一种用于细胞永生化的真核重组微环表达载体.pdf

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摘要
申请专利号:

CN201410525855.6

申请日:

2014.10.09

公开号:

CN104293832A

公开日:

2015.01.21

当前法律状态:

实审

有效性:

审中

法律详情:

实质审查的生效IPC(主分类):C12N 15/85申请日:20141009|||公开

IPC分类号:

C12N15/85; C12N15/66; C12N5/10

主分类号:

C12N15/85

申请人:

河南农业大学

发明人:

王月影; 张君; 杨国宇; 李和平; 钟凯; 朱河水; 郭豫杰; 鲁维飞; 韩立强; 张超; 焦显芹

地址:

450002 河南省郑州市金水区文化路95号

优先权:

专利代理机构:

郑州联科专利事务所(普通合伙) 41104

代理人:

时立新

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内容摘要

本发明属于基因工程技术领域,具体涉及一种细胞永生化过程中所使用的真核重组微环表达载体Minicircle-MRPS18及其制备方法。该载体由微环质粒与猪的MRPS18基因重组构建,其碱基序列如序列表所示。该载体通过Tubofect试剂转染法转染Hela细胞可制备永生化细胞。本发明特异性的结合了Minicircle质粒载体与MRPS18基因的优点,所制备的真核重组微环表达载体,具有转基因持续表达时间长;不会引起真核细胞的应激非病毒式诱导系统,低免疫源性,安全稳定的优点;且该质粒表达载体表达GFP,便于跟踪反应;同时具备转染效率高、简单易用等优点,可以获得较好的永生化细胞制备效果。

权利要求书

1.  一种用于细胞永生化的真核重组微环表达载体Minicircle-MRP S18,其特征在于,该重组微环表达载体由微环质粒Minicircle与猪的MRP S18基因重组构建,其碱基序列如序列表所示。

2.
  权利要求1所述真核重组微环表达载体Minicircle-MRP S18的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)PCR克隆猪的MRP S18基因;
(2)将步骤(1)中克隆的MRP S18基因与pMD19-T质粒连接,构建pMD19-T-MRPS18重组质粒;
(3)将重组质粒pMD19-T-MRPS18 与Minicircle质粒分别进行双酶切,双酶切产物进行连接,鉴定,获得重组微环表达载体Minicircle-MRP S18。

3.
  权利要求1所述真核重组微环表达载体Minicircle-MRP S18在制备永生化细胞方面的应用。

4.
  如权利要求3所述真核重组微环表达载体Minicircle-MRP S18在制备永生化细胞方面的应用,其特征在于,将真核重组微环表达载体Minicircle-MRP S18通过Tubofect试剂转染法转染Hela细胞。

