使用临界的PHA非溶剂加速从生物质中 溶剂提取多羟基链烷酸酯的方法 本发明涉及从其它生物质组分中提取特定组分的方法。特别是，本发明涉及从例如植物或细菌的生物体系中通过溶剂提取多羟基链烷酸酯的方法；使用临界(marginal)的PHA非溶剂可加速该提取工艺。
一般，利用已知的合成方法可以从石油化学原料制备商品聚合物。但是，近期技术的进步已经给生产商品聚合物的原料带来新地希望。特别是利用活的生物体包括经遗传控制的细菌和庄稼植物来制备塑性树脂(“生物塑料”)，即设计用来制备例如多羟基链烷酸酯(PHA)的聚合物；很多自然中能产生PHA的细菌也是PHA未来的原料。(例如参见：Poirier，Y.，D.E.Dennis，K.Klomparens and C.Somerville，“polyhydroxybutyrate，a biodegradablethermoplastic，produced in transgenic plants”(用转基因植物制备生物可降解的热塑塑料-多羟基丁酸酯)，Science，Vol.256，pp.520-523(1992)；1995年2月23日公开的世界专利申请公开号WO No.95/05472；1993年2月4日公开的世界专利申请公开号WO No.93/02187；Novel Biodegradable MicrobialPolymers(新颖的生物可降解微生物聚合物)，E.A.Dawes等，NATO ASISeries，Series E：Applied Sciences-Vol.，186，Kluwer AcademicPublishers(1990))。在例如农业生产的大批量生产中，从生物质碎片中收获和纯化这样的生物塑料是决定这项技术是否实际可行的关键一步。
从例如农业作物的大量生物原料中分离例如PHA的聚合脂质(polymericlipids)并不是一件轻而易举的事情。广泛用于提取低分子量脂质的常规分离方法在树脂分离法的应用中并不实际。例如，简单的机械压榨不现实，因为不同于从含油种子中分离植物油，经机械压榨法不能把固体塑料从作物中挤压出来。
原则上，通过沉积法应该能够分离PHA。但是实际上，在液体临界非溶剂中的简单重力(1-G力)沉降很不现实，因为沉降率极低。另外，这么少的沉降容易被PHA细颗粒的布朗运动破坏，这种布朗运动是由包在PHA颗粒周围的悬浮液体分子的热波动引起的。而且，沉淀如此细的PHA颗粒需要延长沉淀时间，这样就产生细菌感染的问题，结果导致悬浮颗粒的生物降解。
已知的溶剂提取法对于大规模从生物质中分离PHA受到了限制。常用的从细菌中提取PHA的溶剂是氯仿。利用其它卤代烃溶剂也有所记载，例如二氯甲烷、二氯乙烷和氯丙烷(例如参见：U.S.4,562,245，Stageman，1985年12月31日出版；US4,324,907，Senior，Wright和Alderson，1982年4月13日出版；U.S.4,310,684，Vanlautem和Gilain，1982年1月12日出版；U.S.4,705,604，Vanlautem和Gilain，1987年11月10日出版；EP036699，Holmes和Wright，1981年9月3日公开；德国专利申请239609，Schmidt，Schmiechen，Rehm和Trennert，1986年1月10日公开)。在洗提溶剂过程中，浓缩的PHA溶液经常形成粘度很高的流体或有时甚至形成凝胶，这将极难加工。此外，这些溶剂如果不从PHA中完全除去，其对健康和环境都有潜在的危害。结果是人们不愿意大量使用这些形成粘度很高的流体或凝胶的溶剂，尤其在收获地带。
根据上述内容，人们需要一种简单而又经济的从大量生物原料中回收生物塑料的方法。该方法优选易适于在标准发酵基生产中生产细菌PHA。该方法最好易适合成为相关商品农业生产例如含油种子情况下的油和谷物的整体的一部分。
因此，本发明的一个目的是提供一种从生物质中回收生物塑料的方法。
对于本领域的技术人员来说，本发明的上述和其它目的将从阅读以下描述和所附的权利要求中得以清楚地理解。
本发明涉及一种从含有PHA的生物质中分离多羟基链烷酸酯的方法，该方法包括a)用PHA溶剂和临界的PHA非溶剂处理生物质；
b)除去任何不溶的生物质，剩下PHA和临界的PHA非溶剂的溶液；和
