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1、(10)申请公布号 CN 102898485 A (43)申请公布日 2013.01.30 C N 1 0 2 8 9 8 4 8 5 A *CN102898485A* (21)申请号 201210047769.X (22)申请日 2012.02.28 C07H 3/06(2006.01) C07H 1/08(2006.01) C07H 15/207(2006.01) (71)申请人南京农业大学 地址 210095 江苏省南京市卫岗1号 (72)发明人曾晓雄 张芸 贺晋艳 向小丽 (54) 发明名称 以鹰嘴豆为原料制备功能性-低聚半乳糖 及鹰嘴豆糖醇的方法 (57) 摘要 本发明涉及以鹰嘴豆为。
2、原料制备功能性 -低聚半乳糖及鹰嘴豆糖醇的方法。包括如下 步骤：选取鹰嘴豆种子，用粉碎机粉碎，过筛，按 一定料液比加入乙醇水溶液提取，将提取液离心， 收集上清液，重复上述步骤三次，得到提取液。利 用中压层析柱，用一系列线性浓度梯度的乙醇水 溶液进行洗脱。对洗脱液进行糖含量测定，根据测 定结果，收集含糖的组分进行HPLC分析，得到不 同纯度的鹰嘴豆-低聚半乳糖。鹰嘴豆-低 聚半乳糖经Biogel P-2凝胶过滤层析柱，得到鹰 嘴豆糖醇。体外厌氧粪样混合培养实验结果表明 鹰嘴豆-低聚半乳糖及鹰嘴豆糖醇具有很好的 肠道益生功能，因此具有广阔的应用前景。 (51)Int.Cl. 权利要求书1页 说明书。
3、4页 附图4页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 4 页 1/1页 2 1.一种以鹰嘴豆为原料制备功能性-低聚半乳糖及鹰嘴豆糖醇的方法，其特征在于 包括以下操作步骤： (1)以产于我国西部地区的鹰嘴豆作为原料，选取籽粒饱满、无虫害、无缺失的鹰嘴豆 种子，用粉碎机粉碎，过筛，得到鹰嘴豆粉用于磨粉提取。 (2)称取适量步骤(1)中豆粉于容器中，按一定料液加入乙醇水溶液，恒温条件下振荡 提取。将提取液离心，收集上清液，下层豆粉重复上述步骤两次，收集上清液，并将上清液合 并。 (3)冻干步骤(2)所得提取物加适量水复溶，经滤膜过滤，滤。
4、液过活性炭-硅藻土中压 层析柱。 (4)使用苯酚硫酸法对步骤(3)所得洗脱液进行糖含量测定，根据测定结果，收集含糖 的组分进行HPLC分析，收集合适的组分，得到-低聚半乳糖含量不同的鹰嘴豆-低聚 半乳糖样品。 (5)步骤(4)所得鹰嘴豆-低聚半乳糖过Biogel P-2凝胶过滤层析柱，收集只含有 鹰嘴豆糖醇的组分，真空浓缩，冷冻干燥，得到鹰嘴豆糖醇纯品。 (6)步骤(5)所得鹰嘴豆糖醇的结构鉴定方法为：分离纯化得到的鹰嘴豆糖醇样品进 行 1 H-NMR和ESI-TOF-MS分析。 (7)采用体外厌氧粪样混合培养法，对步骤(4)所制备得不同纯度的鹰嘴豆-低聚半 乳糖的肠道益生功能进行评价。 2.。
5、体外厌氧粪样混合培养实验结果表明，鹰嘴豆-低聚半乳糖对双歧杆菌、乳酸菌 都有较好的增殖作用，对拟杆菌、梭状菌的生长有一定的抑制作用；鹰嘴豆-低聚半乳糖 只是改变了肠道内菌体的组成，对总体菌群的数量基本没有影响；-低聚半乳糖含量高 于90的鹰嘴豆-低聚半乳糖样品对有益菌的增殖作用最强，同时对有害菌的抑制作 用也最强，表现出最高的PI值(2.00)，-低聚半乳糖含量为70-80、85-90的鹰嘴豆 -低聚半乳糖样品及鹰嘴豆粗提物的PI值依次为1.39、1.73和0.89，而对照组为负值。 实验结果表明鹰嘴豆-低聚半乳糖具有很好的肠道益生功能。 权 利 要 求 书CN 102898485 A 1/4。
6、页 3 以鹰嘴豆为原料制备功能性 - 低聚半乳糖及鹰嘴豆糖醇 的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种利用中压柱层析、Biogel P-2凝胶过滤层析柱，以鹰嘴豆为原料 制备功能性-低聚半乳糖及鹰嘴豆糖醇的方法。 背景技术 0002 -低聚半乳糖(-Galactooligosaccharides，-GOS)是一类含有-半乳糖 苷键的低分子量的可溶性低聚糖，广泛分布于豆科植物中。以往，人们一直认为-低聚半 乳糖是一种抗营养因子，是引起肠胃胀气的主要原因，因此在豆类食品的加工过程中强力 去除。随着上世纪80年代日本开始对功能性低聚糖的研究，人们对-低聚半乳糖也有了 重新的认识，发现它可以促进肠道。