说明书

一种用于细胞永生化的真核重组微环表达载体
技术领域
本发明属于基因工程技术领域,具体涉及一种细胞永生化过程中所使用的真核重组微环表达载体Minicircle-MRP S18及其制备方法。 
背景技术
永生化细胞是指细胞在自然条件下或人为诱导条件下,从衰老的风险中逃脱而拥有无尽增殖能力的细胞。由于永生化细胞可以作为细胞生物学和组织学等学科研究的标准细胞,并且具有相对稳定的增殖特性和功能,因而具有广阔的应用前景。
MRP S18(mitochondrial ribosome protein S18)蛋白是一种线粒体核糖体蛋白,它能够翻译线粒体蛋白,现有研究表明,MRP S18基因与多种线粒体疾病存在密切的分子遗传学联系,并且与细胞的生长调控也有密切的关系。已有研究发现,MRP S18基因的过表达能够引起小鼠胚胎成纤维细胞永生化(Kashuba E,Yenamandra S P,Darekar S D,et al.;MRPS18–2 protein immortalizes primary rat embryonic fibroblasts and endows them with stem cell-like properties;Proceedings of the National Academy of Sciences,2009,106(47):19866~19871);Elena等发现MRP S18能特异性地结合视网膜蛋白(retinoblastoma,Rb)的磷酸化和去磷酸化形式,但它不与其它的口袋蛋白结合,如p107和p130,从而参与Rb通路的调控。在EB病毒转染的小淋巴细胞中,EBNA-6蛋白能将MRPS18转移到细胞核,替换E2F1结合Rb,导致游离的E2F1增加,促进Rb依赖的细胞周期进程,且MRPS18转染的细胞发生了永生化(Kashuba E,Yurchenko M,Yenamandra S P,et al.;EBV-encoded EBNA-6 binds and targets MRS18-2 to the nucleus,resulting in the disruption of pRb-E2F1 complexes;Proceedings of the National Academy of Sciences,2008,105(14):5489~5494)。
由于体外培养细胞发生自发永生化的机率很低,因此,目前普遍采用转基因技术将外源基因整合到细胞的染色体上,以增加永生化的发生机率。由于脂质体转染法较其他方法的应用简单易用,且转染效率较高,可以转染其他化学方法不容易转染的细胞系,因而使用较为普遍。
载体是将外源基因导入宿主细胞的运载工具,基因表达载体系统包括病毒与非病毒两种。病毒载体的应有常有一定安全隐患存在,主要原因在于病毒容易整合到基因组,具有免疫原性。传统的质粒载体虽然比病毒载体安全,但是转染效率却很低,而且用于转染的用量很大,达到毫克级,因而成本较高;其次传统的质粒载体含有细菌的复制原点、抗性基因、未甲基化的CpG序列以及有些可能隐蔽的表达信号,虽然这些序列在质粒的复制时是必需的,但在目的基因的表达、治疗中可能诱发非常严重的生物安全性问题。 
微环DNA (Minicircle DNA,MC DNA)是一种环状的DNA结构,Minicircle的原始质粒MP是美国SBI公司开发的一种新型真核表达载体,通过MP自身的特异性位点,在阿拉伯糖的诱导下可以使其转变为微环载体Minicircle,它既没有细菌的复制原点,又不含抗性基因,和其它载体相比长度更小。研究表明,Minicircle 载体功能很强,在体内或体外的细胞和组织中能够长期表达转基因,和其他载体相比,转基因持续表达的时间是其他载体的10-1000倍。同时并不会引发真核细胞的应激非病毒式诱导系统,而且表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP),便于观察跟踪,具备转染效率高、体内长期表达等优点,并且简单易用。
现有技术中,关于猪的MRP S18基因的真核表达载体研究使用过pcDNA3.1(+)、pEGFP-N1等载体,然而这些载体中都含有细菌复制起始位点和抗性基因,这些元件可能会使外源基因沉默,因而并不适于制备永生化细胞,而现有技术中,尚未见到较好的载体与MRP S18基因的重组微环表达载体的有关报道。 
发明内容
本发明目的在于提供一种Minicircle 质粒(也称微环质粒)与猪的MRP S18基因构建的真核重组微环表达载体Minicircle-MRPS18,该表达载体可以转染相关细胞用于制备永生化细胞。
本发明采取的技术方案如下:
一种用于细胞永生化的真核重组微环表达载体Minicircle-MRP S18,由微环质粒与猪的MRP S18基因重组构建,其碱基序列如序列表所示。
所述用于细胞永生化的真核重组微环表达载体Minicircle-MRP S18,其制备过程为:首先PCR克隆猪MRP S18基因,然后将克隆的MRP S18基因与质粒pMD19-T连接,构建pMD19-T-MRPS18重组质粒,将构建好的pMD19-T-MRPS18重组质粒和微环质粒进行双酶切,连接,转化,挑取阳性菌落进行菌液PCR和测序鉴定,将鉴定正确的载体收集即为重组微环表达载体Minicircle-MRP S18;
详细制备过程包括如下步骤:
(1)PCR克隆猪的MRP S18基因;
(2)将步骤(1)中克隆的MRP S18基因与pMD19-T质粒连接,构建pMD19-T-MRPS18重组质粒;
(3)将重组质粒pMD19-T-MRPS18 与Minicircle质粒分别进行双酶切,双酶切产物进行连接,鉴定,获得真核重组微环表达载体Minicircle-MRP S18。
所述述用于细胞永生化的真核重组微环表达载体Minicircle-MRP S18,通过Tubofect试剂转染法转化进入转染细胞用于制备永生化细胞。
所述转染细胞为Hela细胞。
本发明采用的外源永生化基因是猪线粒体核糖体蛋白MRP S18基因,该基因在猪的各个组织均有分布,相对其它外源基因来说容易获得,因而是一个安全的、表达稳定的外源基因。本发明所提供的用于细胞永生化的真核重组微环表达载体Minicircle-MRPS18,特异性地结合了Minicircle质粒载体与MRP S18基因各自的优点,所制备的真核重组微环表达载体,具有转基因持续表达时间长;不会引起真核细胞的应激非病毒式诱导系统,低免疫源性,安全稳定的优点;且该质粒表达载体表达GFP,便于跟踪反应;同时具备转染效率高、简单易用等优点,因而适于转染相关细胞,可以获得较好的永生化细胞制备效果。
附图说明
图1为真核重组微环表达载体Minicircle-MRP S18的构建流程示意图;
图2为MRP S18基因PCR扩增结果,其中1为DNA分子质量标准DL2000, 2—4为MRP S18基因PCR扩增结果;
图3为pMD19-T-MRP S18质粒的菌液PCR结果,其中1为DNA分子质量标准DL2000,2—4为pMD19-T-MRP S18质粒的菌液PCR结果;
图4为PMT19-MRP S18克隆载体的双酶切结果,其中1为DNA分子质量标准DL2000,2为PMT19-MRP S18克隆载体的双酶切结果;3为PMT19-MRP S18; 4为DNA分子质量标准Wide Range DL15000;
图5为Minicircle载体的双酶切结果,其中1为DNA分子质量标准Wide Range DL15000; 2为Minicircle载体的双酶切结果;3为Minicircle;
图6为真核重组微环表达载体Minicircle-MRP S18的菌液PCR结果,其中1为DNA分子质量标准DL2000,2—5为真核重组微环表达载体Minicircle-MRP S18的菌液PCR结果;
图7为真核重组微环表达载体Minicircle-MRP S18的诱导结果,其中1为DNA分子质量标准Wide Range DL15000,2为Minicircle-MRP S18的单酶切鉴定结果,3—4为Minicircle-MRP S18的诱导结果;
图8为 Hela细胞中MRPS18基因的mRNA表达水平结果;
图9为 Hela细胞中GFP基因的mRNA表达水平结果;
图10为Minicircle-MRP S18在HeLa细胞的持续时间表达;其中A为试验组48h(10X) ,B为试验组第8d(10X) ,C为试验组第15d(10X),D为试验组第22d (10X) ,E为阴性对照组48h(10X),F为阴性对照组第22d(10X);
图11为MTT法绘制细胞生长曲线结果;
图12为β-半乳糖苷酶活性检测结果,其中A为试验组(10X),B为空白对照组(10X),C为阳性对照组(10X),D为阴性对照组(10X);
图13为免疫化学实验检测细胞中TERT的表达情况结果;其中A为试验组48h (10X), B为空白对照组48h(10X),C为阴性对照组48h(10X);
图14为端粒酶TRAP结果;其中1为试验组,2为空白对照组,3为阳性对照组。 
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明,以使本领域技术人员便于理解和实施本发明。
介绍具体实施例前,对实施例中所用样品来源、主要试剂、设备简要介绍如下,未述及内容以本领域常用设备或试剂为准。
猪的MRP S18基因:取猪的肝脏组织,组织采用液氮速冻后保存于-80℃。
菌株和质粒:pMD19-T载体(Code No. 3271)、E.coli DH5α 菌株(即DH5α感受态细胞,Code No. 9057)购自大连宝生物工程有限公司(TAKARA);MP质粒、ZYCY10P3S2T E.coli菌株购自美国SBI公司。
主要仪器:
温度梯度PCR分析仪,Biometra,Germany;
JY600C电泳仪与JY-SCZ-2电泳槽,北京君意东方电泳设备有限公司;
凝胶成像分析系统,UVP,Germany;
微量紫外分光光度计,Thermo NANODROP 1000;
VD-850型桌上式样洁净工作台,苏州净化;
HH-S2数显电热恒温水浴锅,金怡;
台式小型离心机5424R,Eppendorf,Germany;
申能博彩高精度数控摇床,上海堪鑫仪器设备有限公司;
自动高压灭菌锅,SANYO,Japan;
恒温孵育器,Eppendorf,Germany;
微量移液器,Eppendorf,Germany。
主要试剂及配制:
质粒小量提取试剂盒(AxyPrep Plasmid Miniprep Kit)购自AXYGEN公司;
山羊抗兔抗体为日本中杉金桥公司产品; 
SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒来自上海生工生物工程有限公司;
20% L-阿拉伯糖购自美国SBI公司;
Nhe I(Code No:1622)、Bam HI(Code No:1605)、T4 DNA连接酶、rTaq酶(Code No:RR902A)、DL5000、DL2000、Wide Range DNA Marker15000、Trizol、反转录试剂、5 × M-MLV Buffer(lot::A801A)、10mM dNTP mix(lot:BH2701A) 、Ribonuclease Inhibitor (lot:K6801CA,40U/μL) 、M-MLV Reverse Transcriptase (lot:CK3401A,200U/μL)、oligo(dT) (lot:T401AA,14nmol)、Solution I(Code No. 6023)、10×Green Buffer(Code No:1605)、T4 DNA连接酶(Code No:2040A)、10×T4 DNA Ligase Buffer(Code No:2040A)、SYBR Green mix (lot:AK3803) 购自TAKARA公司;
转染试剂TurboFect购自Thermo公司;
质粒中提试剂盒购自QIAGEN公司;
DMEM培养基、10%胎牛血清、0.25%胰酶为Gibco公司产品;
β-半乳糖苷酶报告基因检测试剂盒为碧云天生物技术研究所产品;
阿霉素购自南京凯基生物科技发展有限公司;
兔抗人hTERT抗体购自武汉博士德生物工程有限公司;
DEPC 水 (lot:3A600180),北京鼎国;
切胶纯化试剂盒(编号:SK8132),上海生工生物工程有限公司。
LB液体培养基:Tryptone(胰蛋白胨)10g,Yeast Extract(酵母提取物)5g,NaCl 5g。配制方法,按照配方分别称量,加入800ml去离子水,混匀使其充分溶解,随后加入去离子水定容至1000mL,用NaOH(5mol/L)溶液调pH值至7.0,高压蒸汽灭菌30min。
氨苄青霉素(Ampicillin)贮存液:称取1g氨苄青霉素于15mL离心管中,加入适量灭菌水,充分溶解后,定容至10ml(终浓度为100mg/mL),用0.22mm过滤膜进行过滤除菌,分装,-20℃保存。使用时每1mL LB液体培养基加入1μL Amp贮存液,使用终浓度为100μg/mL。
卡那霉素(Kanamycin)贮存液:称取0.5g Kanamycin置于15mL离心管中,加入适量灭菌水,充分溶解后,定容至10mL(终浓度为50mg/mL),用0.22mm过滤膜进行过滤除菌,分装(1mL/管),-20℃保存。使用时每1mL LB液体培养基加入1μL该Kana贮存液,使用终浓度为50μg/mL。
IPTG(异丙基硫代-β-D半乳糖苷)贮存液:称取1.2g IPTG置于50mL离心管中,加入适量灭菌水,充分溶解后,定容至50mL,终浓度为24mg/mL,用0.22mm过滤膜进行过滤除菌,分装,-20℃保存。
X-gal(5-溴-4-氢-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)贮存液:称取1g X-gal于50mL离心管中,加入40ml DMF(二甲基甲酰胺),充分溶解后,定容至50mL,终浓度为(20mg/mL),用0.22mm过滤膜进行过滤除菌,分装,置于-20℃保存。
Amp+/LB固体培养基:按照配方先配制1L LB液体培养基,然后加入15g琼脂粉(Agar powder),高压蒸汽灭菌30min。待培养基冷却至60℃时,加入Ampicilin贮存液,至终浓度为100μg/mL,充分混匀,铺制平板培养皿,35mL/90mm培养皿。
Kana +/LB固体培养基:按照配方先配制1L LB液体培养基,然后加入15g琼脂粉(Agar powder),高压蒸汽灭菌30min。待培养基冷却至60℃时,加入Kanamycin贮存液,至终浓度为50μg/mL,充分混匀,铺制平板培养皿,35mL/90mm培养皿。
 50 × TAE 电泳缓冲液(pH8.0):称取242g Tris和37.2g EDTA置于1L烧杯中,加双蒸水800mL,充分溶解,加入57.1mL冰醋酸,充分混匀后调pH值为8.0,然后加入双蒸水定容至1L。
5mg/ml的MTT溶液:称取 50mgMTT溶解于10ml磷酸盐缓冲液中,配成5mg/ml浓度,抽滤除菌,分装避光-20度保存。
10%胎牛血清培养基:900mlDMEM中加入已灭活的胎牛血清100ml,混匀后,调PH值为7.0,0.45um微孔滤膜过滤除菌,4℃保存。
大肠杆菌DH5a和ZYCY10P3S2T E.coli感受态细胞采用CaCl2法扩增培养,具体为:
(1)挑取原菌种,在LB琼脂板上划线,37℃培养过夜(12~16h);
(2)从活化的菌平板上挑取一个单菌落,接种于2mL LB液体培养基中,于37℃摇床培养过夜;次日将该菌液以1%体积比例接种于50mL LB液体培养基中,37℃摇床2~3h,扩大培养;混浊后,每30min测一次OD600,至OD600为0.3左右,停止培养;
(3)冰浴10min,转入50mL离心管中,4℃、4000r/min离心10min;
