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1、10申请公布号CN104053773A43申请公布日20140917CN104053773A21申请号201280066047722申请日20121212201127207220111213JPC12N15/09200601C12N1/15200601C12N1/19200601C12N1/21200601C12N5/1020060171申请人公立大学法人横滨市立大学地址日本神奈川72发明人足立典隆74专利代理机构中国国际贸易促进委员会专利商标事务所11038代理人罗菊华54发明名称基因打靶载体及其利用方法57摘要本发明提供使高效率的基因打靶成为可能的基因打靶载体。基因打靶载体，其具有与目标部。
2、位的5上游区域相同的DNA和与目标部位的3下游区域相同的DNA夹阳性选择标志物的结构，其中上述阳性选择标志物的5上游附加有剪接受体部位和使双顺反子性表达成为可能的DNA序列，再者，上述与目标部位的5上游区域相同的DNA的5上游也附加有剪接受体部位。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日2014070486PCT国际申请的申请数据PCT/JP2012/0821602012121287PCT国际申请的公布数据WO2013/089123JA2013062051INTCL权利要求书1页说明书11页序列表2页附图4页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书11页序列表。
3、2页附图4页10申请公布号CN104053773ACN104053773A1/1页21基因打靶载体，其具有与目标部位的5上游区域相同的DNA和与目标部位的3下游区域相同的DNA夹阳性选择标志物的结构，其中上述阳性选择标志物的5上游附加有剪接受体部位和使双顺反子性表达成为可能的DNA序列，再者，上述与目标部位的5上游区域相同的DNA的5上游也附加有剪接受体部位。2权利要求1所述的载体，其中阳性选择标志物附加有多聚A序列，但不附加有启动子。3权利要求1或2所述的载体，其中与目标部位的5上游区域相同的DNA的5上游上附加的剪接受体部位的3下游附加有多聚A序列。4权利要求3所述的载体，其中与目标部位的。
4、5上游区域相同的DNA的5上游上附加的剪接受体部位和其3下游上附加的多聚A序列之间导入有阴性选择标志物。5权利要求14之任一项所述的载体，其中再导入有线性化部位。6制作基因敲除细胞的方法，其包括使用权利要求15之任一项所述的基因打靶载体，向细胞导入基因变异。权利要求书CN104053773A1/11页3基因打靶载体及其利用方法【技术领域】0001本发明涉及基因打靶载体及其利用方法。【背景技术】0002利用细胞所具备的同源重组能力，仅破坏基因组上的特定的基因、甚至可与人为地导入的DNA片段置换非专利文献1、2。将其称为基因打靶。此方法不仅一直在各种基因功能解析中发挥绝大的威力，也被期待为理想的基。
5、因治疗法或品种改良法非专利文献3。但是，一般在高等动植物细胞中的基因打靶的效率极其低，期望改良法的开发。使用在标志物基因中不具有启动子的外显子截留型的打靶载体，则知随机插入体的出现频度降低，可预期基因打靶效率的升高非专利文献4、5。但是，由于由向非目标基因中的随机插入也可发生标志物基因的表达，需求旨在进一步效率化的改良法的开发。0003【现有技术文献】0004【非专利文献】0005非专利文献1CAPECCHI，MR1989ALTERINGTHEGENOMEBYHOMOLOGOUSRECOMBINATIONSCIENCE244128812920006非专利文献2VASQUEZKM，MARBURG。
6、ERK，INTODYZ，ETAL2001MANIPULATINGTHEMAMMALIANGENOMEBYHOMOLOGOUSRECOMBINATIONPROCNATLACADSCIUSA98840384100007非专利文献3YANEZRJ，PORTERAC1998THERAPEUTICGENETARGETINGGENETHER51491590008非专利文献4BUNZF，DUTRIAUXA，LENGAUERC，ETAL1998REQUIREMENTFORP53及P21TOSUSTAING2ARRESTAFTERDNADAMAGESCIENCE282149715010009非专利文献5ADAC。
