卡因。 0044 在一个实施方案中，步骤(i)的反应温度为0-40，如15-40；或25-35，或 25-30，或30至35。 0045 在一个实施方案中，步骤(ii)的反应温度为0-30，如0-10；或3-7。 0046 在一。

22、个实施方案中，步骤(iii)的反应温度为0-30，如0-10；或3-7。 0047 在一个实施方案中，步骤(iv)的反应温度为0-30，如0-10；或3-7。 0048 在一个实施方案中，步骤(i)中，二缩水甘油醚(diglycidyl ether)被用作交联 剂。 0049 在一个实施方案中，步骤(i)中，1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)被用作交联剂。 0050 在一个实施方案中，步骤(ii)包含步骤(ii.1)： 0051 (ii.1)将步骤(i)中得到的产物经受酸处理。 0052 在一个实施方案中，步骤(ii)包含步骤(ii.1)和(ii.2)： 0053 (ii.1)将步骤(i)。

23、中得到的产物经受酸处理； 0054 (ii.2)挤压步骤(ii.1)中得到的产物；或 0055 通过筛(sieve)挤压步骤(ii.1)中得到的产物；或 0056 通过具有500-600m范围的筛孔尺寸的筛挤压步骤(ii.1)中得到的产物。 0057 在一个实施方案中，根据步骤(iv)的所述透析步骤进一步包括步骤(iv.1)至 说 明 书CN 104395348 A 4/21页 7 (iv.3)：(iv.1)通过第一筛挤压步骤(iii)中得到的产物，并随后通过第二筛挤压所述第 一筛的挤压产物，其中所述第二筛的筛孔尺寸小于所述第一筛的筛孔尺寸；或 0058 通过第一筛挤压步骤(iii)中得到的产。

24、物，并随后通过第二筛挤压所述第一筛的 挤压产物，并随后通过第三筛挤压所述第二筛的挤压产物，其中所述第二筛的筛孔尺寸小 于所述第一筛的筛孔尺寸，且所述第三筛的筛孔尺寸小于所述第二筛的筛孔尺寸； 0059 (iv.2)将步骤(iv.1)中得到的产物装填至透析膜中； 0060 (iv.3)将步骤(iv.2)中得到的装填的膜放到透析溶液中。 0061 在一个实施方案中，根据步骤(iv)的所述透析步骤进一步包括步骤(iv.1)至 (iv.3)： 0062 (iv.1)通过具有325-425m筛孔尺寸的第一筛挤压步骤(iii)得到的产物；并 随后通过具有175-225m筛孔尺寸的第二筛挤压所述第一筛的挤压。

25、产物；并随后通过具 有110-170m筛孔尺寸的第三筛挤压所述第二筛的挤压产物； 0063 (iv.2)将步骤(iv.1)中得到的产物装填到具有12,000-14,000Da的截留分子量 的透析膜中； 0064 (iv.3)将步骤(iv.2)中得到的装填的膜放到透析溶液中。 0065 上述实施方案的任一个实施方案可与至少一个选自上述实施方案的另一个实施 方案结合。 0066 根据本发明的第二方面，本发明涉及组合物，如凝胶，所述组合物包含交联的第一 聚合物，任选地第二聚合物，所述第二聚合物可为交联的或非交联的，和水，其中所述第一 和第二聚合物选自多糖，所述组合物可通过根据所述第一方面的方法或根据。

26、所述第一方面 的方法和其中限定的任一实施方案或至少两个实施方案的任一组合得到。 0067 根据本发明的第三方面，本发明涉及套件，所述套件包含注射器和根据所述第二 方面的组合物，或根据所述第一方面的方法制备的组合物。 0068 根据本发明的第四方面，本发明涉及根据所述第二方面的组合物在美容应用中的 使用，或涉及根据所述第一方面的方法制备的组合物在美容应用中的使用。 0069 在一个实施方案中，所述组合物被用作皮肤填充物。 0070 根据本发明的第五方面，本发明涉及用作药剂的根据所述第二方面的组合物如凝 胶。 0071 发明详述 0072 根据所述第一方面，本发明涉及制备含交联的第一聚合物、可为交。