(4)弃去上清液,用10mL冰浴的0.1mol/L CaCl2溶液(已高压灭菌)重悬细胞后,冰浴30min;然后于4℃、4000r/min离心10min;
(5)弃去上清液,加入2mL预冷的0.1 mol/L CaCl2(含15﹪甘油,已高压灭菌),小心悬浮细胞;
(6)置于冰浴中,以100μL/管分装于小管,置于-80℃保存。
注:以上工作在超净工作台中操作,以避免污染。 
实施例1
本发明所提供的用于细胞永生化的真核重组微环表达载体Minicircle-MRPS18,由微环质粒与猪的MRP S18基因重组构建,其碱基序列如序列表所示。
真核重组微环表达载体Minicircle-MRPS18,其制备过程如图1所示,具体为:首先PCR克隆猪MRP S18基因,然后将克隆的MRP S18基因与质粒pMD19-T连接,构建pMD19-T-MRPS18重组质粒,将构建好的pMD19-T-MRPS18重组质粒和微环质粒进行双酶切,连接,转化,挑取阳性菌落进行菌液PCR和测序鉴定,将鉴定正确的载体收集即为重组微环表达载体Minicircle-MRPS18。
详细制备过程介绍如下:
(1)PCR克隆猪的MRP S18基因;
①引物的设计和合成
根据MRP S18基因的核苷酸序列和表达载体克隆位点的要求,设计引物,引物由上海生工生物工程有限公司设计合成,具体序列如下:
F:5’-CTAGCTAGCGCCACCATGGCTGCCTCCATATTGAACGTG-3’,
R:5’-CGGGATCCCTACAGAGCACTTTGCGG-3’。
②猪肝脏组织中总RNA的提取
总RNA提取采用TRIZOL法,步骤简要介绍如下:
从液氮中取出保存的组织,于锡箔纸上取约100mg,放入2ml离心管中,加入1 mL Trizol,用组织匀浆机冰浴下充分破碎45s,室温静置5min;加入200μL氯仿,剧烈震荡3min,室温静置2min;4℃ 12000 rpm离心15min,可观察到样品分为三层,小心吸取上层水相(约400μL)转移至一新1.5mL离心管中,加入等体积的异丙醇,上下缓慢颠倒混匀后,室温静置20 min,沉淀RNA;4℃ 12000 rpm离心10 min,弃去上清,沉淀用1mL 75%乙醇(DEPC水配制)洗涤,弹起沉淀;4℃ 12000 rpm离心10 min,弃去上清,沉淀用1mL无水乙醇悬浮;4℃ 12000rpm离心5min,弃去上清,倒扣于吸水纸上,自然晾干;根据沉淀的多少用适量的 DEPC水20~100μL溶解,-80℃保存。
③提取的总RNA反转录成cDNA
反转录:模版RNA1μg,oligo(dT) 1μL,加DEPC水至6μL,混匀并瞬离,70℃ 10min后立即冰浴5min,加入以下反转录体系:        
5 × M-MLV Buffer,2μL;
10mM dNTP mix,0.5μL;
Ribonuclease Inhibitor,0.25μL;
M-MLV Reverse Transcriptase,1μL;
DEPC 水,0.25μL。
将以上配制好的产物放入PCR仪中,按以下反应程序进行:30℃ 10 min,42℃ 1h,72℃ 10min,14℃pause。
反应结束后,加50μL的DEPC水,将所得cDNA稀释6倍,所得的cDNA置于-20℃保存备用。
④PCR扩增目的片段
PCR体系:
ddH2O,8.5μL;
rTaq 酶,12.5μL;
步骤①中Primer F(10 pmol/μL),1μL;
步骤①中Primer R(10 pmol/μL),1μL;
步骤③中cDNA,2μL;
反应条件:95℃ 5min,95℃ 30s、56℃ 30s、72℃ 70s,反应39个循环,72℃ 10min。
PCR产物跑1%的琼脂糖凝胶电泳,结果见图2,用切胶纯化试剂盒进行回收。
(2)将步骤(1)中克隆的MRP S18基因与pMD19-T质粒连接,构建pMD19-T-MRPS18重组质粒
按照TaKaRa宝生物工程有限公司pMD-19T载体说明,将MRP S18基因与pMD-19T载体连接。
反应体系如下:
步骤(1)中PCR扩增后MRP S18基因,1.5μL;
pMD-19T(50 ng /uL),1μL;
Solution I(TAKARA,Code No. 6023),5μL;
双蒸水,2.5μL;
连接温度16℃,时间12h,冰上放置5min。
取连接完成后取10μL液体转化入DH5α感受态细胞中,均匀涂在含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养平板上(37℃、12~16h)。挑取单个菌落于含氨苄青霉素的(100μg/mL)LB培养液中培养(37℃、5h),进行菌液PCR鉴定。
PCR鉴定体系如下:
ddH2O,8.5μL;
rTaq酶,12.5μL;
步骤(1)中Primer F(10 pmol/μL),1μL;
步骤(1)中Primer R(10 pmol/μL),1μL;
菌液,2μL。
反应条件:95℃ 5min,95℃ 30s、56℃ 30s、72℃ 70s,反应39个循环,72℃10min。
PCR产物跑1%的琼脂糖凝胶电泳,结果见图3。
(3)构建重组微环表达载体Minicircle-MRPS18
分别将重组质粒pMD19-T-MRPS18 与Minicircle质粒进行双酶切,双酶切产物进行连接,鉴定,构建重组微环表达载体Minicircle-MRPS18。具体如下:
①Minicircle质粒和pMD19-T-MRP S18重组质粒分别进行双酶切
酶切体系: 
NheI,1μl;
Bam HI,1μl;
10×Green Buffe,2μl;
Minicircle质粒或步骤(2)中pMD19T- MRP S18(100ng/μL,9μL);
高压双蒸水,up to 20μL;
酶切温度37℃,时间30min。
酶切产物跑1%的琼脂糖凝胶电泳,结果见图4和图5。用切胶纯化试剂盒进行回收酶切产物。
②酶切产物进行连接
连接体系:
T4 DNA连接酶,1μL;
10×T4 DNA Ligase Buffer,2.5μL;
步骤①中双酶切MRP S18片段(20ng/μL),1μL;
步骤①中双酶切Minicircle质粒片段(32.1ng/μL),3.5μL;
灭菌水,12μL;
连接温度16℃,时间12h,冰上放置5min。
取10μL连接体系转化入DH5α感受态细胞中,均匀涂在含卡那霉素(50μg/mL)的LB培养平板上。挑取单个菌落于含卡那霉素(50μg/mL)的LB培养液中培养,进行菌液PCR鉴定。
PCR鉴定体系如下:
ddH2O,8.5μL;
rTaq酶,12.5μL;
步骤(1)中Primer F(10 pmol/μL),1μL;
步骤(1)中Primer R(10 pmol/μL),1μL;
菌液,2μL。
反应条件:95℃ 5min,95℃ 30s、56℃ 30s、72℃ 70s,反应39个循环,72℃ 10min。PCR产物跑1%的琼脂糖凝胶电泳,结果见图6。
③微环质粒Minicircle质粒诱导表达效果鉴定
将步骤②中构建得到的Minicircle-MRP S18重组微环表达载体转化入ZYCY10P3S2T感受态细胞,经20% L-阿拉伯糖诱导后,用NheI酶切来鉴定微环诱导的效果。
酶切体系:
NheI,1μL;
10×Green Buffer,2μL;
pMD19T- MRP S18(100ng/μL) ,9μL;
高压双蒸水,up to 20μl;
酶切温度37℃,时间30min。
酶切产物跑1%的琼脂糖凝胶电泳,结果见图7。结果表明微环质粒Minicircle质粒正确表达,所构建的Minicircle-MRP S18重组微环表达载体可以用来转染细胞。
实施例2
为检验实施例1所构建的真核重组微环表达载体Minicircle-MRP S18在细胞永生化方面的具体技术效果,发明人将Minicircle-MRP S18转染人子宫癌细胞Hela cell后,在细胞水平上进一步检测了该基因的表达情况及对相关的细胞永生化指标进行了检测(细胞永生化指标有:实时定量PCR检测基因的表达以及Minicircle中GFP 的表达,荧光持续时间观察,MTT法细胞生长曲线绘制,细胞衰老标志β-半乳糖苷酶活性检测,免疫化学实验检测细胞中TERT的表达,端粒酶活性的检测),具体介绍如下。
①重组微环表达载体Minicircle-MRP S18转染Hela细胞
用含10%灭活胎牛血清的DMEM培养液,在5% CO、37℃条件下培养人子宫癌细胞Hela 细胞,采用Tubofect试剂转染法转染;同时设置了Minicircle转染的Hela细胞作为对照。
②实时荧光定量PCR检测MRP S18基因、GFP在Hela细胞中的表达
为检验MRP S18基因、GFP在Hela细胞中的表达情况,发明人分别从转染Minicircle-MRP S18的Hela细胞、转染Minicircle的Hela细胞、未转染的正常的Hela细胞中提取了总RNA并进行RT-PCR合成cDNA,通过Real time Q-PCR进行基因mRNA表达水平的检测。mRNA相对表达量结果用GraphPad Prism 5统计软件分析处理。
如图8所示,针对MRP S18基因表达结果表明,转染Minicircle-MRP S18的Hela细胞与转染Minicircle的Hela细胞相比,MRP S18基因表达水平显著升高。
如图9所示,针对GFP的表达结果表明,转染Minicircle-MRP S18的Hela细胞与转染Minicircle的Hela细胞相比,GFP的表达水平无显著差异。
具体步骤如下:
分别将转染真核重组微环表达载体Minicircle-MRP S18的Hela细胞、Minicircle的Hela细胞及正常Hela细胞培养48h后提总RNA,反转录成cDNA,将各样品的cDNA原液用DEPC-H2O进行50倍稀释,将稀释后的cDNA作为反应模板,单个样品的每个基因均作3孔重复以减少试验误差,分别以MRP S18、Minicircle质粒片段中的GFP Q-PCR为引物,以人β-actin为内参,进行Real Time PCR。引物由大连宝生物工程有限公司合成。
MRP S18 Q-PCR引物序列:
上游为GGGACCTTGACTTCAGTACCACTC,
下游为GCTCTCTCTCTGGTGGCTGTTT;
GFP Q-PCR引物序列:
上游为CGCATGACCAACAAGATGAAG,
下游为GGTAGGTGCCGAAGTGGGATA;
β-actin Q-PCR引物序列:
上游为GGGTCAGA AGGATTCCTATG,
下游为GGTCTCAAACATGATCTGGG。
荧光定量PCR检测相关基因:以稀释后各样品的cDNA作为反应模板,每个样品的单个基因做3孔重复用来减少试验中的误差,每一个样品均有管家基因β-actin作为对照。反应体系如下:
         SYBR Green mix ,5μL;
        上游引物(20 pmol/μL),0.1μL;
       下游引物(20 pmol/μL),0.1μL;
        cDNA,1.25uL;
       DEPC 水,3.55μL。
最佳反应程序为:95℃ 2min,95℃ 15s、60℃ 20s,40个循环,72℃ 20s。
荧光信号的采集设置在PCR反应的延伸阶段,阈值及基线由软件自动生成。扩增程序设置后,再插入熔解曲线的反应程序,具体程序为:95℃ 15s,60℃ 15s,95℃ 15s。
③Minicircle-MRP S18真核重组微环表达载体转染Hela细胞后荧光持续时间的观察
转染前8h将处于对数生长期的Hela细胞以l×105/孔的密度接种于12孔板,待细胞生长达40%-60%融合度时,按Tubofect转染试剂盒说明书进行转染,设置不转质粒的Hela细胞作为阴性对照组,24 h后观察各自的荧光情况,持续观察直至荧光消失。
用荧光显微镜拍照结果如图10所示。
从图中可以看到,转入Minicircle-MRP S18重组微环表达载体的细胞出现了绿色荧光(图A),表明微环表达载体成功转染入细胞中,持续观察到第22d时,荧光消失(图D),表明表达效果较为持久。
④MTT法细胞生长曲线的绘制
实验分为3组:转染Minicircle的空白对照组,转染Minicircle-MRP S18基因组,未转染质粒的正常的Hela细胞。转染6个小时后每孔加入MTT液(5mg/mL)10uL,于培养箱中培养4h后,弃上清,每孔加入150uL二甲基亚枫(saikebio,CAS:67685)。震荡使结晶充分溶解,在多功能酶标仪上测定吸收度A492nm。连续检测5天后,分析吸收度A492nm值,以时间为横坐标,以OD值为纵坐标作生长曲线图,如图11所示。结果表明猪MRPS18基因对Hela细胞的生长有抑制,但生长趋势正常。
⑤β-半乳糖苷酶报告基因检测
β-半乳糖苷酶是一种常用的衰老标志物的报告基因,可以进行原位染色,在光学显微镜下就能够观察到细胞或组织中的β-半乳糖苷酶的表达。
以β-半乳糖苷酶原位染色试剂盒(碧云天生物技术研究所,编号:C0602)对了β-半乳糖苷酶报告基因的表达情况进行了检测鉴定。实验分为4组:转染Minicircle的空白对照组,转染Minicircle-MRP S18试验组,正常的Hela的未刺激的阴性对照组和正常的Hela刺激细胞衰老后的阳性对照组。
β-半乳糖苷酶原位染色试剂盒以X-Gal为底物,β-半乳糖苷酶能够催化其生成深蓝色产物,这样在普通显微镜下就能观察到变成蓝色的衰老的细胞。可根据细胞染色情况观察,细胞染色成蓝色说明细胞衰老,染色越深说明衰老越明显。结果如图12所示,结果显示MRP S18对细胞的衰老有抑制作用。
⑥免疫化学实验检测细胞中TERT的表达情况
将1μg Minicircle-MRP S18重组质粒转染入Hela 细胞中作为试验组,同时设置未转染即正常的Hela细胞的阴性对照组,转染质粒Minicircle的空白对照组做免疫化学实验观察TERT的表达情况。
48h后做免疫组化,观察细胞中的TERT的表达,染色越深代表细胞中的TERT表达量越高。结果显示,MRPS18能促进细胞中TERT的表达。如图13。
具体步骤如下:
固定:吸出培养基,PBS(博士德,0.1M)洗2次,冷丙酮(烟台市双双化工有限公司,批号265141)固定10min。
吸出丙酮,加PBS清洗5min。玻片取出晾干。
滴加1:300(PBS)稀释的兔抗人TERT抗体(武汉博士德生物工程有限公司),置湿盒中,37℃,1h。
取出玻片,PBS震洗3次,每次5min,吹干。
滴加1:100(PBS)稀释的山羊抗兔抗体(日本中杉金桥公司),置于湿盒中,37℃,1h。
取出玻片,PBS震洗3次,每次5min,吹干。
DAB(中杉金桥,ZLI-9017/9018/9019)显色10min,室温。
自来水冲洗(终止DAB染色)。
中性树脂(中国上海标本模型厂)封片、拍照。
⑦端粒酶活性的检测
将1μg Minicircle-MRP S18重组质粒转染入Hela 细胞中作为试验组,同时设置未转染即正常Hela细胞阳性对照组,转染质粒Minicircle的空白对照组,培养48h后进行细胞端粒酶活性的检测,结果如图14。端粒酶试剂盒(南京凯基生物,CAT NO.KGA413)在凝胶电泳上显示间隔6bp阶梯状分离的阳性结果,端粒酶活性的大小可由条带得深浅及多少来说明。结果表明MRP S18能增强端粒酶的活性。具体操作如下。
转染体系:
质粒,1μg;
DMEM(无血清) (Gibco公司,lot NO.1233130),100μL;
转染试剂,2μL;
将质粒和DMEM混匀后静置5min,加入转染试剂混匀,静置15min,滴加到12孔板中,边加边缓慢摇动,12h换液。
                         SEQUENCE LISTING
 