7、HIN，SOS，IIIZUMIS，ETAL2006THEHUMANPREBCELLLINENALM6ISHIGHLYPROCIENTINGENETARGETINGBYHOMOLOGOUSRECOMBINATIONDNACELLBIOL251924【发明内容】0010【发明要解决的技术课题】0011本发明旨在提供使高效率的基因打靶成为可能的基因打靶载体。0012另外，本发明旨在提供利用使高效率的基因打靶成为可能的基因打靶载体，制作基因敲除细胞的方法。0013【解决课题的技术方案】0014基因打靶的效率极其低的问题的最大的原因在于高频度地发生了向细胞导入的打靶载体插入基因组上的随机的位置的反应随机。
8、插入。但是，因为可期待使用无启动子型的打靶载体来升高打靶效率，只要可简便迅速地制作这样的载体、特别是外显子截留型的打靶载体，则应可预期一定的技术革新。说明书CN104053773A2/11页40015本申请发明人开发了，在基因打靶载体例如，外显子截留型的打靶载体中，通过将IRES序列或2A序列等的使双顺反子性表达成为可能的DNA序列在选择标志物的5上游上附加来升高基因打靶效率的技术特愿2011118564、2011年5月27日申请。0016但是，在特愿2011118564的基因打靶载体中，由于不仅在正确打靶的克隆中，在发生向非目标基因中的随机插入的克隆中也发生筛选中使用的标志物基因阳性选择标志。
9、物基因的表达，阴性选择的效果说不上充分图4A，B。0017本申请发明人通过向在特愿2011118564的基因打靶载体中的目标部位的5相同区域的上游附加具有剪接受体序列的自杀基因等的阴性选择标志物，通过使在引起随机插入的克隆的阳性选择标志物基因的表达不发生而成功地再升高基因打靶效率，从而完成本发明图5。再有，在本发明中认为，即使不向基因打靶载体附加成为阴性选择标志物的基因，通过向目标部位的5相同区域的上游附加剪接受体序列，得到同样的效果即，不发生在引起随机插入的克隆的筛选中使用的标志物基因的表达。将本发明的方法命名为外显子截留阳性/阴性选择法EXTRAPNS法。0018本发明的要点如下。0019。
10、1基因打靶载体，其具有与目标部位的5上游区域相同的DNA和与目标部位的3下游区域相同的DNA夹阳性选择标志物的结构，其中上述阳性选择标志物的5上游附加有剪接受体部位和使双顺反子性表达成为可能的DNA序列，再者，上述与目标部位的5上游区域相同的DNA的5上游也附加有剪接受体部位。002021所述的载体，其中阳性选择标志物附加有多聚A序列，但不附加有启动子。002131或2所述的载体，其中与目标部位的5上游区域相同的DNA的5上游上附加的剪接受体部位的3下游附加有多聚A序列。002243所述的载体，其中与目标部位的5上游区域相同的DNA的5上游上附加的剪接受体部位和其3下游上附加的多聚A序列之间导。
11、入有阴性选择标志物。0023514之任一项所述的载体，其中再导入有线性化部位。00246制作基因敲除细胞的方法，其包括使用15之任一项所述的基因打靶载体，向细胞导入基因变异。0025【发明效果】0026由本发明，可相比以往更高效率进行基因打靶。本发明的方法，特别是在使用外显子截留型打靶载体的基因打靶中有效。本发明在基础生物学领域、医疗领域、农畜产领域中的基因敲除/敲入的广泛使用化效率化中有效。0027本说明书包含作为本申请的优先权的基础的日本国专利申请、特愿2011272072的说明书及/或附图中记载的内容。【附图说明】0028【图1】打靶载体的结构。A一般取代型打靶载体的结构。将打靶载体导入。
12、细胞内，在选择药剂存在下实施集落形成，则得到目标部位与药剂抗性基因重组的同源重组体，和在染色体上的随机的位置上插入打靶载体的非同源重组体，后者占压倒性的多数。即，由于同源重组体及非同源重组体均具有药剂抗性基因，仅此药剂筛选难以取得同源重组体。但是，如果在任何的臂之外侧附加DTA等的自杀基因，则非同源重组体由整合到染色体上说明书CN104053773A3/11页5的自杀基因的表达杀灭。图中的椭圆表示细胞，其中的棒状四边形表示染色体。染色体中的深灰色的区域表示目标部位、染色体及打靶载体中的浅灰色的区域表示相同区域。另外，被打靶载体的臂所夹的区域表示药剂抗性基因，黑色四边形的区域表示DTA。B无启动。
