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1、10申请公布号CN104152432A43申请公布日20141119CN104152432A21申请号201410400607922申请日20140814C12N11/12200601B09C1/10200601C12R1/425200601C12R1/0120060171申请人滨州学院地址256603山东省滨州市滨城区黄河五路391号72发明人谢文军张衍鹏吴涛王君刘少文74专利代理机构天津市北洋有限责任专利代理事务所12201代理人陆艺54发明名称石油烃降解菌载体材料及制备方法及用途57摘要本发明公开了石油烃降解菌载体材料及用途，制备方法为1将玉米芯切成块，用水冲洗干净，在盐酸水溶液中浸泡；。
2、取出，用无菌水冲洗至中性，烘干，粉粹，过20目筛，得到玉米芯粉末；将大豆秸秆切成段，用水冲洗干净，在盐酸水溶液中浸泡；取出，用无菌水冲洗至中性，烘干，粉粹，过20目筛，得到大豆秸秆粉末；2将玉米芯粉末和大豆秸秆粉末按照质量比为21的比例混合，制得石油烃降解菌载体材料。与传统的载体材料比，本发明的石油烃降解菌载体材料能够显著降低土壤斥水力、表面张力，提高石油污染土壤持水能力和微生物活性，为降解菌解烃能力发挥创造了良好的条件，降解效率显著提高。51INTCL权利要求书1页说明书6页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页附图2页10申请公布号CN104152。
3、432ACN104152432A1/1页21石油烃降解菌载体材料的制备方法，其特征是包括如下步骤1将玉米芯切成块，用水冲洗干净，在体积浓度为1012的盐酸水溶液中浸泡1216H；取出，用无菌水冲洗至中性，烘干，粉粹，过20目筛，得到玉米芯粉末；将大豆秸秆切成段，用水冲洗干净，在体积浓度为1012的盐酸水溶液中浸泡1216H；取出，用无菌水冲洗至中性，烘干，粉粹，过20目筛，得到大豆秸秆粉末；2将玉米芯粉末和大豆秸秆粉末按照质量比为21的比例混合，制得石油烃降解菌载体材料。2权利要求1的方法制备的石油烃降解菌载体材料。3权利要求2的石油烃降解菌载体材料改良石油污染土壤性质，促进污染土壤修复的用途。
4、。4含权利要求2的石油烃降解菌载体材料的石油污染土壤修复剂，其特征是用下述方法制成1将石油烃降解菌接种到LB液体培养基中振荡培养3648H；2按照每千克05L的比例，将权利要求2的石油烃降解菌载体材料与步骤1获得的液体混和，室温发酵3654H，晾至含水量为252，即得。5根据权利要求4所述含权利要求2的石油烃降解菌载体材料的石油污染土壤修复剂，其特征是所述石油烃降解菌为罗尔斯通氏菌XB菌株CGMCCNO3389、红球菌JH菌株CGMCCNO3388、或沙雷氏菌BF40菌株CGMCCNO5236。权利要求书CN104152432A1/6页3石油烃降解菌载体材料及制备方法及用途技术领域0001本发。
5、明属于污染土壤修复领域，具体涉及一种石油烃降解菌载体材料及制备方法及用途。背景技术0002土壤石油污染是我国石油产区的一重要环境问题。土壤被石油污染后，生产力降低，石油中的有害组分还能够进入到水体、大气，甚至农产品中，严重影响环境质量和危害人体健康。各国专家一直在石油污染土壤修复技术领域进行研发、攻关工作，但由于石油组分复杂，一旦其污染环境后，修复难度较大。生物修复是石油污染土壤治理的一非常有潜力的途径，其主要包括植物修复、微生物修复以及微生物植物联合修复。微生物修复由于效率高，不产生二次污染，是国内外研究关注的热点。0003进行微生物修复，在筛选得到高效降解菌后，还应具备性能优良的载体材料，。
6、当前应用较多的是粉碎的作物秸秆和无机材料，进行载体材料的选择时，一、载体材料要有吸附微生物的性能；二、能支撑微生物正常生长繁殖，不能对微生物产生毒害作用；三、能为微生物降解功能的发挥创造条件。当前，人们对前两个条件关注较多，能为微生物降解能力发挥创造条件的载体材料报道较少。发明内容0004本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种石油烃降解菌载体材料的制备方法。0005本发明的第二个目的是提供一种能提高降解菌降解效率的石油烃降解菌载体材料。0006本发明的第三个目的是提供石油烃降解菌载体材料改良石油污染土壤性质，促进污染土壤修复的用途。0007本发明的第四个目的是提供含石油烃降解菌载体材料的石。