<110>  河南农业大学
 
<120>  一种用于细胞永生化的真核重组微环表达载体
 
<130>  none
 
<160>  1    
 
<170>  PatentIn version 3.5
 
<210>  1
<211>  7040
<212>  DNA
<213>  真核重组微环表达载体Minicircle-MRP S18
 
<400>  1
acattaccct gttatcccta gatgacatta ccctgttatc ccagatgaca ttaccctgtt       60
 
atccctagat gacattaccc tgttatccct agatgacatt taccctgtta tccctagatg      120
 
acattaccct gttatcccag atgacattac cctgttatcc ctagatacat taccctgtta      180
 
tcccagatga cataccctgt tatccctaga tgacattacc ctgttatccc agatgacatt      240
 
accctgttat ccctagatac attaccctgt tatcccagat gacataccct gttatcccta      300
 
gatgacatta ccctgttatc ccagatgaca ttaccctgtt atccctagat acattaccct      360
 
gttatcccag atgacatacc ctgttatccc tagatgacat taccctgtta tcccagatga      420
 
cattaccctg ttatccctag atacattacc ctgttatccc agatgacata ccctgttatc      480
 
cctagatgac attaccctgt tatcccagat gacattaccc tgttatccct agatacatta      540
 
ccctgttatc ccagatgaca taccctgtta tccctagatg acattaccct gttatcccag      600
 
atgacattac cctgttatcc ctagatacat taccctgtta tcccagatga cataccctgt      660
 
tatccctaga tgacattacc ctgttatccc agataaactc aatgatgatg atgatgatgg      720
 
tcgagactca gcggccgcgg tgccagggcg tgcccttggg ctccccgggc gcgactagtg      780
 
aattgatact agtattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac      840
 
atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg      900
 
cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg      960
 
agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca     1020
 
ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctcgttta     1080
 
gtgaaccgtc agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagattc     1140
 
tagaggatcc gcggccgcaa ggatctgcga tcgctccggt gcccgtcagt gggcagagcg     1200
 
cacatcgccc acagtccccg agaagttggg gggaggggtc ggcaattgaa cgggtgccta     1260
 
gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc     1320
 
cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa     1380
 
cgggtttgcc gccagaacac agctgaagct tcgaggggct cgcatctctc cttcacgcgc     1440
 
ccgccgccct acctgaggcc gccatccacg ccggttgagt cgcgttctgc cgcctcccgc     1500
 
ctgtggtgcc tcctgaactg cgtccgccgt ctaggtaagt ttaaagctca ggtcgagacc     1560
 
gggcctttgt ccggcgctcc cttggagcct acctagactc agccggctct ccacgctttg     1620
 
cctgaccctg cttgctcaac tctacgtctt tgtttcgttt tctgttctgc gccgttacag     1680
 
atccaagctg tgaccggcgc ctacgctaga cgccaccatg gagagcgacg agagcggcct     1740
 
gcccgccatg gagatcgagt gccgcatcac cggcaccctg aacggcgtgg agttcgagct     1800
 
ggtgggcggc ggagagggca cccccaagca gggccgcatg accaacaaga tgaagagcac     1860
 
caaaggcgcc ctgaccttca gcccctacct gctgagccac gtgatgggct acggcttcta     1920
 
ccacttcggc acctacccca gcggctacga gaaccccttc ctgcacgcca tcaacaacgg     1980
 
cggctacacc aacacccgca tcgagaagta cgaggacggc ggcgtgctgc acgtgagctt     2040
 
cagctaccgc tacgaggccg gccgcgtgat cggcgacttc aaggtggtgg gcaccggctt     2100
 
ccccgaggac agcgtgatct tcaccgacaa gatcatccgc agcaacgcca ccgtggagca     2160
 
cctgcacccc atgggcgata acgtgctggt gggcagcttc gcccgcacct tcagcctgcg     2220
 
cgacggcggc tactacagct tcgtggtgga cagccacatg cacttcaaga gcgccatcca     2280
 
ccccagcatc ctgcagaacg ggggccccat gttcgccttc cgccgcgtgg aggagctgca     2340
 
cagcaacacc gagctgggca tcgtggagta ccagcacgcc ttcaagaccc ccatcgcctt     2400
 
cgccagatcc cgcgctcagt cgtccaattc tgccgtggac ggcaccgccg gacccggctc     2460
 
caccggatct cgctaagtcg acaatcaacc tctggattac aaaatttgtg aaagattgac     2520
 
tggtattctt aactatgttg ctccttttac gctatgtgga tacgctgctt taatgccttt     2580
 
gtatcatgct attgcttccc gtatggcttt cattttctcc tccttgtata aatcctggtt     2640
 
gctgtctctt tatgaggagt tgtggcccgt tgtcaggcaa cgtggcgtgg tgtgcactgt     2700
 
gtttgctgac gcaaccccca ctggttgggg cattgccacc acctgtcagc tcctttccgg     2760
 
gactttcgct ttccccctcc ctattgccac ggcggaactc atcgccgcct gccttgcccg     2820
 
ctgctggaca ggggctcggc tgttgggcac tgacaattcc gtggtgttgt cggggaaatc     2880
 
atcgtccttt ccttggctgc tcgcctgtgt tgccacctgg attctgcgcg ggacgtcctt     2940
 
ctgctacgtc ccttcggccc tcaatccagc ggaccttcct tcccgcggcc tgctgccggc     3000
 
tctgcggcct cttccgcgtc ttcgccttcg ccctcagacg agtcggatct ccctttgggc     3060
 
cgcctccccg cctggtacct ttaagaccaa tgacttacaa ggcagctgta gatcttagcc     3120
 
actttttaaa agaaaagggg ggactggaag ggctaattca ctcccaacga aaataagatc     3180
 
tgctttttgc ttgtactggg tctctctggt tagaccagat ctgagcctgg gagctctctg     3240
 
gctaactagg gaacccactg cttaagcctc aataaagctt gccttgagtg cttcaagtag     3300
 
tgtgtgcccg tctgttgtgt gactctggta actagagatc cctcagaccc ttttagtcag     3360
 
tgtggaaaat ctctagcagt agtagttcat gtcatcttat tattcagtat ttataacttg     3420
 
caaagaaatg aatatcagag agtgagagga acttgtttat tgcagcttat aatggttaca     3480
 
aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg cattctagtt     3540
 
gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt atcatgtctg gctctagcta tcccgcccct     3600
 