13、子型打靶载体的结构之一例。与取代型打靶载体不同，作为阳性选择标志物使用的基因中不具有独自的启动子。因此，理论上、仅在发生由同源重组的打靶时，使用染色体上的目标基因的启动子，从而开启标志物基因的表达。0029【图2】利用多位点入口技术的打靶载体制作的概略。将在两端具有ATTB序列的5臂和3臂PCR扩增之后，由BP重组反应制作5进入克隆ENTRYCLONE和3进入克隆A。使用得到的2个的进入克隆，和向PENTRIRESHYG、PDESTR4R3附加阴性选择用的盒SAIRESDTAPOLYA的质粒，由LR重组制作打靶载体B。HYG表示潮霉素抗性基因、DTA表示白喉毒素A片段基因、KMR表示卡那霉素抗。
14、性基因、AMPR表示氨苄西林抗性基因。0030【图3】用于臂扩增的PCR的概略和引物序列。以被ATTB序列所夹的方式将各臂用PCR扩增。引物序列中的加下划线部自示各ATT序列，N自示模板特异性序列、框围住的部分自示ISCEI的识别序列。模板特异性序列优选25NT左右的长度。0031【图4】由特愿2011118564的外显子截留型打靶载体的基因打靶。A一般取代型的外显子截留型打靶载体的结构。在5臂和3臂之间具有阳性选择标志物。阳性选择标志物不具有独自的启动子，代之以在5上游具有剪接受体部位、及，使双顺反子性表达成为可能的DNA序列。在3下游附加有多聚A附加信号。B由特愿2011118564的外显。
15、子截留型打靶载体的基因打靶的问题。不仅是通过由同源重组的打靶向目标基因中插入的克隆图上、在发生向非目标基因中的随机插入的克隆图下中也可发生阳性选择标志物基因的表达。特别是，向表达水平高的基因中插入的克隆，相比向目标基因中插入的克隆，可获得更强的药剂抗性。因此，仅由外显子截留，阴性选择的效果说不上充分。0032【图5】由新开发的、使用具有阴性选择用的盒的外显子截留型打靶载体的EXTRAPNS法的基因打靶以使用图6之上段所示的载体时为例。由于5相同区域的上游附加有具有剪接受体序列的自杀基因，在引起随机插入的克隆中发生阳性选择标志物基因的表达的可能性大幅地减少。在发生由同源重组的打靶时，不发生阴性选。
16、择用的盒的插入。因此，预期基因打靶效率的升高。再有，即使不附加成为阴性选择标志物的基因，只要向5臂的上游附加剪接受体序列图6之下段所示的载体，就可期待同样的效果。0033【图6】具有可在由EXTRAPNS法的基因打靶中使用的阴性选择用的盒的外显子截留型打靶载体的结构的例。代替上段所示的自杀基因，附加荧光蛋白质基因在这里是GFP基因也可中段。另外，仅简单在5臂的上游附加剪接受体序列也可下段。0034【实施方式】0035以下，更详细地说明本发明的实施方式。0036基因打靶是利用同源重组结构，向染色体上的任意的位置导入变异的技术。但是，高等生物中的同源重组频度低，一般而言，相比导入细胞内的打靶载体插。
17、入目标部位的频度，向不同的部位随机地插入的频度高100倍以上。从而，为了可有效筛选、取得同源重组体，有对打靶载体实施处理的必要。最常使用的取代型打靶载体具有与目标部位要缺失的区域的5上游区域及3下游区域相同的DNA片段以下，有时各称为“5臂”及“3说明书CN104053773A4/11页6臂”夹阳性选择标志物在图1中是药剂抗性基因的结构图1A。作为阳性选择标志物，可例示HYG潮霉素抗性基因、PURO嘌呤霉素抗性基因、GEO半乳糖苷酶基因和新霉素抗性基因的融合基因等的药剂抗性基因、GFP基因等的荧光蛋白质基因、萤光素酶基因等。由于发生同源重组，则目标部位与阳性选择标志物置换，可以其作为指标筛选重。
18、组体。但是，由非同源重组随机地插入也发生标志物基因的表达。因此，作为用于除去非同源重组体的处理，一般向打靶载体中的臂之外侧附加阴性选择用的基因。作为阴性选择用的基因，可例示HSVTK、DTA等的自杀基因等。作为别的方法，有使用不具有启动子的药剂抗性基因阳性选择标志物的无启动子法也包括“外显子截留法”图1B。在此方法中，发生同源重组，则开启阳性选择标志物基因的表达。但是，通过由非同源重组的随机插入，也有开启阳性选择标志物基因的表达的可能性。本发明中设计了用于减少由后者的反应的重组体的方法EXTRAPNS法。0037在本说明书中，以利用多位点入口技术MULTISITEGATEWAYTECHNOLO。