c)从溶液中除去PHA溶剂，得到沉淀的PHA在临界的PHA非溶剂中的悬浮液。任选地，该方法还包括除去临界的PHA非溶剂，剩下的是多羟基链烷酸酯。本发明还涉及由该方法得到的悬浮液和PHA。
该方法满足了从大量生物原料中回收生物塑料所要求的相对简单和经济的需要。
图1表示的是本发明一个实施方案的示意图，其中从外部加入临界的PHA非溶剂(之后除去)以加快提取PHA。
下面是本发明所用的术语的定义。
“烷烃”是指通式为CnH2n+2的饱和烃，优选n为约3-约20，更优选n为约6-约16。
“链烯基”是指一条含碳链，优选从约C2到约C24，更优选从约C2到约C19；可以是直链、支链或环状的，优选是直链或支链，更优选是直链；是取代(一取代或多取代)的或未取代的；是单不饱和的(即在链上有一个双键或三键)；或多不饱和的(即在链上有两个或多个双键，在链上有两个或多个三键，或者在链上有一个或多个双键和一个或多个三键)，优选是单不饱和的。
“烷基”是指一条含碳链，优选从约C1到约C24，更优选从约C1到约C19；可以是直链、支链或环状的，优选是直链或支链，更优选是直链；是取代(一取代或多取代)的或未取代的；并且是饱和的。
“包括”是指可以加入不影响最终结果的其它步骤和其它成分。该术语包含了术语“由……组成”和“基本由……组成”。
“从生物质中提取多羟基链烷酸酯”是指从产生单一PHA的生物质中提取特定PHA，除此之外还指的是当生物质产生多种PHA时提取一种或多种PHA。
“多羟基链烷酸酯”和“PHA”是指包括下面重复单元的聚合物：
其中R优选为H、烷基或链烯基；m从约1到约4。术语多羟基链烷酸酯和PHA包括含有一个或多个不同重复单元的聚合物。
经本发明的方法提取的PHA优选的熔化温度(“Tm”)是约80℃或更高。PHA优选包括至少两个无规重复单体单元，其中第一个无规重复单体单元具有下列结构：
其中R1是H或C1到C2烷基；n是1或2；第二个无规重复单体单元具有下列结构：
其中R2是C3到C19的烷基或C3到C19的链烯基；其中至少50％的无规重复单体单元具有第一种无规重复单体单元的结构。更优选的经本发明方法可提取的高结晶度PHA的例子包括记载在以下专利文献中的那些物质：1995年6月6日Noda申请的美国申请序号08/465,046；1995年4月13日Noda申请的美国申请序号08/422,008；1995年6月5日Noda申请的美国申请序号08/422,009；1995年6月6日Noda申请的美国申请序号08/467,373；1994年1月28日Noda申请的美国申请序号08/188,271；1995年6月6日Noda申请的美国申请序号08/469,969；1995年6月7日Noda申请的美国申请序号08/472,353；1995年6月6日Noda申请的美国申请序号08/469,269；1994年3月8日出版的Shiotani和Kobayashi的美国专利5,292,860。
“溶剂”是指能够溶解另一种物质(溶质)以形成分子或离子大小水平的均匀分散的混合物(溶液)的物质。
“非溶剂”是指不能明显溶解另一种物质的物质。
“临界的非溶剂”是指本身是非溶剂，但当与一种溶剂混合时能溶解溶质的物质。
“沉淀剂”是指能够引发另一种物质沉淀和/或消弱溶剂的溶解能力的物质。尽管沉淀剂也被认为是一种非溶剂，但是非溶剂并不总是沉淀剂。例如，甲醇和己烷是PHA沉淀剂和PHA非溶剂；相反，油是PHA非溶剂，但是它不是很有效的PHA沉淀剂(尽管在极高的浓度下，油也将导致PHA从溶液中沉淀出)。
除非特别指出，本发明所有百分数以全部组合物的摩尔百分数计算(mol％)。
除非特别指出，本发明所有比例都以重量之比计算。
下面详细记载了本发明有关的产品和其制备方法。
生物质
通过本发明的方法提取PHA的原料包括单细胞生物体例如细菌或真菌和高级的生物体如植物(本发明中，总称作“生物质”)。尽管这些生物质可以是野生的生物体，但优选是那些经遗传控制的有利于培育者而专门设定作为制备特定PHA的品种。通过引入制备一种或多种PHA所必须的遗传信息而制得这种经遗传控制的生物体。一般，这些遗传信息来自自然产生PHA的细菌。
