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1、(10)申请公布号 CN 104341533 A (43)申请公布日 2015.02.11 C N 1 0 4 3 4 1 5 3 3 A (21)申请号 201410603567.8 (22)申请日 2014.10.31 C08B 37/00(2006.01) (71)申请人西南大学 地址 400700 重庆市北碚区天生路2号 (72)发明人张宇昊 马良 刘馨 (74)专利代理机构北京科亿知识产权代理事务 所(普通合伙) 11350 代理人汤东凤 (54) 发明名称 一种莼菜多糖提取方法 (57) 摘要 本发明公开了一种莼菜多糖提取方法，将冻 干莼菜粉碎，采用石油醚于50下抽提脱脂，室 温下。
2、挥干溶剂后，置于烘箱中40烘干，得到烘 干后的莼菜粉，加入NaOH溶液，于水浴振荡器上 震荡提取，然后进行离心处理，得到含有莼菜多糖 的上清液，提取出上清液，剩下莼菜粉沉淀物加入 NaOH溶液继续提取，提取次数总共四次，将每次 得到的上清液合并，得到最终含有多糖的上清液， 测定多糖得率。本发明的有益效果是莼菜原材料 利用率高，效果好，用本发明的方法提取莼菜多糖 产量高。 (51)Int.Cl. 权利要求书1页 说明书6页 附图3页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 附图3页 (10)申请公布号 CN 104341533 A CN 10434。
3、1533 A 1/1页 2 1.一种莼菜多糖提取方法，其特征在于：按照以下步骤进行： 步骤1，将冻干莼菜粉碎，过40目筛，采用石油醚于50下抽提脱脂，抽提脱脂的时间 为1.9-2.1小时，室温下挥干溶剂后，置于烘箱中40烘干，得到烘干后的莼菜粉进行下一 步骤； 步骤2，在莼菜粉中加入NaOH溶液，于水浴振荡器上震荡提取，振荡频率为175-185r/ min；提取1-5小时，提取温度30-90，然后进行离心处理，离心转速7300-7700r/min， 离心时间4-6min；得到含有莼菜多糖的上清液，提取出上清液，剩下莼菜粉沉淀物进行下 一步； 步骤3，将莼菜粉沉淀物加入NaOH溶液继续提取，选取。
4、莼菜粉沉淀物加入NaOH溶液，重 复上一步骤进行震荡提取和离心的过程，再次提取出得到的上清液； 步骤4，重复步骤3共4次，将每次得到的上清液合并，得到最终含有多糖的上清液，测 定多糖得率。 2.按照权利要求1所述一种莼菜多糖提取方法，其特征在于：所述步骤1中，石油醚沸 程为3060。 3.按照权利要求1所述一种莼菜多糖提取方法，其特征在于：所述步骤2中，在莼菜粉 中加入NaOH溶液，料液比为1:24-1:36(g/mL)；NaOH溶液浓度为0.09-0.11mol/L。 4.按照权利要求1所述一种莼菜多糖提取方法，其特征在于：所述步骤3中，莼菜粉沉 淀物与NaOH溶液料液比为1:24-1:36。
5、(g/mL)。 权 利 要 求 书CN 104341533 A 1/6页 3 一种莼菜多糖提取方法 技术领域 0001 本发明属于植物提取多糖的方法技术领域，涉及一种莼菜多糖提取方法。 背景技术 0002 莼菜为我国传统珍稀水生蔬菜，具有丰富的营养价值和药用价值，据本草纲目 记载，莼菜具有消渴热痹、治热疸、厚肠胃、安下焦、逐水、解百毒等功效。重庆石柱莼菜生长 于重庆市东南部三峡库区腹地的土家族自治县，平均海拔1500米以上，水质良好，土壤肥 沃，莼菜年产量达1000吨，是我国乃至亚洲、全世界最大的莼菜基地。研究表明，莼菜多糖 具有抗肿瘤、抗氧化、降血脂、降血糖、消炎抑菌、改善便秘和增进食欲的作。