7、内有益菌双歧杆菌的增殖，同时抑制腐败菌的生长。许多 学者对-低聚半乳糖重新进行了研究，发现它并不是造成肠胃胀气的原因，-低聚半乳 糖才开始被人们重新研究利用。 0003 目前国内外主要从豆类植物中提取-低聚半乳糖，报道的提取原料主要有大 豆、羽扇豆、豇豆、豌豆等，其中从大豆中提取-低聚半乳糖的研究较为广泛，目前已被 应用于饮料、酸奶、保健食品等领域。但是，大豆来源的-低聚半乳糖含有的蔗糖含量 较高，因此限制了其在肥胖人群中的应用。鹰嘴豆中含有丰富的碳水化合物，其中的功能 性低聚糖有棉子糖、鹰嘴豆糖醇、水苏糖和毛蕊花糖，据报道鹰嘴豆中总低聚糖的含量在 5.89-10.1，是-低聚半乳糖的重要来源。
8、之一。与大豆相比，鹰嘴豆中-低聚半乳 糖的含量较高，而蔗糖的含量较低，可以很好的解决大豆低聚糖中因蔗糖含量较高而限制 应用范围的问题。因而，鹰嘴豆是生产-低聚半乳糖较为理想的原料。鹰嘴豆中的低聚 糖有蔗糖、棉籽糖、鹰嘴豆糖醇、水苏糖，以及少量的毛蕊花糖等，其中鹰嘴豆糖醇是鹰嘴豆 中特征性的三糖。 0004 鹰嘴豆是目前世界上栽培面积较广的食用豆类品种之一，是世界第二大消费豆 类，产量居世界豆类第三。由于鹰嘴豆非常耐干旱和贫瘠，非常适于我国西部地区种植，在 新疆已有2500年的生长历史。鹰嘴豆营养成分丰富，是不可多得的理想的天然绿色保健食 品，具有广阔的市场开发前景，研究开发利用鹰嘴豆对我国西部。
9、地区经济发展也具有重要 的意义。 发明内容 0005 本发明的目的是以鹰嘴豆为原料，利用中压柱层析，Biogel P-2凝胶过滤层析柱， 分离纯化制备不同纯度-低聚半乳糖及鹰嘴豆糖醇纯品。 附图说明 0006 图1为鹰嘴豆-低聚半乳糖的HPLC图 0007 图2为鹰嘴豆醇的ESI-TOF-MS图谱 说 明 书CN 102898485 A 2/4页 4 0008 图3为鹰嘴豆糖醇的 1 H-NMR图谱 0009 图4不同提取时间对鹰嘴豆低聚糖提取率的影响 0010 图5不同提取料液比对鹰嘴豆低聚糖提取率的影响 0011 图6不同提取温度对鹰嘴豆低聚糖提取率的影响 0012 图7不同浓度的乙醇水溶。
10、液对鹰嘴豆低聚糖提取率的影响 具体实施方式 0013 下面通过实施例，对本发明作进一步描述。 0014 实施例1： 0015 (1)鹰嘴豆-低聚半乳糖的提取、分离及纯化 0016 选取籽粒饱满的鹰嘴豆，用粉碎机粉碎，过60目筛。称取适量鹰嘴豆粉，按料液比 110加入50的乙醇水溶液，于50恒温振荡器中振荡提取，然后5000转离心，收集上 清液，下层豆粉按以上条件再次提取，离心收集上清液。将两次的上清液合并、浓缩和冻干， 得到鹰嘴豆粗提物。 0017 将鹰嘴豆粗提物溶解于适量的去离子水中，经滤膜过滤，滤液上活性炭-硅藻土 (11)中压层析柱。层析柱用一系列线性梯度的乙醇溶液(050)进行洗脱，收。
11、集 洗脱液，利用苯酚-硫酸法和HPLC法分析洗脱液的糖含量与组成，合并合适的组分，并经真 空浓缩与冷冻干燥，分别制备得到-低聚半乳糖含量为7080、8590和90 以上的鹰嘴豆-低聚半乳糖样品。 0018 (2)-低聚半乳糖含量的测定方法 0019 采用HPLC外标法测定样品中的低聚糖含量。色谱条件：色谱柱Sugar-D，检测器 RID，柱温40，流动相为乙腈-水体积比7525，流速1.0mL/min，进样量20L。糖标 准曲线的制备：准确称取果糖、蔗糖、棉籽糖、鹰嘴豆糖醇、水苏糖、毛蕊花糖的标准样品，用 水溶解后，加入等量的乙腈，配制成一系列不同浓度梯度的标准溶液，经滤膜过滤后，进行 HPL。
12、C分析。 0020 (3)鹰嘴豆糖醇的制备与结构分析 0021 鹰嘴豆提取物(提取液冷冻干燥)溶解于适量的去离子水中，经滤膜过滤，滤液过 活性炭-硅藻土(11，w/w)中压层析柱。层析柱用一系列线性浓度梯度(050) 的乙醇进行洗脱，洗脱液经苯酚硫酸法初步检测后，收集其中含糖的洗脱液，进一步通过 HPLC检测各峰洗脱液中的糖组分。将其中未知三糖含量较高的洗脱液合并、浓缩，浓缩液上 Biogel P-2层 析柱，用水进行洗脱，洗脱液经苯酚硫酸法和HPLC检测，将只含有未知三糖 的洗脱液合并、浓缩、冷冻干燥，得到白色的粉末。 0022 纯化得到的未知三糖样品进行 1 H-NMR和ESI-TOF-M。