用于本发明的植物包括设定制备PHA的任何经遗传设计的植物。优选的植物包括农作物，例如谷物、含油种子和块茎植物；更优选的是：鳄梨、大麦、甜菜、蚕豆、荞麦、胡萝卜、椰子、干椰子仁、玉米、棉籽、瓜类(葫芦)、小扁豆、利马豆、小米、绿豆、燕麦、油棕(oil palm)、豌豆、花生、马铃薯、南瓜、菜籽(例如，canola)、大米、高梁、大豆、制糖甜菜、糖甘蔗、向日葵、甘薯(sweetpotato)、烟草、小麦和山药(yam)。用于本发明方法的改变遗传的带果实的植物包括但不限于：苹果、杏、香蕉、糙皮甜瓜(cantaloupe)、樱桃、葡萄、金柑、柠檬、莱母酸橙(lime)、橙、番木瓜、桃、梨、菠萝、红桔、番茄和西瓜。优选的植物是为制备PHA经遗传设计的，这些方法公开在Poirier，Y.，D.E.Dennis，K.Klomparens and C.Somerville，“Polyhydroxybutyrate，abiodegradable thermoplastic，produced in transgenic plant”(用转基因植物制备生物可降解的热塑塑料-多羟基丁酸酯)，Science，Vol.256，pp.520-523(1992)；1995年2月23日公开的世界专利申请公开号95/05472；1993年2月4日公开的世界专利申请公开号93/02187。特别优选的植物是经遗传设计以制备PHA的大豆、马铃薯、玉米和椰子植物；更优选的是大豆。
用于本发明的细菌包括设定以制备PHA的经遗传设计的细菌以及自然产生PHA的细菌。这些细菌的例子包括公开在以下文件中的那些：NovelBiodegradable Microbial Polymer(新颖的生物可降解微生物聚合物)，E.A.Dawes等，NATO ASI Series，Series E：Applied Sciences-Vol.186，KluwerAcademic Publishers(1990)；1994年3月8日出版的Shiotani和Kobayashi的美国专利5,292,860；1993年10月5日出版的Peoples和Sinskey美国专利5,250,430；1993年9月14日出版的Peoples和Sinskey的美国专利5,245,023；1993年7月20日出版的Peoples和Sinskey的美国专利5,229,279。
加入临界非溶剂有利于溶剂提取PHA
本发明涉及一种从包括PHA的生物质中分离多羟基链烷酸酯的方法，该方法包括a)用PHA溶剂和临界的PHA非溶剂处理生物质；
b)除去不溶的生物质，剩下PHA和临界的PHA非溶剂的溶液；和
c)从溶液中除去PHA溶剂，得到沉淀的PHA在临界的PHA非溶剂中的悬浮液。任选地，该方法还包括除去临界的PHA非溶剂，剩下的是多羟基链烷酸酯。步骤b)中生成的溶液由溶解或分散在PHA溶剂中的临界的PHA非溶剂组成。
本发明还涉及由该方法得到的悬浮液和PHA。
PHA溶剂优选为：丙酮、乙腈、苯、乙酸丁基酯、丙酸丁基酯、β-丁内酯、γ-丁内酯、液化的二氧化碳、氯仿、1，2-二氯乙烷、碳酸二乙基酯、二乙基甲酰胺、碳酸二甲基酯、琥珀酸二甲基酯、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、1，4-二噁烷、乙酸乙酯、乙二醇二乙酸酯、乙酸甲酯、甲基乙基酮、1，1，2，2-四氯乙烷、四氢呋喃、1，1，2-三氯乙烷、1，2，3-三氯丙烷、甲苯、二甲苯或它们的混合物。
更优选，PHA溶剂为：丙酮、乙腈、γ-丁内酯、1，4-二噁烷、乙酸甲酯、甲苯、甲基乙基酮、乙酸乙酯或它们的混合物。
在更有利于环境的方法中，优选的PHA溶剂是丙酮、乙酸丁酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯和它们的混合物。更优选丙酮、乙酸乙酯。更优选是丙酮。
优选PHA溶剂在升高温度下用于该方法中，因为发现在升高温度下PHA在PHA溶剂中的溶解速度基本上更快。可以在约20℃和PHA的熔化温度之间进行PHA的提取；更优选是在约20℃和约80℃之间；更优选是在约45℃和PHA溶剂的沸点之间；更优选是从约50℃到约60℃。
在用PHA溶剂提取的过程中优选搅拌含有PHA的固体物质，因为这促使了PHA的溶解速度。
从含有PHA的溶液中去除PHA溶剂最终生成作为晶态固体物的PHA沉淀。但是，在洗提溶剂过程中，浓缩的PHA溶液经常形成粘度很高的流体或有时甚至形成凝胶，这将极难加工。如果溶液含有相对非挥发的临界PHA非溶剂，去除PHA溶剂时PHA将沉淀，在临界PHA非溶剂中形成悬浮液。