6、用，具有较高的 保健价值。国外莼菜多糖价格昂贵，国际市场售价已达到3000美元/千克。目前关于莼菜 多糖提取方面的研究极少，采用传统方法提取产量低，利用率低。极大制约了莼菜产业的发 展。研究发现，构成莼菜多糖的主要是碱溶性的酸性多糖和少量的中性多糖，故考虑采用碱 液浸提法进行提取。本实验以石柱莼菜为研究对象，研究了影响莼菜多糖提取的主要因素， 并采用正交试验进行优化，研究实验条件下最佳提取工艺。 0003 莼菜多糖是莼菜的主要特征成分之一，主要存在于莼菜表面的胶质中，研究发现 胶质中主要由酸性多糖和中性多糖组成。莼菜多糖提取研究较少，采用的方法也比较单一。 周毅峰等对莼菜胶质的分离条件作了研究。
7、。王婧以解冻莼菜芽为原料，选择了莼菜多糖的 提取溶剂，研究了莼菜多糖的提取工艺，但尚未进行工艺优化。溶剂提取法是多糖提取方法 中较为传统的方法，也是多糖提取使用较多的一种方法，较为经济，但是花费时间较长，同 时所需的温度也较高，并且提取多糖的同时，蛋白质、色素等也会随之渗出。酶辅助提取法 也是多糖提取较为常用的方法,利用的酶专一性的性质，如采用纤维素酶，破坏植物细胞 壁，使有效成分得以溶出的方法，酶法辅助提取具有提取率高、花费时间短、环境污染小的 特点,但是需要研究酶的种类且存在成本大幅升高的问题，不好实现产业化。总体上讲传 统提取方式实现成本低的同时多糖提取率较低。 发明内容 0004 本发。
8、明的目的在提供一种莼菜多糖提取方法，解决了现有的莼菜多糖传统提取方 法提取出来的多糖产量低，莼菜产出多糖率低的问题。 0005 本发明的技术方案为按照以下步骤进行： 0006 步骤1，将冻干莼菜粉碎，过40目筛，采用石油醚于50下抽提脱脂，抽提脱脂的 时间为1.9-2.1小时，室温下挥干溶剂后，置于烘箱中40烘干，得到烘干后的莼菜粉进行 下一步骤； 0007 步骤2，在莼菜粉中加入NaOH溶液，于水浴振荡器上震荡提取，振荡频率 为175-185r/min；提取1-5小时，提取温度30-90，然后进行离心处理，离心转速 7300-7700r/min，离心时间4-6min；得到含有莼菜多糖的上清液。
9、，提取出上清液，剩下莼菜 粉沉淀物进行下一步； 说 明 书CN 104341533 A 2/6页 4 0008 步骤3，将莼菜粉沉淀物加入NaOH溶液继续提取，选取莼菜粉沉淀物加入NaOH溶 液，重复上一步骤进行震荡提取和离心的过程，再次提取出得到的上清液； 0009 步骤4，重复步骤3共4次，将每次得到的上清液合并，得到最终含有多糖的上清 液，测定多糖得率。 0010 进一步，所述步骤1中，石油醚沸程为3060。 0011 进一步，所述步骤2中，在莼菜粉中加入NaOH溶液，料液比为1:24-1:36(g/mL)； NaOH溶液浓度为0.09-0.11mol/L。 0012 进一步，所述步骤3。
10、中，莼菜粉沉淀物与NaOH溶液料液比为1:24-1:36(g/mL)。 0013 本发明的有益效果是莼菜原材料利用率高，效果好，用本发明的方法提取莼菜多 糖产量高。 附图说明 0014 图1是本发明吸光值与葡萄糖标准曲线图； 0015 图2是本发明氢氧化钠浓度对提取率的影响曲线图； 0016 图3是本发明料液比对提取率的影响曲线图； 0017 图4是本发明提取次数对提取率的影响曲线图； 0018 图5是本发明浸提温度对提取率的影响曲线图； 0019 图6是本发明提取时间对多糖提取率的影响曲线图； 0020 图7是本发明震荡频率对多塘提取率的影响曲线图。 具体实施方式 0021 下面结合附图和具。