13、S分析， 1 H-NMR分析时以D 2 O为 溶剂，四甲基硅烷为内标。 0023 (4)鹰嘴豆-低聚半乳糖的肠道益生功能评价 0024 以不同纯度的鹰嘴豆-低聚半乳糖作为碳源，采用体外厌氧粪样混合培养法， 培养结束后，采用荧光原位杂交技术对菌体计数。最后，以益生指数(PI)作为鹰嘴豆-低 聚半乳糖肠道益生功能评价指标。 0025 PI(Bif/Total)+(Lac/Total)(Bac/Total)(His/Total) 说 明 书CN 102898485 A 3/4页 5 0026 式中：Bif代表不同时间点Bifidobacterium spp.的数量除以接种时的数量；Lac 代表不同时。
14、间点Lactobacillus-Enterococcus spp.的数量除以接种时的数量；Bac代表 不同时间点Bacteroides-Prevotella group的数量除以接种时的数量；His代表不同时间 点Clostridiu mhistolyticum group的数量除以接种时的数量；Total代表不同时间点总 菌群的数量除以接种时的数量。 0027 实施例2： 0028 鹰嘴豆-低聚半乳的提取方法及条件优化 0029 (1)鹰嘴豆-低聚半乳的提取方法 0030 整粒提取法：豆粒未经粉碎在低温下经水浸泡后，高温下采用乙醇水溶液进行 浸提。 0031 粉碎提取法：粒经粉碎、脱脂后高温。
15、下采用水溶液、甲醇或乙醇水溶液进行浸 提。由表1可以看出，两种提取方法的提取率是不同的。相比之下，采用粉碎提取方法得到 的蔗糖和-低聚半乳糖的含量均明显高于采用整粒提取法。 0032 表1两种提取方法低聚糖提取率 0033 0034 (2)鹰嘴豆-低聚半乳的提取条件优化 0035 选择粉碎提取法为基础，进行鹰嘴豆低聚糖的提取条件优化实验。 0036 不同提取时间对鹰嘴豆低聚糖提取率的影响 0037 提取时间为15min、30min、60min、90min，提取温度、料液比和提取次数分别为 70、12和2次，计算不同提取时间下，鹰嘴豆中主要的可溶性低聚糖蔗糖和低聚半乳糖 的提取率。每个水平重复3。
16、次。结果表明当提取时间增加至30min以上时，提取时间对低 聚糖的提取率没有显著的影响。提取时间为30min时，低聚糖就能完全被提取出来。 0038 不同提取料液比对鹰嘴豆低聚糖提取率的影响 0039 提取的料液比为15、18、110、115、120，提取温度、时间和提取次数 分别为70、30min和2次。计算采用不同提取料液比，鹰嘴豆中主要的可溶性低聚糖蔗糖 和-低聚半乳糖的提取率。每个水平重复3次。结果表明当料液比为110时，低聚糖 能被完全的浸提出来。 0040 不同提取温度对鹰嘴豆低聚糖提取率的影响 0041 提取温度为室温(20)、50、70、90，提取时间、料液比和次数分别为 30。
17、min、110和2次。计算不同提取温度下，鹰嘴豆中主要的可溶性低聚糖蔗糖和-低 聚半乳糖的提取率。每个水平重复3次。结果表明50是一个最佳的提取温度。 0042 不同浓度的乙醇水溶液对鹰嘴豆低聚糖提取率的影响 0043 提取液乙醇水溶液的浓度为0(纯水)、30、50、70、90，提取时间、料液 说 明 书CN 102898485 A 4/4页 6 比和次数分别为30min、110和2次。计算采用不同浓度的提取液时，鹰嘴豆中主要的可 溶性低聚糖蔗糖和-低聚半乳糖的提取率。每个水平重复3次。结果表明50乙醇溶液 是比较理想的提取溶剂。 说 明 书CN 102898485 A 1/4页 7 图1 说 明 书 附 图CN 102898485 A 2/4页 8 图2 图3 说 明 书 附 图CN 102898485 A 3/4页 9 图4 图5 说 明 书 附 图CN 102898485 A 4/4页 10 图6 图7 说 明 书 附 图CN 102898485 A 10 。