19、GYIIIZUMI，S，NOMURA，Y，SO，S，ETAL2006SIMPLEONEWEEKMETHODTOCONSTRUCTGENETARGETINGVECTORSAPPLICATIONTOPRODUCTIONOFHUMANKNOCKOUTCELLLINESBIOTECHNIQUES41311316的取代型打靶载体的制作法为例进行说明图2。0038具体而言，首先通过将在两端具有ATTB4序列和ATTB1序列的5臂对应于与本发明中的“目标部位的5上游区域相同的DNA片段”和两端具有PDONRP4P1R及ATTB2序列和ATTB3序列的3臂对应于与本发明中的“目标部位的3下游区域相同的DNA片。
20、段”在PDONRP2RP3间进行BP重组，分别制作5进入克隆及3进入克隆。5臂和3臂由基因组PCR扩增、取得。00395臂扩增用的反向引物可设计在目标基因的外显子上。由此，在目标基因上，在5臂中可含使从上游的外显子向插入阳性选择标志物基因的外显子的天然的剪接成为可能的SA部位剪接受体位点。SA部位不限于目标基因的剪接受体序列SA序列，也可使用其他SA部位。0040也可向3臂扩增用的反向引物或者5臂扩增用的正向引物附加用于载体直链化的限制性内切酶位点例如，ISCEI图3。由此，可省略用于确定直链化中使用的限制性内切酶的定位实验。0041接下来，在此两种进入克隆，与向在ATTL1序列和ATTL2序。
21、列之间导入有潮霉素抗性基因的PENTRIRESHYG、PDESTR4R3INVITROGEN附加阴性选择用的盒在这里是SAIRESDTA多聚A的质粒的四者间进行LR重组。用仅此2步骤完成外显子截留型的取代型打靶载体图2。0042在潮霉素抗性基因也可为其他选择用标志物的5上游附加使双顺反子性表达成为可能的DNA序列例如，IRES序列内部核糖体进入位点；MRNA内部的核糖体进入位点；脑心肌炎病毒EMCV来源的等、2A肽序列2A“自身切割”肽；THOSEAASIGNA病毒TAV来源的等、IRES2等。由于在选择用标志物的5上游存在使双顺反子性表达成为可能的DNA序列，所以发生基因打靶，则依赖于目标基。
22、因的启动子而发生选择用标志物的基因表达。0043潮霉素抗性基因优选被LOX71和LOXP所夹。由此，基因打靶之后，由CRE的瞬时表达，可从基因组中除去选择用标志物。但是，用于标志物除去的方法不限于此。即，也可说明书CN104053773A5/11页7利用其他LOX序列或FRT序列等的位点特异性重组酶的目标序列。0044另外，也可向进入克隆PENTRIRESHYG导入剪接受体部位。通过导入剪接受体部位，可在内含子中设定5臂扩增用的反向引物外显子中无。0045在5臂的上游上附加SAIRESDTA多聚A的盒，则由于相比阳性选择标志物的SA，上游会更存在别的即，DTA的SA，所以发生随机插入的克隆获得。
23、药剂抗性的概率大幅地减少图5。也可代替DTA基因而使用其他自杀基因例如，HSVTK、荧光蛋白质标志物等的其他基因例如，GFP基因、DSRED基因。或者，也可什么基因或IRES都不插入而仅附加SAPOLYA的盒图6。0046在向阴性选择用的盒放入如DTA基因一样的自杀基因或如GFP基因一样的荧光蛋白质基因等的阴性选择标志物时，可附加IRES、2A肽序列等的使双顺反子性表达成为可能的DNA序列，但在不向阴性选择用的盒放入基因或CDNA时，也可不附加使双顺反子性表达成为可能的DNA序列。0047以上、打靶载体的制作具体而言是将5臂和选择用标志物和3臂连结的步骤以利用INVITROGEN公司的多位点入。