aactccgccc agttccgccc attctccgcc cctcccgccc ctaactccgc ccaatggctg     3660
 
actaattttt tttatttatg cagaggccga ggccgcctcg gcctctgagc tattccagaa     3720
 
gtagtgagga ggcttttttg gaggcctaga cttttgcaga tcgacccatg ggggcccgcc     3780
 
ccaactgggg taacctttga gttctctcag ttgggggtaa tcagcatcat gatgtggtac     3840
 
cacatcatga tgctgattat aagaatgcgg ccgccacact ctagtggatc tcgagttaat     3900
 
aattcagaag aactcgtcaa gaaggcgata gaaggcgatg cgctgcgaat cgggagcggc     3960
 
gataccgtaa agcacgagga agcggtcagc ccattcgccg ccaagctctt cagcaatatc     4020
 
acgggtagcc aacgctatgt cctgatagcg gtccgccaca cccagccggc cacagtcgat     4080
 
gaatccagaa aagcggccat tttccaccat gatattcggc aagcaggcat cgccatgggt     4140
 
cacgacgaga tcctcgccgt cgggcatgct cgccttgagc ctggcgaaca gttcggctgg     4200
 
cgcgagcccc tgatgctctt cgtccagatc atcctgatcg acaagaccgg cttccatccg     4260
 
agtacgtgct cgctcgatgc gatgtttcgc ttggtggtcg aatgggcagg tagccggatc     4320
 
aagcgtatgc agccgccgca ttgcatcagc catgatggat actttctcgg caggagcaag     4380
 
gtgtagatga catggagatc ctgccccggc acttcgccca atagcagcca gtcccttccc     4440
 
gcttcagtga caacgtcgag cacagctgcg caaggaacgc ccgtcgtggc cagccacgat     4500
 
agccgcgctg cctcgtcttg cagttcattc agggcaccgg acaggtcggt cttgacaaaa     4560
 
agaaccgggc gcccctgcgc tgacagccgg aacacggcgg catcagagca gccgattgtc     4620
 
tgttgtgccc agtcatagcc gaatagcctc tccacccaag cggccggaga acctgcgtgc     4680
 
aatccatctt gttcaatcat gcgaaacgat cctcatcctg tctcttgatc agagcttgat     4740
 
cccctgcgcc atcagatcct tggcggcgag aaagccatcc agtttacttt gcagggcttc     4800
 
ccaaccttac cagagggcgc cccagctggc aattccggtt cgcttgctgt ccataaaacc     4860
 
gcccagtcta gctatcgcca tgtaagccca ctgcaagcta cctgctttct ctttgcgctt     4920
 
gcgttttccc ttgtccagat agcccagtag ctgacattca tccggggtca gcaccgtttc     4980
 
tgcggactgg ctttctacgt gctcgagggg ggccaaacgg tctccagctt ggctgttttg     5040
 
gcggatgaga gaagattttc agcctgatac agattaaatc agaacgcaga agcggtctga     5100
 
taaaacagaa tttgcctggc ggcagtagcg cggtggtccc acctgacccc atgccgaact     5160
 
cagaagtgaa acgccgtagc gccgatggta gtgtggggtc tccccatgcg agagtaggga     5220
 
actgccaggc atcaaataaa acgaaaggct cagtcgaaag actgggcctt tcgttttatc     5280
 
tgttgtttgt cggtgaacgc tctcctgagt aggacaaatc cgccgggagc ggatttgaac     5340
 
gttgcgaagc aacggcccgg agggtggcgg gcaggacgcc cgccataaac tgccaggcat     5400
 
caaattaagc agaaggccat cctgacggat ggcctttttg cgtttctaca aactcttttg     5460
 
tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg accaaaatcc cttaacgtga     5520
 
gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc     5580
 
tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt     5640
 
ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc     5700
 
gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc     5760
 
tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg     5820
 
cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg     5880
 
gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga     5940
 
actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc     6000
 
ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg     6060
 
gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg     6120
 
atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt     6180
 
tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc     6240
 
tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg     6300
 
aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcctga tgcggtattt     6360
 
tctccttacg catctgtgcg gtatttcaca ccgcatatgg tgcactctca gtacaatctg     6420
 
ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatac actccgctat cgctacgtga ctgggtcatg     6480
 
gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg tctgctcccg     6540
 
gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca gaggttttca     6600
 
ccgtcatcac cgaaacgcgc gaggcagcag atcaattcgc gcgcgaaggc gaagcggcat     6660
 
gcataatgtg cctgtcaaat ggacgaagca gggattctgc aaaccctatg ctactccgtc     6720
 
aagccgtcaa ttgtctgatt cgttaccaat tatgacaact tgacggctac atcattcact     6780
 
ttttcttcac aaccggcacg gaactcgctc gggctggccc cggtgcattt tttaaatacc     6840
 
cgcgagaaat agagttgatc gtcaaaacca acattgcgac cgacggtggc gataggcatc     6900
 
cgggtggtgc tcaaaagcag cttcgcctgg ctgatacgtt ggtcctcgcg ccagcttaag     6960
 
acgctaatcc ctaactgctg gcggaaaaga tgtgacagac gcgacggcga caagcaaaca     7020
 
tgctgtgcga cgctggcgat                                                 7040

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1、10申请公布号CN104293832A43申请公布日20150121CN104293832A21申请号201410525855622申请日20141009C12N15/85200601C12N15/66200601C12N5/1020060171申请人河南农业大学地址450002河南省郑州市金水区文化路95号72发明人王月影张君杨国宇李和平钟凯朱河水郭豫杰鲁维飞韩立强张超焦显芹74专利代理机构郑州联科专利事务所普通合伙41104代理人时立新54发明名称一种用于细胞永生化的真核重组微环表达载体57摘要本发明属于基因工程技术领域,具体涉及一种细胞永生化过程中所使用的真核重组微环表达载体MINICI。

2、RCLEMRPS18及其制备方法。该载体由微环质粒与猪的MRPS18基因重组构建,其碱基序列如序列表所示。该载体通过TUBOFECT试剂转染法转染HELA细胞可制备永生化细胞。本发明特异性的结合了MINICIRCLE质粒载体与MRPS18基因的优点,所制备的真核重组微环表达载体,具有转基因持续表达时间长;不会引起真核细胞的应激非病毒式诱导系统,低免疫源性,安全稳定的优点;且该质粒表达载体表达GFP,便于跟踪反应;同时具备转染效率高、简单易用等优点,可以获得较好的永生化细胞制备效果。51INTCL权利要求书1页说明书11页序列表7页附图9页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求。

3、书1页说明书11页序列表7页附图9页10申请公布号CN104293832ACN104293832A1/1页21一种用于细胞永生化的真核重组微环表达载体MINICIRCLEMRPS18,其特征在于,该重组微环表达载体由微环质粒MINICIRCLE与猪的MRPS18基因重组构建,其碱基序列如序列表所示。2权利要求1所述真核重组微环表达载体MINICIRCLEMRPS18的制备方法,其特征在于,包括如下步骤(1)PCR克隆猪的MRPS18基因;(2)将步骤(1)中克隆的MRPS18基因与PMD19T质粒连接,构建PMD19TMRPS18重组质粒;(3)将重组质粒PMD19TMRPS18与MINICI。

4、RCLE质粒分别进行双酶切,双酶切产物进行连接,鉴定,获得重组微环表达载体MINICIRCLEMRPS18。3权利要求1所述真核重组微环表达载体MINICIRCLEMRPS18在制备永生化细胞方面的应用。4如权利要求3所述真核重组微环表达载体MINICIRCLEMRPS18在制备永生化细胞方面的应用,其特征在于,将真核重组微环表达载体MINICIRCLEMRPS18通过TUBOFECT试剂转染法转染HELA细胞。权利要求书CN104293832A1/11页3一种用于细胞永生化的真核重组微环表达载体技术领域0001本发明属于基因工程技术领域,具体涉及一种细胞永生化过程中所使用的真核重组微环表达载。

5、体MINICIRCLEMRPS18及其制备方法。背景技术0002永生化细胞是指细胞在自然条件下或人为诱导条件下,从衰老的风险中逃脱而拥有无尽增殖能力的细胞。由于永生化细胞可以作为细胞生物学和组织学等学科研究的标准细胞,并且具有相对稳定的增殖特性和功能,因而具有广阔的应用前景。0003MRPS18MITOCHONDRIALRIBOSOMEPROTEINS18蛋白是一种线粒体核糖体蛋白,它能够翻译线粒体蛋白,现有研究表明,MRPS18基因与多种线粒体疾病存在密切的分子遗传学联系,并且与细胞的生长调控也有密切的关系。已有研究发现,MRPS18基因的过表达能够引起小鼠胚胎成纤维细胞永生化(KASHUB。

6、AE,YENAMANDRASP,DAREKARSD,ETAL;MRPS182PROTEINIMMORTALIZESPRIMARYRATEMBRYONICBROBLASTSANDENDOWSTHEMWITHSTEMCELLLIKEPROPERTIES;PROCEEDINGSOFTHENATIONALACADEMYOFSCIENCES,2009,106471986619871);ELENA等发现MRPS18能特异性地结合视网膜蛋白RETINOBLASTOMA,RB)的磷酸化和去磷酸化形式,但它不与其它的口袋蛋白结合,如P107和P130,从而参与RB通路的调控。在EB病毒转染的小淋巴细胞中,EBN。

7、A6蛋白能将MRPS18转移到细胞核,替换E2F1结合RB,导致游离的E2F1增加,促进RB依赖的细胞周期进程,且MRPS18转染的细胞发生了永生化(KASHUBAE,YURCHENKOM,YENAMANDRASP,ETAL;EBVENCODEDEBNA6BINDSANDTARGETSMRS182TOTHENUCLEUS,RESULTINGINTHEDISRUPTIONOFPRBE2F1COMPLEXES;PROCEEDINGSOFTHENATIONALACADEMYOFSCIENCES,2008,1051454895494)。0004由于体外培养细胞发生自发永生化的机率很低,因此,目前普遍采。

8、用转基因技术将外源基因整合到细胞的染色体上,以增加永生化的发生机率。由于脂质体转染法较其他方法的应用简单易用,且转染效率较高,可以转染其他化学方法不容易转染的细胞系,因而使用较为普遍。0005载体是将外源基因导入宿主细胞的运载工具,基因表达载体系统包括病毒与非病毒两种。病毒载体的应有常有一定安全隐患存在,主要原因在于病毒容易整合到基因组,具有免疫原性。传统的质粒载体虽然比病毒载体安全,但是转染效率却很低,而且用于转染的用量很大,达到毫克级,因而成本较高;其次传统的质粒载体含有细菌的复制原点、抗性基因、未甲基化的CPG序列以及有些可能隐蔽的表达信号,虽然这些序列在质粒的复制时是必需的,但在目的基。