11、体实施方式对本发明进行详细说明。 0022 本发明中莼菜多糖提取工艺流程为： 0023 步骤1，将冻干莼菜粉碎，过40目筛，采用石油醚沸程为3060，于50下抽提 脱脂，抽提脱脂的时间为1.9-2.1小时，室温下挥干溶剂后，置于烘箱中40烘干，得到烘 干后的莼菜粉进行下一步骤； 0024 步骤2，在莼菜粉中加入NaOH溶液，料液比为1:24-1:36(g/mL)；NaOH溶液浓度为 0.09-0.11mol/L，于水浴振荡器上震荡提取，振荡频率为175-185r/min；提取1-5小时，提 取温度30-90，然后进行离心处理，离心转速7300-7700r/min，离心时间4-6min；得到 含。
12、有莼菜多糖的上清液，提取出上清液，剩下莼菜粉沉淀物进行下一步； 0025 步骤3，将莼菜粉沉淀物加入NaOH溶液继续提取，选取莼菜粉沉淀物加入NaOH溶 液，莼菜粉沉淀物与NaOH溶液料液比为1:24-1:36(g/mL)，重复上一步骤进行震荡提取和 离心的过程，再次提取出得到的上清液； 0026 步骤4，重复步骤3共4次，将每次得到的上清液合并，得到最终含有多糖的上清 液，测定多糖得率。 0027 对此种方法进行分析，主要试剂有葡糖糖、硫酸、苯酚、石油醚、氢氧化钠。以上试 剂均为分析用。仪器与设备的准备，JA300B电子天平、FA2004B电子天平上海精天仪器厂； JB-260恒温水浴锅、R。
13、ES2CS-1旋转蒸发器上海亚荣生化仪器厂；SHB-循环水式多用真 空泵郑州长城科工贸有限公司；5804R台式高速离心机德国Eppendorf公司；CJ-78-1磁 说 明 书CN 104341533 A 3/6页 5 力加热搅拌上海将任实验设备有限公司；ALPAAI-4LSC真空冷冻干燥机德国Chist公司； UV-2450紫外分光光度计日本岛津公司；QL-901旋涡混合器海门市其林贝尔仪器制造有限 公司。下面是对发明方法的实验； 0028 多糖提取单因素试验： 0029 以总糖浸出率为指标评价莼菜多糖的提取效果。单因素试验基本条件设定为： NaOH溶液浓度0.1mol/L，提取温度60，料。
14、液比1:30(g/mL)，提取时间2h，提取次数2次， 振荡频率为175r/min。在改变一个条件，固定其他条件的情况下，分析NaOH溶液浓度、提 取时间、提取次数、提取温度、振荡频率、料液比对提取率的影响。各因素梯度分别为：NaOH 溶液浓度：0.01、0.05、0.1、0.15、0.2mol/L；水提时间：1、2、3、4、5h；料液比：1:10、1:30、 1:50、1:70；提取次数：1、2、3、4次；提取温度：30、50、70、90；振荡频率：60、100、140、180、 220r/min。每个单因素重复试验3次，结果取平均值。 0030 多糖提取的正交试验设计： 0031 根据单因。
15、素实验结果，选取四个主要影响因子：选取料液比、NaOH溶液浓度、提取 次数、振荡频率，采用正交表L 9 (3 4 )进行正交试验。实验因素及水平如下表1所示： 0032 表1 0033 0034 总糖含量的测定： 0035 总糖含量采用硫酸-苯酚法进行检测。多糖在浓硫酸的作用下，脱水生成糖醛及 其衍生物，与苯酚结合后产生黄色物质，该物质在490nm有最大吸光值，吸光值的大小与多 糖含量呈正比。 0036 (1)葡萄糖标准曲线的制作： 0037 称取一定量的葡萄糖于105烘干至恒重后，准确称取0.100g，纯水定容至 100mL，即得葡萄糖标准储备液。分别准确吸取0，2.0，4.0，6.0，8.。