27、联的或非交联 的任选地第二聚合物和水的组合物的方法，其中所述第一和第二聚合物选自多糖，所述方 法包含至少步骤(i)至(iv)： 0073 (i)交联含所述第一聚合物和水的混合物； 0074 (ii)步骤(i)交联后，终止所述交联； 0075 (iii)任选地将步骤(ii)中得到的产物与所述第二聚合物混合； 0076 (iv)透析步骤(ii)或步骤(iii)中得到的产物。 0077 本公开内容中使用的术语“组合物”包含含交联的第一聚合物、可为交联的或非交 联的任选地第二聚合物和水的产物。 0078 在一个实施方案中，所述组合物为凝胶如水凝胶。本文中使用的术语“凝胶”包含 说 明 书CN 1043。

28、95348 A 5/21页 8 同时具有粘性和弹性性质的产物。因此，所述术语包含粘弹性产物。在大众科学中，凝胶 有时被表征为果冻状物质。可通过测定所述凝胶的损耗模量(loss modulus)和储能模量 (storage modulus)来测定凝胶的粘弹性质。 0079 可由损耗因子tanG”/G表示所述损耗模量G”和所述储能模量G的比值。 所述损耗因子越高，产物的性质越接近牛顿流体(Newtonian flow)。可用术语*表示所 述产物的粘性。用于测定tan和*的合适的方法是本领域已知的。 0080 在本发明的方法中，所述组合物或根据本发明的组合物如凝胶强制性要求多糖作 为第一聚合物使用，。

29、且如果还使用第二聚合物，那么也强制性要求多糖作为第二聚合物使 用。 0081 本文所用的术语“多糖”包含由通过糖苷键连接在一起的重复单体单元组成的或 包含通过糖苷键连接在一起的重复单体单元的碳水化合物分子。一般来说，所述多糖包含 多于10个单糖单元。多糖的例子为例如淀粉、糖原、纤维素、甲壳素或透明质酸，或其混合 物的多糖。 0082 在一个优选的实施方案中，所述多糖为透明质酸。可以其盐的形式如钠盐提供所 述透明质酸。也可能提供所述酸及其盐如钠盐的混合物。 0083 因此，本文使用的术语“透明质酸(hyaluronic acid)”是术语如“透明质酸 (hyaluronan)”或“透明质酸盐(h。

30、yaluronate)”的同义词。在下文中，透明质酸可被简写 成术语“HA”。 0084 HA为二糖的非交联聚合物。它可具有多达25.000个二糖单元的长度。HA的分子 量可为5,000-20,000,000Da。 0085 HA在本领域中具有广泛公认的含义。具有不同分子量(Mw)和/或不同分子量分 布等级的HA是在市场上可买到的。它以非交联形式获得，在根据本发明的方法的步骤(i) 中作为起始原料。 0086 步骤(i) 0087 步骤(i)要求交联含所述第一聚合物和水的混合物。 0088 本文中使用的术语“交联”包含通过一个化学键(a chemical bond)或多个化学 键(chemic。

31、al bonds)交联所述多糖的至少两个不同聚合物链。因此，所述第一聚合物的分 子量增加，并因此粘性和/或弹性增加。 0089 在一个实施方案中，通过交联剂实施交联。 0090 用于交联多糖如透明质酸的合适的交联剂是本领中已知的。 0091 在一个实施方案中，可在根据本发明的方法中使用以环氧化物结构为基础的交联 剂。 0092 在一个实施方案中，二环氧甘油醚(diglycidyether)用于交联。 0093 在一个实施方案中，1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)用于交联。该化合物是可商 购的。 0094 在一个实施方案中，所述交联剂以5-15(交联剂的体积/透明质酸的重量)，如 6-14(。

32、v/w)，或7-12(v/w)的量使用。 0095 有利地，可控制根据步骤(i)的交联反应的温度。 0096 在一个实施方案中，在0-40的温度范围内产生根据步骤(i)的交联。 说 明 书CN 104395348 A 6/21页 9 0097 在另一个实施方案中，控制步骤(i)的温度使其在15-40的温度范围内进行。 0098 在一个实施方案中，所述步骤(i)的温度为25-35。 0099 在一个实施方案中，控制步骤(i)的温度使所述交联在25-30的温度范围内进 行。 0100 在另一个实施方案中，控制步骤(i)的温度使所述交联在30-35，或从30以上 至35的温度范围内进行。 0101 。