9、因的表达、治疗中可能诱发非常严重的生物安全性问题。微环DNAMINICIRCLEDNA,MCDNA是一种环状的DNA结构,MINICIRCLE的原始质粒MP是美国SBI公司开发的一种新型真核表达载体,通过MP自身的特异性位点,在阿拉伯糖的诱导下可以使其转变为微环载体MINICIRCLE,它既没有细菌的复制原点,又不含抗性基因,和其它载体相比长度更小。研究表明,MINICIRCLE载体功能很强,在体内或体外的细说明书CN104293832A2/11页4胞和组织中能够长期表达转基因,和其他载体相比,转基因持续表达的时间是其他载体的101000倍。同时并不会引发真核细胞的应激非病毒式诱导系统,而且表。

10、达绿色荧光蛋白GREENFLUORESCENTPROTEIN,GFP,便于观察跟踪,具备转染效率高、体内长期表达等优点,并且简单易用。0006现有技术中,关于猪的MRPS18基因的真核表达载体研究使用过PCDNA31、PEGFPN1等载体,然而这些载体中都含有细菌复制起始位点和抗性基因,这些元件可能会使外源基因沉默,因而并不适于制备永生化细胞,而现有技术中,尚未见到较好的载体与MRPS18基因的重组微环表达载体的有关报道。发明内容0007本发明目的在于提供一种MINICIRCLE质粒(也称微环质粒)与猪的MRPS18基因构建的真核重组微环表达载体MINICIRCLEMRPS18,该表达载体可以。

11、转染相关细胞用于制备永生化细胞。0008本发明采取的技术方案如下一种用于细胞永生化的真核重组微环表达载体MINICIRCLEMRPS18,由微环质粒与猪的MRPS18基因重组构建,其碱基序列如序列表所示。0009所述用于细胞永生化的真核重组微环表达载体MINICIRCLEMRPS18,其制备过程为首先PCR克隆猪MRPS18基因,然后将克隆的MRPS18基因与质粒PMD19T连接,构建PMD19TMRPS18重组质粒,将构建好的PMD19TMRPS18重组质粒和微环质粒进行双酶切,连接,转化,挑取阳性菌落进行菌液PCR和测序鉴定,将鉴定正确的载体收集即为重组微环表达载体MINICIRCLEMR。

12、PS18;详细制备过程包括如下步骤(1)PCR克隆猪的MRPS18基因;(2)将步骤(1)中克隆的MRPS18基因与PMD19T质粒连接,构建PMD19TMRPS18重组质粒;(3)将重组质粒PMD19TMRPS18与MINICIRCLE质粒分别进行双酶切,双酶切产物进行连接,鉴定,获得真核重组微环表达载体MINICIRCLEMRPS18。0010所述述用于细胞永生化的真核重组微环表达载体MINICIRCLEMRPS18,通过TUBOFECT试剂转染法转化进入转染细胞用于制备永生化细胞。0011所述转染细胞为HELA细胞。0012本发明采用的外源永生化基因是猪线粒体核糖体蛋白MRPS18基因,。

13、该基因在猪的各个组织均有分布,相对其它外源基因来说容易获得,因而是一个安全的、表达稳定的外源基因。本发明所提供的用于细胞永生化的真核重组微环表达载体MINICIRCLEMRPS18,特异性地结合了MINICIRCLE质粒载体与MRPS18基因各自的优点,所制备的真核重组微环表达载体,具有转基因持续表达时间长;不会引起真核细胞的应激非病毒式诱导系统,低免疫源性,安全稳定的优点;且该质粒表达载体表达GFP,便于跟踪反应;同时具备转染效率高、简单易用等优点,因而适于转染相关细胞,可以获得较好的永生化细胞制备效果。附图说明说明书CN104293832A3/11页50013图1为真核重组微环表达载体MI。

14、NICIRCLEMRPS18的构建流程示意图;图2为MRPS18基因PCR扩增结果,其中1为DNA分子质量标准DL2000,24为MRPS18基因PCR扩增结果;图3为PMD19TMRPS18质粒的菌液PCR结果,其中1为DNA分子质量标准DL2000,24为PMD19TMRPS18质粒的菌液PCR结果;图4为PMT19MRPS18克隆载体的双酶切结果,其中1为DNA分子质量标准DL2000,2为PMT19MRPS18克隆载体的双酶切结果;3为PMT19MRPS18;4为DNA分子质量标准WIDERANGEDL15000;图5为MINICIRCLE载体的双酶切结果,其中1为DNA分子质量标准W。

15、IDERANGEDL15000;2为MINICIRCLE载体的双酶切结果;3为MINICIRCLE;图6为真核重组微环表达载体MINICIRCLEMRPS18的菌液PCR结果,其中1为DNA分子质量标准DL2000,25为真核重组微环表达载体MINICIRCLEMRPS18的菌液PCR结果;图7为真核重组微环表达载体MINICIRCLEMRPS18的诱导结果,其中1为DNA分子质量标准WIDERANGEDL15000,2为MINICIRCLEMRPS18的单酶切鉴定结果,34为MINICIRCLEMRPS18的诱导结果;图8为HELA细胞中MRPS18基因的MRNA表达水平结果;图9为HELA。

16、细胞中GFP基因的MRNA表达水平结果;图10为MINICIRCLEMRPS18在HELA细胞的持续时间表达;其中A为试验组48H10X,B为试验组第8D10X,C为试验组第15D10X,D为试验组第22D10X,E为阴性对照组48H(10X),F为阴性对照组第22D10X;图11为MTT法绘制细胞生长曲线结果;图12为半乳糖苷酶活性检测结果,其中A为试验组10X,B为空白对照组10X,C为阳性对照组10X,D为阴性对照组10X;图13为免疫化学实验检测细胞中TERT的表达情况结果;其中A为试验组48H10X,B为空白对照组48H10X,C为阴性对照组48H10X;图14为端粒酶TRAP结果;。

17、其中1为试验组,2为空白对照组,3为阳性对照组。具体实施方式0014下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明,以使本领域技术人员便于理解和实施本发明。0015介绍具体实施例前,对实施例中所用样品来源、主要试剂、设备简要介绍如下,未述及内容以本领域常用设备或试剂为准。0016猪的MRPS18基因取猪的肝脏组织,组织采用液氮速冻后保存于80。0017菌株和质粒PMD19T载体(CODENO3271)、ECOLIDH5菌株(即DH5感受态细胞,CODENO9057)购自大连宝生物工程有限公司(TAKARA);MP质粒、ZYCY10P3S2TECOLI菌株购自美国SBI公司。0018主要仪器温度梯度P。

18、CR分析仪,BIOMETRA,GERMANY;JY600C电泳仪与JYSCZ2电泳槽,北京君意东方电泳设备有限公司;说明书CN104293832A4/11页6凝胶成像分析系统,UVP,GERMANY;微量紫外分光光度计,THERMONANODROP1000;VD850型桌上式样洁净工作台,苏州净化;HHS2数显电热恒温水浴锅,金怡;台式小型离心机5424R,EPPENDORF,GERMANY;申能博彩高精度数控摇床,上海堪鑫仪器设备有限公司;自动高压灭菌锅,SANYO,JAPAN;恒温孵育器,EPPENDORF,GERMANY;微量移液器,EPPENDORF,GERMANY。0019主要试剂及。

19、配制质粒小量提取试剂盒AXYPREPPLASMIDMINIPREPKIT购自AXYGEN公司;山羊抗兔抗体为日本中杉金桥公司产品;SANPREP柱式DNA胶回收试剂盒来自上海生工生物工程有限公司;20L阿拉伯糖购自美国SBI公司;NHEI(CODENO1622)、BAMHI(CODENO1605)、T4DNA连接酶、RTAQ酶(CODENORR902A)、DL5000、DL2000、WIDERANGEDNAMARKER15000、TRIZOL、反转录试剂、5MMLVBUFFER(LOTA801A)、10MMDNTPMIX(LOTBH2701A、RIBONUCLEASEINHIBITORLOTK。

20、6801CA,40U/L、MMLVREVERSETRANSCRIPTASELOTCK3401A,200U/L、OLIGODTLOTT401AA,14NMOL)、SOLUTIONI(CODENO6023)、10GREENBUFFER(CODENO1605)、T4DNA连接酶(CODENO2040A)、10T4DNALIGASEBUFFER(CODENO2040A)、SYBRGREENMIXLOTAK3803购自TAKARA公司;转染试剂TURBOFECT购自THERMO公司;质粒中提试剂盒购自QIAGEN公司;DMEM培养基、10胎牛血清、025胰酶为GIBCO公司产品;半乳糖苷酶报告基因检测试。

21、剂盒为碧云天生物技术研究所产品;阿霉素购自南京凯基生物科技发展有限公司;兔抗人HTERT抗体购自武汉博士德生物工程有限公司;DEPC水LOT3A600180,北京鼎国;切胶纯化试剂盒(编号SK8132),上海生工生物工程有限公司。0020LB液体培养基TRYPTONE(胰蛋白胨)10G,YEASTEXTRACT(酵母提取物)5G,NACL5G。配制方法,按照配方分别称量,加入800ML去离子水,混匀使其充分溶解,随后加入去离子水定容至1000ML,用NAOH(5MOL/L)溶液调PH值至70,高压蒸汽灭菌30MIN。0021氨苄青霉素AMPICILLIN贮存液称取1G氨苄青霉素于15ML离心管。