16、0，10.0mL储备液，分 别置于100mL容量瓶以纯水定容，配制成0，20，40，60，80，100g/mL待测液。准确吸取 1.0mL待测液于试管中，依次加入1mL 6苯酚，5mL浓硫酸，混匀，室温静置30min。另取 一只试管，准确吸取1.0mL纯水，依次加入1mL6苯酚，5mL浓硫酸，混匀，室温静置30min， 作为空白对照。490nm处测吸光值，以吸光度对葡萄糖浓度进行回归，得到回归方程y 0.0101x-0.0697，R 2 0.9937。式中：y为在波长490nm处的吸光值，x为葡萄糖的浓度 (g/mL)，图1为吸光值与葡萄糖标准曲线图。 0038 以总糖浸出率来评价多糖得率，总。
17、糖含量按下式计算： 0039 总糖含量(mVN)/(Vsm10 6 )100，式中： 0040 m：标准曲线上查得的葡萄糖含量，g； 说 明 书CN 104341533 A 4/6页 6 0041 V：样液体积，mL； 0042 N：稀释倍数； 0043 Vs：测定时吸取样液的体积，mL； 0044 m：样品的质量，g。 0045 将莼菜多糖提取液定容至250mL容量瓶，准确吸取1.0mL于10mL容量瓶中，以纯 水定容。混匀后准确吸取1.0mL待测液于试管中，依次加入1mL新鲜配制的6苯酚，5mL 浓硫酸混匀，室温静置30min。另取一只试管，准确吸取1.0mL纯水，依次加入1mL6苯酚， 。
18、5ml浓硫酸，混匀，室温静置30min，作为空白对照，于490nm处测定吸光值。 0046 单因素试验结果： 0047 NaOH溶液浓度对多糖提取率的影响，提取温度为60，料液比为1:30，提取次数 2次，提取时间2h，考察不同NaOH溶液浓度对总糖浸出率的影响，由图2可知，NaOH溶液 浓度在0.01mol/L到0.1mol/L的范围内，多糖提取率随着NaOH溶液浓度的显著上升(p 0.05)，0.1mol/L时达到最大值14.65，这可能是由于在相对较低的碱浓度的情况下， 酸性多糖会随着提取液碱性的增强而更易被溶出，另外，多糖与蛋白质等物质之间可能会 以非共价键形态结合在一起，碱性条件下，。
19、蛋白质等易被溶解，从而将多糖释放出来，之后 随碱浓度增加，总糖浸出率增加显著下降(p0.05)，这有可能是加热情况下，碱浓度过高 会导致多糖降解。故选取碱浓度为0.1mol/L。 0048 液料比对多糖提取率的影响： 0049 固定提取温度为60，NaOH溶液浓度为0.1mol/L，提取次数2次，时间2h，考察不 同料液比对总糖浸出率的影响，结果如图3所示，料液比对多糖的提取率有显著影响，料液 比过低，多糖提取不完全，料液比过高导致能源的浪费。料液比从1:10上升至1:30时，总 糖浸出率显著增加(p0.05)，当料液比为1:30时，提取率达到14.46，这是由于水的比 例增加，多糖在溶剂和物。
20、料之间的浓度差增大，提高传质速率加快，多糖提取率增加；之后 总糖渗出率随料液比增大不再增加，甚至略有下降的趋势，可能是多糖已完全溶出，和外界 溶剂的浓度达到平衡状态，同时由于增大了料液比有可能使其他非糖类物质渗出，导致糖 相对含量下降。考虑到提取率和能源消耗两方面的因素，选取料液比为1:30。 0050 提取次数对多糖提取率的影响： 0051 固定提取温度为60，料液比为1:30，NaOH溶液浓度为0.1mol/L，提取时间2h， 考察不同提取次数对总糖浸出率的影响，结果如图4所示，提取1次，2次，3次，总糖浸出率 率无显著性增加(p0.05)，当提取次数为4次时，浸出率有显著增加(p0.05。
21、)，提取率 达到16.95，故选择提取次数为4次。 0052 提取温度对多糖提取率的影响： 0053 料液比为1:30，NaOH溶液浓度为0.1mol/L，提取时间2h，提取次数2次，考察不 同提取温度分别对总糖浸出率的影响，结果图5所示，随着温度升高，总糖浸出率无显著增 加(p0.05)，温度过高时略有下降，温度过高容易导致多糖的降解、色素溶出增加、多糖 活性降低，且提取温度越高，成本费用越高，故选择提取温度为30。 0054 提取时间对多糖提取率的影响： 0055 提取温度60，料液比为1:30，碱浓度为0.1mol/L，提取次数2次，考察不同提取 时间对总糖浸出率的影响，结果如图6所示，。