33、这样的温度或温度范围可确保非常均质的交联尽可能地避免不均质的颗粒。此 外，在一个实施方案中，温度的控制允许根据本发明的组合物的粘弹性质的特制的调节。 0102 在一个实施方案中，如果在较高温度下，如在从30以上至35的温度范围，实 施根据步骤(i)的所述交联，那么所得到组合物如凝胶相比较于在较低温度如在25-30 的温度下实施所述交联的组合物具有更强的粘弹性质。可通过根据本领域已知的方法测定 所述组合物的储能模量和损耗模量表征该差异。相应地，在一个实施方案中，步骤(i)中反 应温度的合适选择允许制备具有不同粘弹性质的组合物如凝胶。 0103 本文中使用的术语“混合物”包含混合但彼此不化学结合的。

34、两种或更多种物质的 组合。因此，术语“混合物”指所述第一聚合物(其为多糖)和水的物理组合。可以溶液， 或悬浮液，或胶体的形式提供所述混合物。 0104 所述第一聚合物，即所述第一多糖，即HA，通常具有1.0-4.0MDa范围，或从1.5MDa 至小于3.5MDa，或从2.0MDa至小于3.5MDa的分子量Mw。这些分子量Mw范围分别指交联 前的范围。 0105 在一个实施方案中，所述第一多糖具有从2.5MDa至小于3.0MDa的分子量Mw，同样 是在交联之前。 0106 可以自来水、蒸馏水或去离子水形式提供水。 0107 在一个实施方案中，步骤(i)中使用的混合物额外地包含缓冲溶液。 0108。

35、 在一个实施方案中，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液。 0109 在一个实施方案中，所述磷酸盐缓冲溶液由氯化钠，无水磷酸氢二钠，磷酸二氢钠 二水合物和水制成。 0110 在一个实施方案中，所述缓冲液为碱性缓冲液。 0111 在一个实施方案中，所述缓冲液的pH为6.8-7.6，或7.0-7.4，或7.1-7.3。 0112 在一个实施方案中，根据本发明的方法制备的最终组合物的pH被调至6.5-7.5范 围，如6.7-7.2，或6.8-7.1或6.8-6.9。这样的pH可支持所述组合物与皮肤组织的相容性。 在一个实施方案中，为调节所述pH，使用所述缓冲液。 0113 在一个实施方案中，可通过混合所述第。

36、一聚合物、水、所述交联剂，和任选地缓冲 溶液，并搅拌所述混合物以预定时间来实现步骤(i)，其中控制温度不超过预定设置点。 0114 步骤(ii) 0115 步骤(ii)要求终止步骤(i)中实施的交联。 0116 根据步骤(ii)的交联反应的终止是强制性必要的，因为否则可能得到具有太高 粘性或粘性和弹性的组合物或凝胶以致不能允许作为皮肤填充物的合理使用，只要所述凝 胶含可产生交联的化合物如步骤(i)中使用的交联剂，所述组合物或凝胶的各自的粘性或 粘弹性质将不是恒定的。 说 明 书CN 104395348 A 7/21页 10 0117 从根本上说，能与所述交联剂反应并因此使其失活的各化合物可用于。

37、终止所述交 联反应。 0118 在一个实施方案中，由于在步骤(i)中使用环氧化物型的交联剂，可通过添加使 环氧部分裂开以使不能发生与所述多糖中的合适基团进一步交联的化合物来实现交联的 终止。 0119 在一个实施方案中，可通过酸实现环氧化物的裂开和因此的步骤(i)中交联反应 的终止。有机酸和无机酸可用于交联的终止。 0120 在一个实施方案中，可使用无机酸如盐酸。 0121 用于终止交联反应的化合物可在缓冲溶液中应用，如在步骤(i)中使用的缓冲溶 液中。 0122 这样的溶液可被称为“淬灭溶液”。相应地，可通过淬灭根据步骤(i)得到的交联 的混合物实现根据步骤(ii)的终止。 0123 在一个。