22、中,加入适量灭菌水,充分溶解后,定容至10ML(终浓度为100MG/ML),用022MM过滤膜进行过滤除菌,分装,20保存。使用时每1MLLB液体培养基加入1LAMP贮存液,使用终浓度为100G/ML。0022卡那霉素KANAMYCIN贮存液称取05GKANAMYCIN置于15ML离心管中,加入适量灭菌水,充分溶解后,定容至10ML(终浓度为50MG/ML),用022MM过滤膜进行过滤除菌,分装(1ML/管),20保存。使用时每1MLLB液体培养基加入1L该KANA贮存液,使用终说明书CN104293832A5/11页7浓度为50G/ML。0023IPTG(异丙基硫代D半乳糖苷)贮存液称取12。

23、GIPTG置于50ML离心管中,加入适量灭菌水,充分溶解后,定容至50ML,终浓度为24MG/ML,用022MM过滤膜进行过滤除菌,分装,20保存。0024XGAL(5溴4氢3吲哚D半乳糖苷)贮存液称取1GXGAL于50ML离心管中,加入40MLDMF(二甲基甲酰胺),充分溶解后,定容至50ML,终浓度为(20MG/ML),用022MM过滤膜进行过滤除菌,分装,置于20保存。0025AMP/LB固体培养基按照配方先配制1LLB液体培养基,然后加入15G琼脂粉AGARPOWDER,高压蒸汽灭菌30MIN。待培养基冷却至60时,加入AMPICILIN贮存液,至终浓度为100G/ML,充分混匀,铺制。

24、平板培养皿,35ML/90MM培养皿。0026KANA/LB固体培养基按照配方先配制1LLB液体培养基,然后加入15G琼脂粉AGARPOWDER,高压蒸汽灭菌30MIN。待培养基冷却至60时,加入KANAMYCIN贮存液,至终浓度为50G/ML,充分混匀,铺制平板培养皿,35ML/90MM培养皿。002750TAE电泳缓冲液PH80称取242GTRIS和372GEDTA置于1L烧杯中,加双蒸水800ML,充分溶解,加入571ML冰醋酸,充分混匀后调PH值为80,然后加入双蒸水定容至1L。00285MG/ML的MTT溶液称取50MGMTT溶解于10ML磷酸盐缓冲液中,配成5MG/ML浓度,抽滤除。

25、菌,分装避光20度保存。002910胎牛血清培养基900MLDMEM中加入已灭活的胎牛血清100ML,混匀后,调PH值为70,045UM微孔滤膜过滤除菌,4保存。0030大肠杆菌DH5A和ZYCY10P3S2TECOLI感受态细胞采用CACL2法扩增培养,具体为(1)挑取原菌种,在LB琼脂板上划线,37培养过夜1216H;(2)从活化的菌平板上挑取一个单菌落,接种于2MLLB液体培养基中,于37摇床培养过夜;次日将该菌液以1体积比例接种于50MLLB液体培养基中,37摇床23H,扩大培养;混浊后,每30MIN测一次OD600,至OD600为03左右,停止培养;(3)冰浴10MIN,转入50ML。

26、离心管中,4、4000R/MIN离心10MIN;(4)弃去上清液,用10ML冰浴的01MOL/LCACL2溶液(已高压灭菌)重悬细胞后,冰浴30MIN;然后于4、4000R/MIN离心10MIN;(5)弃去上清液,加入2ML预冷的01MOL/LCACL2(含15甘油,已高压灭菌),小心悬浮细胞;(6)置于冰浴中,以100L/管分装于小管,置于80保存。0031注以上工作在超净工作台中操作,以避免污染。0032实施例1本发明所提供的用于细胞永生化的真核重组微环表达载体MINICIRCLEMRPS18,由微环质粒与猪的MRPS18基因重组构建,其碱基序列如序列表所示。0033真核重组微环表达载体M。

27、INICIRCLEMRPS18,其制备过程如图1所示,具体为首先PCR克隆猪MRPS18基因,然后将克隆的MRPS18基因与质粒PMD19T连接,构建PMD19TMRPS18重组质粒,将构建好的PMD19TMRPS18重组质粒和微环质粒进行双酶切,说明书CN104293832A6/11页8连接,转化,挑取阳性菌落进行菌液PCR和测序鉴定,将鉴定正确的载体收集即为重组微环表达载体MINICIRCLEMRPS18。0034详细制备过程介绍如下(1)PCR克隆猪的MRPS18基因;引物的设计和合成根据MRPS18基因的核苷酸序列和表达载体克隆位点的要求,设计引物,引物由上海生工生物工程有限公司设计合。

28、成,具体序列如下F5CTAGCTAGCGCCACCATGGCTGCCTCCATATTGAACGTG3,R5CGGGATCCCTACAGAGCACTTTGCGG3。0035猪肝脏组织中总RNA的提取总RNA提取采用TRIZOL法,步骤简要介绍如下从液氮中取出保存的组织,于锡箔纸上取约100MG,放入2ML离心管中,加入1MLTRIZOL,用组织匀浆机冰浴下充分破碎45S,室温静置5MIN;加入200L氯仿,剧烈震荡3MIN,室温静置2MIN;412000RPM离心15MIN,可观察到样品分为三层,小心吸取上层水相(约400L)转移至一新15ML离心管中,加入等体积的异丙醇,上下缓慢颠倒混匀后,室。

29、温静置20MIN,沉淀RNA;412000RPM离心10MIN,弃去上清,沉淀用1ML75乙醇(DEPC水配制)洗涤,弹起沉淀;412000RPM离心10MIN,弃去上清,沉淀用1ML无水乙醇悬浮;412000RPM离心5MIN,弃去上清,倒扣于吸水纸上,自然晾干;根据沉淀的多少用适量的DEPC水20100L溶解,80保存。0036提取的总RNA反转录成CDNA反转录模版RNA1G,OLIGODT1L,加DEPC水至6L,混匀并瞬离,7010MIN后立即冰浴5MIN,加入以下反转录体系5MMLVBUFFER,2L;10MMDNTPMIX,05L;RIBONUCLEASEINHIBITOR,02。

30、5L;MMLVREVERSETRANSCRIPTASE,1L;DEPC水,025L。0037将以上配制好的产物放入PCR仪中,按以下反应程序进行3010MIN,421H,7210MIN,14PAUSE。0038反应结束后,加50L的DEPC水,将所得CDNA稀释6倍,所得的CDNA置于20保存备用。0039PCR扩增目的片段PCR体系DDH2O,85L;RTAQ酶,125L;步骤中PRIMERF(10PMOL/L),1L;步骤中PRIMERR(10PMOL/L),1L;步骤中CDNA,2L;反应条件955MIN,9530S、5630S、7270S,反应39个循环,7210MIN。说明书CN10。

31、4293832A7/11页90040PCR产物跑1的琼脂糖凝胶电泳,结果见图2,用切胶纯化试剂盒进行回收。0041(2)将步骤(1)中克隆的MRPS18基因与PMD19T质粒连接,构建PMD19TMRPS18重组质粒按照TAKARA宝生物工程有限公司PMD19T载体说明,将MRPS18基因与PMD19T载体连接。0042反应体系如下步骤(1)中PCR扩增后MRPS18基因,15L;PMD19T(50NG/UL),1L;SOLUTIONI(TAKARA,CODENO6023),5L;双蒸水,25L;连接温度16,时间12H,冰上放置5MIN。0043取连接完成后取10L液体转化入DH5感受态细胞。

32、中,均匀涂在含氨苄青霉素(100G/ML)的LB培养平板上(37、1216H)。挑取单个菌落于含氨苄青霉素的(100G/ML)LB培养液中培养(37、5H),进行菌液PCR鉴定。0044PCR鉴定体系如下DDH2O,85L;RTAQ酶,125L;步骤(1)中PRIMERF(10PMOL/L),1L;步骤(1)中PRIMERR(10PMOL/L),1L;菌液,2L。0045反应条件955MIN,9530S、5630S、7270S,反应39个循环,7210MIN。0046PCR产物跑1的琼脂糖凝胶电泳,结果见图3。0047(3)构建重组微环表达载体MINICIRCLEMRPS18分别将重组质粒PM。

33、D19TMRPS18与MINICIRCLE质粒进行双酶切,双酶切产物进行连接,鉴定,构建重组微环表达载体MINICIRCLEMRPS18。具体如下MINICIRCLE质粒和PMD19TMRPS18重组质粒分别进行双酶切酶切体系NHEI,1L;BAMHI,1L;10GREENBUFFE,2L;MINICIRCLE质粒或步骤(2)中PMD19TMRPS18100NG/L,9L;高压双蒸水,UPTO20L;酶切温度37,时间30MIN。0048酶切产物跑1的琼脂糖凝胶电泳,结果见图4和图5。用切胶纯化试剂盒进行回收酶切产物。0049酶切产物进行连接连接体系T4DNA连接酶,1L;说明书CN10429。

34、3832A8/11页1010T4DNALIGASEBUFFER,25L;步骤中双酶切MRPS18片段20NG/L,1L;步骤中双酶切MINICIRCLE质粒片段321NG/L,35L;灭菌水,12L;连接温度16,时间12H,冰上放置5MIN。0050取10L连接体系转化入DH5感受态细胞中,均匀涂在含卡那霉素(50G/ML)的LB培养平板上。挑取单个菌落于含卡那霉素(50G/ML)的LB培养液中培养,进行菌液PCR鉴定。0051PCR鉴定体系如下DDH2O,85L;RTAQ酶,125L;步骤(1)中PRIMERF(10PMOL/L),1L;步骤(1)中PRIMERR(10PMOL/L),1L。

35、;菌液,2L。0052反应条件955MIN,9530S、5630S、7270S,反应39个循环,7210MIN。PCR产物跑1的琼脂糖凝胶电泳,结果见图6。0053微环质粒MINICIRCLE质粒诱导表达效果鉴定将步骤中构建得到的MINICIRCLEMRPS18重组微环表达载体转化入ZYCY10P3S2T感受态细胞,经20L阿拉伯糖诱导后,用NHEI酶切来鉴定微环诱导的效果。0054酶切体系NHEI,1L;10GREENBUFFER,2L;PMD19TMRPS18100NG/L,9L;高压双蒸水,UPTO20L;酶切温度37,时间30MIN。0055酶切产物跑1的琼脂糖凝胶电泳,结果见图7。结。