22、当浸提时间在3h内时，总糖浸出率随浸提时间 说 明 书CN 104341533 A 5/6页 7 的延长显著提高(p0.05)，这可能是由于随着提取的时间增加，多糖在水溶中溶解地更 为充分，当浸提时间超过3h后，总糖浸出率随提取时间增加而无显著增长(p0.05)，此时 提取率为17.88，这可能是由于多糖溶解度已基本达到饱和，故总糖浸出率无显著增加； 此外过长时间的提取也容易导致多糖的降解，因此浸提时间选定3h。 0056 振荡频率对多糖提取率的影响实验： 0057 固定提取温度60，料液比为1:30，碱浓度为0.1mol/L，提取时间2小时，提取次 数2次，考察不同振荡频率对总糖浸出率的影响。
23、，结果如图7所示，总糖浸出率随震荡频率 增加而增加，当转速上升到180r/min后，总糖浸出率显著增加(p0.05)，此时提取率为 16.13，之后随着转速的增加，总糖浸出率无显著增加(p0.05)，故选择转速为180r/ min。莼菜多糖提取正交实验结果如下表2所示： 0058 表2 0059 0060 0061 极差分析可知，在考察的4个因素中，极差大小依次为：振荡频率碱浓度提 取时间料液比，由此可见影响莼菜多糖提取的主次顺序依次为振荡频率、碱浓度、提取时 间、料液比。根据正交试验结果，莼菜多糖提取的最优组合为A 2 B 2 C 1 D 1 ，即料液比1:30(g/ mL)，NaOH溶液浓。
24、度0.1mol/L，震荡频率180r/min，提取时间2小时，提取温度30，提取4 次。在此条件下进行多糖提取，提取率为17.65。 0062 以总糖浸出率为考察指标，研究不同碱液浓度、料液比、浸提温度、浸提时间、转 速、提取次数等单因素对莼菜多糖提取率的影响，在单因素试验的基础上，选取了料液比、 碱浓度、提取次数、转速为考察因素，采用正交表L 9 (3 4 )进行正交试验，从而得出莼菜多糖 提取的最优工艺。 0063 下面列举具体实施例对本发明进行说明： 说 明 书CN 104341533 A 6/6页 8 0064 实施例1，料液比1:30(g/mL)，碱浓度0.1mol/L，震荡频率18。
25、0r/min，提取时间2 小时，提取温度30，提取4次； 0065 实施例2，考虑到能源、效率及成本等其他因素，选取莼菜多糖提取工艺为料液比 1:24(g/mL)，碱浓度0.1mol/L，震荡频率180r/min，提取时间2小时，提取温度30，提取4 次。 0066 实施例3，料液比1:25(g/mL)，碱浓度0.09mol/L，震荡频率175r/min，提取时间2 小时，提取温度30，提取4次。 0067 实施例4，料液比1:25(g/mL)，碱浓度0.11mol/L，震荡频率185r/min，提取时间2 小时，提取温度30，提取4次。 0068 以上所述仅是对本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限 制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均 属于本发明技术方案的范围内。 说 明 书CN 104341533 A 1/3页 9 图1 图2 图3 说 明 书 附 图CN 104341533 A 2/3页 10 图4 图5 图6 说 明 书 附 图CN 104341533 A 10 3/3页 11 图7 说 明 书 附 图CN 104341533 A 11 。