该实施方案以图1中的示意图进行说明。甚至在起始生物质(如非油种子生物质或细菌)中不存在临界PHA非溶剂时，本发明能获得临界PHA非溶剂的好处。在从生物质中洗提PHA溶剂的过程中，临界PHA非溶剂起加工助剂的作用，从而阻碍形成粘度过高或凝胶。
在提取工艺过程中，当临界PHA非溶剂与PHA溶剂混合时，必须不能明显地影响PHA溶剂的溶解能力。临界PHA非溶剂本身不应明显溶解PHA，因为PHA的溶解会阻碍PHA的悬浮液作为不连续的颗粒。优选临界PHA非溶剂比PHA溶剂具有较低的挥发性(低沸点)。低沸点会较容易和干净地分离PHA溶剂。优选临界PHA非溶剂的沸点比PHA溶剂高至少5℃，更优选至少约10℃，更优选至少约20℃，最优选至少约40℃。
优选临界PHA非溶剂为C3-C20醇，C1-C20烷烃，脂肪，中性脂质，油，水或其混合物。
优选烷烃包括十烷，十二烷，十六烷和十八烷。
优选醇包括十六醇，十二醇，辛醇，油醇和硬脂醇。
优选的脂肪包括牛脂，蜡和牛油。
优选的中性脂质包括油酸、inoleic酸、linelenic酸、月桂酸、硬脂酸和棕榈酸的单、二和三甘油酯。
优选的油包括矿物油和植物油(如大豆，canola等)。
上述本发明的实施方案具有许多意想不到的优点，包括避免形成高粘度的PHA流体或凝胶，否则极难以加工。这可以通过在临界PHA非溶剂存在下对PHA进行提取而实现。开始临界PHA非溶剂是用作可溶混的共溶剂以促进PHA的提取。但是，去除相对挥发性的PHA溶剂时临界PHA非溶剂因其有限的溶解能力后来变成了为沉淀PHA有效的悬浮介质。与浓缩的溶液相比，一般，在流体非溶剂中的聚合物固体悬浮液具有很低的表现粘度，从而具备更高的可操作性。从浓缩的聚合物溶液洗提溶剂的过程中，消除了经常要遇到的严重的凝胶问题，这也是本发明另外的意外的和显著的特点。
本方法另一个意想不到的优点是能生成PHA的悬浮液，该悬浮液能用于如涂料，粘合剂，涂料、食品和粘合剂的助剂以及染料、颜料、生物活性物质以及香料的载体。
在本发明的一些实施方案中发现有另一意想不到的进步，能够不使用含卤元素的溶剂提取可结晶的高熔化温度(约80℃或更高)的PHA。用于本发明这些实旋例的对环境温和的PHA溶剂例如丙酮和乙酸乙酯价格不贵，安全又温和，且容易得到，甚至来自可回收的原料。同时还认为，与用于从细菌中提取PHA典型的含卤素的化合物相比，这样的PHA溶剂对环境远构不成危害，尤其不会破坏地球的臭氧层。
另外，发现作为具有很高熔化温度的结晶聚合物的合适的溶剂不是一件简单的事情。不同于大多数低分子量的化合物和不能结晶的非晶形聚合物，晶体聚合物的溶解度不能从通常使用的简单标准中进行预测，这些简单标准是例如化学结构的相似性或折射率的配合、介电常数或溶解参数。当这两种化合物是由相同的碳氢重复单元组成的时候，不能预测晶体聚合物的溶解度的一个好的例子是已知链状聚乙烯在己烷中的不溶性。同样地，尽管这些化合物的化学结构可以表明一定的分子亲和力，但是象全同立构的聚(3-羟基丁酸酯)和聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸酯)的结晶脂族聚酯都不明显溶于乙酸乙酯或丙酮中。因此，偶然发现含有少量中等大小分支的晶体PHA能这么容易地溶解于这些溶剂中确实很令人惊讶。
下面的实施例进一步描述和说明在本发明范围内的优选的实施方案。为了说明的目的，这里给出这些实施例，但并不是对本发明的限制，因为其中的很多变化可能不会脱离本发明的精神和范围。
实施例1
由Aeromanas cavie提取PHA
以下步骤是对US5292860(Shiotani和Kobayashi，1994年3月8日公开)中所述从Aeromonas cavie中分离PHA的方法的改进。将Aeromonas cavie的发酵批料离心，用水和甲醇洗涤，真空干燥得到120克干细胞。然后，将干细胞生物质在50℃放入一个装有800ml氯仿和200ml十二烷的混合物的密封容器中5小时。然后，用线网过滤器除去不溶固体生物质。在50℃减压下从溶液混合物中除去氯仿，经水冷冷凝器收集以备进一步使用。除去氯仿得到包括分散在剩余十二烷中的聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基己酸酯)的固体片的悬浮液。用细线网过滤从十二烷中分离固体片，用冷氯仿快速洗涤，干燥得到7g聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基己酸酯)。