24、口系统时为例进行说明，但连结方法不限于此方法。即，由其他分子生物学方法的制作或利用例如利用限制性内切酶或连接酶的一般方法或INFUSIONPCR克隆等也是可能的。作为不利用进入克隆即GATEWAY的系统而成为用于用通常的方法制作打靶载体的基础的载体，优选使用含选择用标志物，用于整合与目标部位的5上游区域相同的DNA片段和与目标部位的3下游区域相同的DNA片段的部位、及，整合线性化部位的载体。0048通过使用本发明的基因打靶载体，向细胞导入基因变异，可制作基因敲除细胞。基因敲除细胞可用公知的方法例如，ADACHI，N，SO，S，IIIZUMI，S，ETAL2006THEHUMANPREBCELL。
25、LINENALM6ISHIGHLYPROFICIENTINGENETARGETINGBYHOMOLOGOUSRECOMBINATIONDNACELLBIOL251924；ADACHI，N，NISHIJIMA，H，SHIBAHARA，K2008GENETARGETINGUSINGTHEHUMANNALM6PREBCELLLINEBIOSCIENCETRENDS2169180；TOYODA，E，KAGAYA，S，COWELL，IG，ETAL2008NK314，ATOPOISOMERASEIIINHIBITORTHATSPECICALLYTARGETSTHEISOFORMJBIOLCHEM28323。
26、71123720制作。简单地说明，则用限制性内切酶将打靶载体直链化之后，由电穿孔法等的基因导入法导入细胞，培养细胞，形成集落。接下来，利用适宜标志物，选择导入了基因变异的细胞。为了得到同源地导入基因变异的细胞同源破坏株，代替选择用标志物而进行第2基因打靶即可。另外，通过将表达位点特异性重组酶的载体例如，作为表达CRE重组酶的载体的质粒PBS185导入细胞，可除去选择用标志物。在除去选择用标志物的细胞中可导入别的变异。作为适宜于基因打靶的细胞，可例示人NALM6细胞、鸡DT40细胞、小鼠ES细胞等，但不限于这些。索性由本发明，用一般人细胞株基因打靶也变得容易。以下详述使用人纤维肉瘤来源癌细胞株H。
27、T1080可由人类科学振兴财团研究资源银行得到；HTTP/WWWJHSFORJP/CGIBIN/HSRRB/C_VIEWDETAILCGIJCRBIFO50354的实验的说明。本发明不限于这些实施例。0049【实施例】0050【实施例1】0051【材料及方法】0052【打靶载体的构建】说明书CN104053773A6/11页80053【准备的材料】00541EXTAQTM聚合酶宝生物00552PCR引物以HPRT基因的扩增为例。00565臂扩增用00571HPRT5FW，5GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGCACATCACAGGTACCATATCAGTG3SEQIDNO1；0。
28、0582HPRT5RV设定在外显子上，5GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGCACATCTCGAGCAAGACGTTCAGT3SEQIDNO2；00593臂用00603HPRT3FW，5GGGGACAGCTTTCTTGTACAAAGTGGCCTGCAGGATCACATTGTAGCCCTCTGTGTGC3SEQIDNO3；00614HPRT3RV附加成为线性化部位的ISCEI位点，5GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGCTATATTACCCTGTTATCCCTAGCGTAACTCAGGGTAGAAATGCTACTTCAGGC3SEQIDNO400623MULTIS。
29、ITEGATEWAY注册商标三片段载体构建试剂盒INVITROGEN00634整合药剂抗性基因的进入克隆PENTRIRESHYG0064PENTRIRESHYG是将PENTRLOXP质粒IIIZUMI，S，NOMURA，Y，SO，S，ETAL2006SIMPLEONEWEEKMETHODTOCONSTRUCTGENETARGETINGVECTORSAPPLICATIONTOPRODUCTIONOFHUMANKNOCKOUTCELLLINESBIOTECHNIQUES41311316用NOTI消化之后，依次附加LOX71，IRES，HYG，PA，LOXP而制作。LOX71和LOXP使用合成接头D。