38、实施方案中，在0-30的温度范围内实现根据步骤(ii)的交联的终止。 0124 在另一个实施方案中，控制步骤(ii)的温度使其不超过20，或15。 0125 在一个实施方案中，步骤(ii)中的温度为0-10，或3-7，如5。 0126 可通过在根据步骤(i)的混合物中添加用于终止的化合物，并例如搅拌预定时间 来实现根据(ii)的所述终止。 0127 所述交联反应的终止对于根据本发明的方法是重要的，因为因此得到的组合物或 凝胶具有优异的稳定性，即它的性质尤其是它的粘性或它的粘弹性质在应用后，如在皮肤 组织中用作皮肤填充物后不发生变化。 0128 在一个实施方案中，通过在步骤(ii)中挤压在步骤(。

39、i)中得到的交联产物，如通 过筛挤压所述产物进一步支持终止。不受理论的束缚，认为在挤压中所施加的高剪切力在 所述组合物或凝胶中提供所述交联剂和用于终止所述交联反应的化合物的完全混合。因 此，所述交联剂被完全或几乎完全地灭活，因此阻止进一步的交联并因此阻止进一步的不 希望的分子量和粘性和/或弹性的增加。 0129 术语“通过筛挤压(extruding through a sieve)”包含术语如“通过筛(passed through a sieve)”，或“通过筛加压(pressed through a sieve)”或“通过筛控制 (directed through a sieve)”或“过滤。

40、(ltered)”。 0130 因此，在一个实施方案中，步骤(ii)包含步骤(ii.1): 0131 (ii.1)挤压步骤(i)中得到的交联产物。 0132 在另一个实施方案中，步骤(ii)包含步骤(ii.1)和(ii.2): 0133 (ii.1)将步骤(i)中得到的产物经受酸处理； 0134 (ii.2)挤压步骤(ii.1)中得到的产物；或通过筛挤压步骤(ii.1)中得到的产 物。 0135 在一个实施方案中，步骤(ii)包含步骤(ii.1)和(ii.2): 0136 (ii.1)将步骤(i)中得到的产物经受酸处理； 0137 (ii.2)挤压步骤(ii.1)中得到的产物；或 0138 通。

41、过筛挤压步骤(ii.1)中得到的产物；或 0139 通过具有500-600nm范围的筛孔尺寸的筛挤压步骤(ii.1)中得到的产物。 说 明 书CN 104395348 A 10 8/21页 11 0140 在一个实施方案中，步骤(ii.2)中使用的筛的筛孔尺寸为约560m，如 558.8m(0.022“) 0141 步骤(iii) 0142 可选的步骤(iii)要求将步骤(ii)得到的产物与所述第二聚合物混合。 0143 在一个实施方案中，所述第二聚合物的存在不是必需的，且因此所述步骤(iii) 在步骤(i)至(iv)的反应顺序中被省去。 0144 在另一个实施方案中，所述第二聚合物的存在是必。

42、需的，因此步骤(iii)在步骤 (i)至(iv)的反应顺序中是必须实施的。 0145 本文中使用的术语“混合”包含步骤(ii)中得到的交联聚合物与步骤(iii)中 使用的第二聚合物的混合，其中得到的混合物包含所述交联的第一聚合物和所述第二聚合 物，所述第二聚合物也可为交联的，然而，所述第二聚合物也可以非交联的形式提供，所得 到的混合物相对于所述第一和所述第二聚合物具有不同的物理性质。 0146 所述第二聚合物也可为多糖。该聚合物可以与所述第一聚合物相同，或可以与其 不同。 0147 因此，在一个实施方案中，所述第二聚合物为与步骤(i)中使用的所述第一聚合 物相同的HA，或为与步骤(i)中使用的。

43、HA不同的HA。 0148 在一个实施方案中，所述第一聚合物具有与所述第二聚合物相同的分子量。在另 一个实施方案中，所述分子量彼此不同。所述第二聚合物的术语“分子量”指在混合和任选 地交联所述第二聚合物前的所述聚合物的相应分子量。 0149 在一个实施方案中，所述第二聚合物具有至少3.0MDa的分子量，或至少3.5MDa， 或至少4.0MDa的分子量。 0150 在一个实施方案中，所述第二聚合物具有至少3.0MDa的分子量，其中上限分别为 20MDa，或10MDa，或8MDa，或6MDa，或4MDa。 0151 在一个实施方案中，所述第二聚合物具有至少3.5MDa的分子量，其中上限分别为 20。