实施例2
从Alcaligenes eutrophus中提取PHA
以下步骤是对US4562245(Stageman，1985年12月31日公开)中所述从Alcaligenes eutrophus中分离PHA的方法的改进。将喷雾干燥的含有聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸酯)的Alcaligenes eutrophus细胞在大气压下在甲醇中回流15分钟以除去可溶性的脂质。将细胞于30℃在强力通风厨中在托盘中干燥。然后，将10克干细胞在大气压下用250ml氯仿和50ml十六烷的混合物中回流30分钟以提取聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸酯)。所得浆料经过滤除去细胞残余物。在减压下从提取溶液中除去氯仿，得到包括分散在剩余十六烷中的聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸酯)的固体片的悬浮液。沥去十六烷，收集得到6.2g聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸酯)。
实施例3
从Pseudomonas cepacia中提取PHA
以下步骤是对国际专利申请92/18553(1992年10月29日公开)中所述从Pseudomonas cepacia中分离PHA的方法的改进。将含有主要由3-羟基辛酸酯的共聚物的Pseudomonas cepacia细胞离心，倾倒，再悬浮于水中4次，然后，冷冻干燥。将10克干细胞在大气压下用250ml丙酮和50ml 1-己醇的混合物回流20分钟以提取3-羟基辛酸酯共聚物。所得浆料过滤除去细胞残余物。在减压下从提取溶液中除去丙酮，得到包括分散在剩余的1-己醇中的3-羟基辛酸酯共聚物的柔软固体颗粒的悬浮液。沥去1-己醇，收集得到4.8g的共聚物。
实施例4
从土豆中提取PHA
在装有600ml丙酮和150ml植物油的密封容器中，放入60g含有聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基庚酸酯)的转基因的土豆样品(由例如国际专利申请公开95/05472(Someville等，1995年2月23日公开)或国际专利申请公开93/02187(Someville等，1993年2月4日公开)中所述方法生产)，其中聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基庚酸酯)含有7.5％的3-羟基庚酸酯的重复单元；在55℃下搅拌3小时。然后，用线网过滤器从土豆中沥出含有油和PHA的丙酮溶液。将含有植物油、聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基庚酸酯)和丙酮的该提取溶液放入一个蒸汽加热的锅中，蒸掉丙酮，丙酮经水冷冷凝器收集。去除丙酮后，在剩余的油中出现聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基庚酸酯)的固体片，这时用细网过滤器经沥去得到7g纯的植物油。在经冷凝器收集前，用冷的丙酮清洗聚合物片，去除残留夹带的油，然后干燥得到6g聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基庚酸酯)的晶态固体。用于清洗的丙酮与植物油混合以用于进一步提取聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基庚酸酯。
上述提到的所有出版的专利和专利申请的公开内容都在此引入作为参考。
应该知道，本发明所描述的实施例和实施方案仅为说明之目的，各种变化和改变对本领域的技术人员来说都将得到暗示，它们都包括在该申请的精神和范围以及所附的权利要求中。