30、NA附加。IRES和PA来源于PIRES载体宝生物；HTTP/CATALOGTAKARABIOCOJP/PRODUCT/BASIC_INFOASPUNITIDU100004407。HYG来源于PENTRLOXHYGIIIZUMI，S，NOMURA，Y，SO，S，ETAL2006SIMPLEONEWEEKMETHODTOCONSTRUCTGENETARGETINGVECTORSAPPLICATIONTOPRODUCTIONOFHUMANKNOCKOUTCELLLINESBIOTECHNIQUES41311316。00655目标载体PDESTR4R3INVITROGEN00666目标载体PDEST。
31、R4R3SAIRESDTAPA0067PDESTR4R3SAIRESDTAPA根据以下的顺序制作。00681使用引物DTASALFW5GTCGACATGGATCCTGATGATGTTGTTGAT3SEQIDNO7和DTANOTRVGCGGCCGCTTAGAGCTTTAAATCTCTGTAGGTASEQIDNO8进行PCR，将得到的DTA基因片段亚克隆进PIRES载体CLONTECH，CATNO631605的NOTI位点。使用KODPLUSDNA聚合酶TOYOBO，在下述的条件下进行PCR。006900702将PSAGEO质粒FRIEDRICH，GSORIANOPGENESDEV5,151315。
32、23,1991用BAMHI消化，使用KLENOW片段将末端平滑化之后，将含SA部位来源于腺病毒2型主要说明书CN104053773A7/11页9晚期转录物剪接受体的约200BP的片段附加到在上述1制作的载体的IRES序列的上游XHOI位点；由KLENOW片段平滑末端化。00713将在上述2制作的质粒用BGLII和PVUI消化，平滑末端化之后，将含SAIRESDTAPA的DNA片段附加到PDESTR4R3质粒INVITROGEN的AFLIII位点由KLENOW片段平滑末端化。00727含有抗生物质的LB琼脂培养基含50G/ML卡那霉素或50G/ML氨苄西林的LB琼脂培养基0073【流程】0074。
33、1以人基因组DNA作为模板，在下述的条件下进行PCR，取得被ATT序列所夹的HPRT基因组片段。在5臂的扩增使用引物1和2，在3臂的扩增使用引物3和4。0075【表1】007600772将PCR产物用市售的试剂盒纯化，定量。00783由BP重组反应制作5进入克隆及3进入克隆图2A。将下述的样品在05ML管内混合。0079PDONRP4P1R或PDONRP2RP350FMOL0080用PCR扩增的5臂或3臂50FMOL0081全量8L用TE溶液调整00824向上述反应液4L加1L的BP克隆酶II酶混合物，充分混合。00835于25温育45小时。00846加1L的2G/L蛋白酶K，充分混合。008。
34、57于37温育10分钟。00868将5L的反应液与50L的大肠杆菌感受态细胞混和，进行转化。恢复培养后，将重组体接种于含50G/ML卡那霉素的LB琼脂培养基中。00879单离510个卡那霉素抗性集落，用碱SDS法提取质粒DNA。由琼脂糖凝胶电泳，选23个被预计为目的质粒的克隆。将这些候选质粒用适当的限制性内切酶消化之后，进行琼脂糖凝胶电泳，确认是目的质粒。008810将得到的5、3各进入克隆用市售的试剂盒纯化，定量。008911由LR重组反应制作打靶载体PHPRTIRESHYG图2B。将各样品如下在05ML管内混合。0090PDESTR4R3或PDESTR4R3SAIRESDTAPA20FMO。
35、L00915进入克隆10FMOL00923进入克隆10FMOL说明书CN104053773A8/11页100093PENTRIRESHYG10FMOL0094全量8L用TE溶液调整009512向上述反应液4L加1L的LR克隆酶正酶混合物，充分混合。009613于25温育16小时。009714加1L的2G/L蛋白酶K，充分混合。009815于37温育10分钟。009916将5L的反应液与50L的大肠杆菌感受态细胞混和，进行转化。恢复培养后，将重组体接种于含50G/ML氨苄西林的LB琼脂培养基中。010017单离510个氨苄西林抗性集落，用碱SDS法提取质粒DNA。由琼脂糖凝胶电泳，选23个被预计。