36、果表明微环质粒MINICIRCLE质粒正确表达,所构建的MINICIRCLEMRPS18重组微环表达载体可以用来转染细胞。0056实施例2为检验实施例1所构建的真核重组微环表达载体MINICIRCLEMRPS18在细胞永生化方面的具体技术效果,发明人将MINICIRCLEMRPS18转染人子宫癌细胞HELACELL后,在细胞水平上进一步检测了该基因的表达情况及对相关的细胞永生化指标进行了检测(细胞永生化指标有实时定量PCR检测基因的表达以及MINICIRCLE中GFP的表达,荧光持续时间观察,MTT法细胞生长曲线绘制,细胞衰老标志半乳糖苷酶活性检测,免疫化学实验检测细胞中TERT的表达,端粒酶。

37、活性的检测),具体介绍如下。0057重组微环表达载体MINICIRCLEMRPS18转染HELA细胞用含10灭活胎牛血清的DMEM培养液,在5CO2、37条件下培养人子宫癌细胞HELA细胞,采用TUBOFECT试剂转染法转染;同时设置了MINICIRCLE转染的HELA细胞作为对照。0058实时荧光定量PCR检测MRPS18基因、GFP在HELA细胞中的表达为检验MRPS18基因、GFP在HELA细胞中的表达情况,发明人分别从转染说明书CN104293832A109/11页11MINICIRCLEMRPS18的HELA细胞、转染MINICIRCLE的HELA细胞、未转染的正常的HELA细胞中提。

38、取了总RNA并进行RTPCR合成CDNA,通过REALTIMEQPCR进行基因MRNA表达水平的检测。MRNA相对表达量结果用GRAPHPADPRISM5统计软件分析处理。0059如图8所示,针对MRPS18基因表达结果表明,转染MINICIRCLEMRPS18的HELA细胞与转染MINICIRCLE的HELA细胞相比,MRPS18基因表达水平显著升高。0060如图9所示,针对GFP的表达结果表明,转染MINICIRCLEMRPS18的HELA细胞与转染MINICIRCLE的HELA细胞相比,GFP的表达水平无显著差异。0061具体步骤如下分别将转染真核重组微环表达载体MINICIRCLEMR。

39、PS18的HELA细胞、MINICIRCLE的HELA细胞及正常HELA细胞培养48H后提总RNA,反转录成CDNA,将各样品的CDNA原液用DEPCH2O进行50倍稀释,将稀释后的CDNA作为反应模板,单个样品的每个基因均作3孔重复以减少试验误差,分别以MRPS18、MINICIRCLE质粒片段中的GFPQPCR为引物,以人ACTIN为内参,进行REALTIMEPCR。引物由大连宝生物工程有限公司合成。0062MRPS18QPCR引物序列上游为GGGACCTTGACTTCAGTACCACTC,下游为GCTCTCTCTCTGGTGGCTGTTT;GFPQPCR引物序列上游为CGCATGACCA。

40、ACAAGATGAAG,下游为GGTAGGTGCCGAAGTGGGATA;ACTINQPCR引物序列上游为GGGTCAGAAGGATTCCTATG,下游为GGTCTCAAACATGATCTGGG。0063荧光定量PCR检测相关基因以稀释后各样品的CDNA作为反应模板,每个样品的单个基因做3孔重复用来减少试验中的误差,每一个样品均有管家基因ACTIN作为对照。反应体系如下SYBRGREENMIX,5L;上游引物20PMOL/L,01L;下游引物20PMOL/L,01L;CDNA,125UL;DEPC水,355L。0064最佳反应程序为952MIN,9515S、6020S,40个循环,7220S。。

41、0065荧光信号的采集设置在PCR反应的延伸阶段,阈值及基线由软件自动生成。扩增程序设置后,再插入熔解曲线的反应程序,具体程序为9515S,6015S,9515S。0066MINICIRCLEMRPS18真核重组微环表达载体转染HELA细胞后荧光持续时间的观察转染前8H将处于对数生长期的HELA细胞以L105/孔的密度接种于12孔板,待细胞生长达4060融合度时,按TUBOFECT转染试剂盒说明书进行转染,设置不转质粒的HELA细胞作为阴性对照组,24H后观察各自的荧光情况,持续观察直至荧光消失。0067用荧光显微镜拍照结果如图10所示。0068从图中可以看到,转入MINICIRCLEMRPS。

42、18重组微环表达载体的细胞出现了绿色说明书CN104293832A1110/11页12荧光(图A),表明微环表达载体成功转染入细胞中,持续观察到第22D时,荧光消失(图D),表明表达效果较为持久。0069MTT法细胞生长曲线的绘制实验分为3组转染MINICIRCLE的空白对照组,转染MINICIRCLEMRPS18基因组,未转染质粒的正常的HELA细胞。转染6个小时后每孔加入MTT液5MG/ML10UL,于培养箱中培养4H后,弃上清,每孔加入150UL二甲基亚枫(SAIKEBIO,CAS67685。震荡使结晶充分溶解,在多功能酶标仪上测定吸收度A492NM。连续检测5天后,分析吸收度A492N。

43、M值,以时间为横坐标,以OD值为纵坐标作生长曲线图,如图11所示。结果表明猪MRPS18基因对HELA细胞的生长有抑制,但生长趋势正常。0070半乳糖苷酶报告基因检测半乳糖苷酶是一种常用的衰老标志物的报告基因,可以进行原位染色,在光学显微镜下就能够观察到细胞或组织中的半乳糖苷酶的表达。0071以半乳糖苷酶原位染色试剂盒(碧云天生物技术研究所,编号C0602)对了半乳糖苷酶报告基因的表达情况进行了检测鉴定。实验分为4组转染MINICIRCLE的空白对照组,转染MINICIRCLEMRPS18试验组,正常的HELA的未刺激的阴性对照组和正常的HELA刺激细胞衰老后的阳性对照组。0072半乳糖苷酶原。

44、位染色试剂盒以XGAL为底物,半乳糖苷酶能够催化其生成深蓝色产物,这样在普通显微镜下就能观察到变成蓝色的衰老的细胞。可根据细胞染色情况观察,细胞染色成蓝色说明细胞衰老,染色越深说明衰老越明显。结果如图12所示,结果显示MRPS18对细胞的衰老有抑制作用。0073免疫化学实验检测细胞中TERT的表达情况将1GMINICIRCLEMRPS18重组质粒转染入HELA细胞中作为试验组,同时设置未转染即正常的HELA细胞的阴性对照组,转染质粒MINICIRCLE的空白对照组做免疫化学实验观察TERT的表达情况。007448H后做免疫组化,观察细胞中的TERT的表达,染色越深代表细胞中的TERT表达量越高。

45、。结果显示,MRPS18能促进细胞中TERT的表达。如图13。0075具体步骤如下固定吸出培养基,PBS博士德,01M洗2次,冷丙酮(烟台市双双化工有限公司,批号265141)固定10MIN。0076吸出丙酮,加PBS清洗5MIN。玻片取出晾干。0077滴加1300(PBS稀释的兔抗人TERT抗体武汉博士德生物工程有限公司,置湿盒中,37,1H。0078取出玻片,PBS震洗3次,每次5MIN,吹干。0079滴加1100(PBS稀释的山羊抗兔抗体日本中杉金桥公司,置于湿盒中,37,1H。0080取出玻片,PBS震洗3次,每次5MIN,吹干。0081DAB中杉金桥,ZLI9017/9018/901。

46、9)显色10MIN,室温。0082自来水冲洗(终止DAB染色)。0083中性树脂中国上海标本模型厂)封片、拍照。说明书CN104293832A1211/11页130084端粒酶活性的检测将1GMINICIRCLEMRPS18重组质粒转染入HELA细胞中作为试验组,同时设置未转染即正常HELA细胞阳性对照组,转染质粒MINICIRCLE的空白对照组,培养48H后进行细胞端粒酶活性的检测,结果如图14。端粒酶试剂盒(南京凯基生物,CATNOKGA413在凝胶电泳上显示间隔6BP阶梯状分离的阳性结果,端粒酶活性的大小可由条带得深浅及多少来说明。结果表明MRPS18能增强端粒酶的活性。具体操作如下。0。

47、085转染体系质粒,1G;DMEM无血清(GIBCO公司,LOTNO1233130),100L;转染试剂,2L;将质粒和DMEM混匀后静置5MIN,加入转染试剂混匀,静置15MIN,滴加到12孔板中,边加边缓慢摇动,12H换液。说明书CN104293832A131/7页14SEQUENCELISTING河南农业大学一种用于细胞永生化的真核重组微环表达载体NONE1PATENTINVERSION3517040DNA真核重组微环表达载体MINICIRCLEMRPS181ACATTACCCTGTTATCCCTAGATGACATTACCCTGTTATCCCAGATGACATTACCCTGTT60ATC。

48、CCTAGATGACATTACCCTGTTATCCCTAGATGACATTTACCCTGTTATCCCTAGATG120ACATTACCCTGTTATCCCAGATGACATTACCCTGTTATCCCTAGATACATTACCCTGTTA180TCCCAGATGACATACCCTGTTATCCCTAGATGACATTACCCTGTTATCCCAGATGACATT240ACCCTGTTATCCCTAGATACATTACCCTGTTATCCCAGATGACATACCCTGTTATCCCTA300GATGACATTACCCTGTTATCCCAGATGACATTACCCTGTTATCCCTAGATA。

49、CATTACCCT360GTTATCCCAGATGACATACCCTGTTATCCCTAGATGACATTACCCTGTTATCCCAGATGA420CATTACCCTGTTATCCCTAGATACATTACCCTGTTATCCCAGATGACATACCCTGTTATC480CCTAGATGACATTACCCTGTTATCCCAGATGACATTACCCTGTTATCCCTAGATACATTA540CCCTGTTATCCCAGATGACATACCCTGTTATCCCTAGATGACATTACCCTGTTATCCCAG600序列表CN104293832A142/7页15ATGACATTACCCTGTTATCCCTAGATACATTACCCTGTTATCCCAGATGACATACCCTGT660TATCCCTAGATGACATTACCCTGTTATCCCAGATAAACTCAATGATGATGATGATGATGG720TCG。

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