44、MDa，或10MDa，或8MDa，或6MDa，或4MDa。 0152 在一个实施方案中，所述第二聚合物具有至少4.5MDa的分子量，其中上限分别为 20MDa，或10MDa，或8MDa，或6MDa，或4MDa。 0153 在一个实施方案中，在缓冲液中如在可在步骤(i)或步骤(ii)使用的缓冲液中提 供所述第二聚合物。 0154 在一个实施方案中，在0-40，或0-30温度范围内实施根据步骤(iii)的混合。 0155 在另一个实施方案中，控制步骤(iii)的温度使其不超过20，或15。 0156 在一个实施方案中，步骤(iii)的温度为0-10，或3-7，如5。 0157 在一个实施方案中，通。

45、过搅拌所述交联产物和所述第二聚合物实施根据步骤 (iii)的混合，其中所述交联已根据步骤(ii)被终止。 0158 在一个实施方案中，所述第二组合物的重量基于所述第一组合物的重量为少于 5，或少于4，例如在从0.01-5的范围内，或在0.1-4的范围内，或在0.1-2.5的范 围内，或0.2-2.0，或0.5-1.5。 0159 在一个实施方案中，步骤(iii)允许对所述目标组合物或凝胶的粘性和弹性，或 粘性或弹性的性质的特制调节，所述性质是用作皮肤填充物必需的。这样的性质可通过选 说 明 书CN 104395348 A 11 9/21页 12 择如下参数来实现：步骤(i)中的合适的温度范围和。

46、/或步骤(iii)中的第一和第二聚合 物的重量比和/或步骤(i)中使用的交联剂的量和任选地使用的第二聚合物的量，假设该 第二聚合物在步骤(iii)中使用且以交联形式使用。 0160 此外，步骤(iii)中第二聚合物的使用可提升所述组合物通过筛的流动性，如果 实施筛分步骤的话。然后，通常，相比较于不含所述第二聚合物的组合物，需要使用较低的 挤压力以挤压所述组合物通过所述筛(sieve)或筛(sieves)。此外，以非交联的形式使用 第二聚合物可有利地提升根据本发明所述组合物通过注射器的针头的流动性，所述注射器 用于将上述组合物应用于美容应用中。因此，可使用较小的力挤压所述组合物通过所述针。 01。

47、61 步骤(iv) 0162 步骤(iv)要求对步骤(ii)或(iii)中得到的产物进行透析。 0163 在一个实施方案中，该步骤用于从步骤(iii)得到的凝胶中去除外来化合物或颗 粒。外来化合物或颗粒可对所述组合物如凝胶的物理性质产生不利的影响和/或可对所述 组合物或凝胶与皮肤组织的相容性产生不利的影响。因此，在一个实施方案中，步骤(iv) 用于降低或避免当根据本发明的组合物被注射入皮肤组织时可能产生的炎症反应。 0164 在另一个实施方案中，该步骤用于调节步骤(ii)或步骤(iii)中得到的凝胶的溶 胀。 0165 本文中使用的术语“溶胀”或“溶胀性”包含凝胶的吸水性。 0166 在一个实。

48、施方案中，当经历步骤(iv)时，步骤(iii)中得到的凝胶的溶胀，即在透 析过程中水的吸收量，基于上述凝胶的总重量为5-25，如6-23，或7-22，或9-21。 0167 在另一个实施方案中，所述溶胀或溶胀性为7-18，或8-15。 0168 在一个实施方案中，该溶胀或溶胀性产生使HA基质能承受压缩力(例如当被注射 至皮肤组织且所述皮肤组织遭受压缩力时)的溶胀压力。 0169 在一个实施方案中，步骤(iv)用于从步骤(ii)或步骤(iii)得到的凝胶中去除 外来化合物或颗粒并用于调节步骤(ii)或步骤(iii)中得到的凝胶的溶胀。 0170 因此，步骤(iv)用于，尤其是，提供比本领域已知的产物进一步改进的HA组合物。 0171 因此，除了步骤(ii)(所述交联的终止)，步骤(iv)(透析)为制备根据本发明的 组合物如凝胶所必需的步骤顺序中另一个重要的反应步骤。特别地，在根据本发明的反应 顺序中，步骤(ii)和步骤(iv)的组合允许提供具有所述性质的组合物如凝胶，这应根据所 提出的问题实现。。