36、为目的质粒的克隆。将这些候选质粒用适当的限制性内切酶消化之后，进行琼脂糖凝胶电泳，确认是目的质粒即打靶载体。010118将打靶载体用试剂盒纯化，定量。0102【打靶载体的直链化】0103【准备的材料】01041限制性内切酶ISCEI、10XISCEI反应缓冲液、10MG/MLBSANEWENGLANDBIOLABS010523M醋酸钠将醋酸钠4081G溶解于纯水80ML之后，用醋酸将PH调至52，使全量为100ML01063TE溶液10MMTRIS盐酸缓冲液PH80、01MMEDTAPH804保存0107【流程】01081将打靶载体用限制性内切酶ISCEI消化。将各试剂如下混合，于37温育4小。
37、时以上。0109打靶载体50G011010XISCEI缓冲液40L0111100XBSA10MG/ML4L0112ISCEI15单位0113全量400L用灭菌水调整01142加40L的3M醋酸钠和09ML的乙醇，充分混合。01153以15,000RPM离心5分钟。01164用05ML的70乙醇清洗3次。01175第3次离心后，在洁净台内使用经灭菌的芯片除去上清，风干。01186加TE溶液，溶解DNA至DNA浓度成24G/L。01197于65温育15分钟。0120【由电穿孔法的基因导入及集落形成】0121【准备的材料】01221增殖培养基向ES培养基日水制药中加10小牛血清HYCLONE而制成。。
38、于37水浴中保温。01232直链化的打靶载体01243细胞系统NUCLEOFECTOR注册商标试剂盒TLONZA说明书CN104053773A109/11页1101254选择药剂100MG/ML潮霉素B将1G的潮霉素B溶解于纯水10ML，过滤灭菌而制成4保存0126【流程】01271在50ML离心管中回收在对数增殖期的人HT1080细胞2106个以上。01282以1,100RPM离心5分钟，小心地除去上清。01293向细胞块加100L溶液T，对细胞数进行计数。01304将2106个的细胞和直链化的打靶载体2G混合，用溶液T使成为100L之后，移到专用的比色杯中。01315将比色杯设置到电穿孔装。
39、置NUCLEOFECTORII，LONZA上。01326运行程序L005。01337将全量立即移到装有4ML增殖培养基的60MM皿中。01348将各1ML上述细胞液移到装有9ML增殖培养基的90MM皿4个中。01359于37培养48小时。013610胰蛋白酶处理之后，以1,100RPM离心5分钟，回收细胞。013711悬浮于适量的增殖培养基中，对细胞数进行计数。013812接种于90MM皿增殖培养基9ML，至24105细胞/皿。013913于37培养24小时之后，加2540L的选择药剂100MG/ML潮霉素。014014于37培养2周，实施集落形成。0141【集落的单离和靶克隆的筛选】0142。
40、【准备的材料】01431选择培养基含有潮霉素B的培养基向增殖培养基加潮霉素B至成02504MG/ML0144201胰蛋白酶液01胰蛋白酶/002EDTA/PBS01453溶解缓冲液20MMTRIS盐酸缓冲液PH80、250MM氯化钠、1SDS0146410MG/ML蛋白酶K将100MG的蛋白酶K溶解于纯水10ML，过滤灭菌而成20保存01475饱和NACL溶液01486EXTAQTM聚合酶01497PCR引物基因打靶确认用；IIIZUMIETALNUCLEICACIDSRES2008NOV；3619633363420150HPRTF,5TGAGGGCAAAGGATGTGTTACGTG3SEQI。
41、DNO50151HPRTR,5TTGATGTAATCCAGCAGGTCAGCA3SEQIDNO60152【流程】01531向24孔板中各分注15ML选择培养基，075ML增殖培养基。01542用01胰蛋白酶液处理之后，一边轻轻移液器吸吐，一边移到装有15ML选择培养基的孔基因组提取用中。01553从移入细胞的24孔板取出025ML细胞液，移到装入075ML增殖培养基的孔继代用中。01564于37培养23天。说明书CN104053773A1110/11页1201575除去基因组提取用24孔板的各培养液之后，加250L的溶解缓冲液和1L的10MG/ML蛋白酶K，一边充分移液器吸吐一边移到15ML管。
42、中。01586于37温育一晚或者于55温育1小时。01597加80L的饱和NACL溶液，充分混合。01608再加250L的2丙醇，充分混合。01619以15,000RPM、于4进行15分钟离心。016210除去沉淀，用05ML的70乙醇清洗。016311将沉淀溶解于30100L的TE溶液。016412以制备的基因组DNA作为模板，使用引物HPRTF和HPRTR，在下述的反应条件下进行PCR，筛选靶克隆。0165【表2】01660167作为药剂抗性基因，代替潮霉素抗性基因而使用嘌呤霉素抗性基因或EGFP基因和嘌呤霉素抗性基因的融合基因，重复上述的操作，制作打靶载体。0168另外，作为使双顺反子性。
43、表达成为可能的DNA序列，代替IRES序列而使用IRES2序列或2A肽序列，重复上述的操作，制作打靶载体。0169对于用PCR筛选被判断为阳性的克隆，由DNA印迹解析确认发生正确的同源重组反应。0170【结果】0171下表总结了使用人HT1080细胞进行的基因打靶的结果。在“有阴性负选择DTA”中使用在5臂的上游上附加SAIRESDTAPA盒的打靶载体。0172【表3】01730174由以上的结果得知，使用外显子截留型的打靶载体，向其中导入阴性选择用的盒，则伴随随机插入频度显著的降低而以高效率进行基因打靶。说明书CN104053773A1211/11页130175将本说明书中引用的全部的刊物、。
44、专利及专利申请直接作为参考并入本说明书中。0176【工业实用性】0177本发明在基础生物学领域、医疗领域、农畜产领域中的基因敲除或基因捕获的广泛使用化效率化中有效。0178【序列表说明】01790180SEQIDNO1示以人HPRT基因作为目标的5臂扩增用的正向引物的DNA序列。01815GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGCACATCACAGGTACCATATCAGTG30182【加下划线部是ATTB4序列的】01830184SEQIDNO2示以人HPRT基因作为目标的5臂扩增用的反向引物的DNA序列。01855GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGCACATC。
45、TCGAGCAAGACGTTCAGT30186【加下划线部是ATTB1序列的】01870188SEQIDNO3示以人HPRT基因作为目标的3臂扩增用的正向引物的DNA序列。01895GGGGACAGCTTTCTTGTACAAAGTGGCCTGCAGGATCACATTGTAGCCCTCTGTGTGC30190【加下划线部是ATTB2序列的】01910192SEQIDNO4示以人HPRT基因作为目标的3臂扩增用的反向引物的DNA序列。01935GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGCTATATTACCCTGTTATCCCTAGCGTAACTCAGGGTAGAAATGCTACTTCAG。
46、GC30194【加下划线部是ATTB3序列的】01950196SEQIDNO5示基因打靶确认用的PCR引物HPRTF的DNA序列。0197HPRTF,5TGAGGGCAAAGGATGTGTTACGTG301980199SEQIDNO6示基因打靶确认用的PCR引物HPRTR的DNA序列。0200HPRTR,5TTGATGTAATCCAGCAGGTCAGCA302010202SEQIDNO7示引物DTASALFW5GTCGACATGGATCCTGATGATGTTGTTGAT3的DNA序列。02030204SEQIDNO8示引物DTANOTRVGCGGCCGCTTAGAGCTTTAAATCTCTGTAGGTA的DNA序列。说明书CN104053773A131/2页1400010002序列表CN104053773A142/2页15序列表CN104053773A151/4页16图1说明书附图CN104053773A162/4页17图2图3说明书附图CN104053773A173/4页18图4图5说明书附图CN104053773A184/4页19图6说明书附图CN104053773A19。