7、油污染土壤修复剂。0008本发明的技术方案概述如下0009石油烃降解菌载体材料的制备方法，包括如下步骤00101将玉米芯切成块，用水冲洗干净，在体积浓度为1012的盐酸水溶液中浸泡1216H；取出，用无菌水冲洗至中性，烘干，粉粹，过20目筛，得到玉米芯粉末；将大豆秸秆切成段，用水冲洗干净，在体积浓度为1012的盐酸水溶液中浸泡1216H；取出，用无菌水冲洗至中性，烘干，粉粹，过20目筛，得到大豆秸秆粉末；00112将玉米芯粉末和大豆秸秆粉末按照质量比为21的比例混合，制得石油烃降解菌载体材料。0012上述方法制备的石油烃降解菌载体材料。0013石油烃降解菌载体材料改良石油污染土壤性质，促进污染。
8、土壤修复的用途。0014含石油烃降解菌载体材料的石油污染土壤修复剂，是用下述方法制成说明书CN104152432A2/6页400151将石油烃降解菌接种到LB液体培养基中振荡培养3648H；00162按照每千克05L的比例，将权利要求2的石油烃降解菌载体材料与步骤1获得的液体混和，室温发酵3654H，晾至含水量为252，即得。0017石油烃降解菌选自罗尔斯通氏菌XB菌株CGMCCNO3389、红球菌JH菌株CGMCCNO3388、或沙雷氏菌BF40菌株CGMCCNO5236。0018本发明的优点0019与传统的载体材料粉碎的小麦秸秆、玉米秸秆、大豆秸秆进行对比，发现本发明的石油烃降解菌载体材料。
9、能够显著降低土壤斥水力、表面张力，提高石油污染土壤持水能力和微生物活性，为降解菌解烃能力发挥创造了良好的条件，降解效率显著提高。附图说明0020图1为不同材料处理石油污染土壤斥水性。0021图2为不同材料中降解菌数量。0022图3为不同处理土壤中石油降解率。具体实施方式0023下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。本发明的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不对本发明作任何限制，特别是石油烃降解菌并不限于本发明实施例所列的细菌，能够对石油烃产生降解作用的其它细菌也属于本发明的保护范围。0024实施例10025石油烃降解菌载体材料的制备方法，包括如下步骤00261将玉米芯。
10、切成1CM3左右的块，用水冲洗干净，在体积浓度为11的盐酸水溶液中浸泡14H；取出，用无菌水冲洗至中性左右，烘干，粉粹，过20目筛，得到玉米芯粉末；将大豆秸秆切成15CM的段，用水冲洗干净，在体积浓度为11的盐酸水溶液中浸泡14H；取出，用无菌水冲洗至中性左右，烘干，粉粹，过20目筛，得到大豆秸秆粉末；00272将玉米芯粉末和大豆秸秆粉末按照质量比为21的比例混合，制得石油烃降解菌载体材料。0028实施例20029石油烃降解菌载体材料的制备方法，包括如下步骤00301将玉米芯切成15CM3左右的块，用水冲洗干净，在体积浓度为12的盐酸水溶液中浸泡12H；取出，用无菌水冲洗至中性，烘干，粉粹，过。
11、20目筛，得到玉米芯粉末；将大豆秸秆切成20CM的段，用水冲洗干净，在体积浓度为12的盐酸水溶液中浸泡12H；取出，用无菌水冲洗至中性，烘干，粉粹，过20目筛，得到大豆秸秆粉末；00312将玉米芯粉末和大豆秸秆粉末按照质量比为21的比例混合，制得石油烃降解菌载体材料。0032实施例30033石油烃降解菌载体材料的制备方法，包括如下步骤00341将玉米芯切成2CM3左右的块，用水冲洗干净，在体积浓度为10的盐酸水溶液说明书CN104152432A3/6页5中浸泡16H；取出，用无菌水冲洗至中性，烘干，粉粹，过20目筛，得到玉米芯粉末；将大豆秸秆切成10CM的段，用水冲洗干净，在体积浓度为10的盐。
12、酸水溶液中浸泡16H；取出，用无菌水冲洗至中性，烘干；粉粹，过20目筛，得到大豆秸秆粉末；00352将玉米芯粉末和大豆秸秆粉末按照质量比为21的比例混合，制得石油烃降解菌载体材料。0036实施例40037石油烃降解菌载体材料改良石油污染土壤性质的用途0038土壤斥水性是指水分不能或很难湿润土壤颗粒表面的现象，土壤被石油污染后，由于石油的疏水性导致土壤斥水性大大提高，直接影响了石油降解菌的活性和降解能力。0039实验分组0040小麦秸秆组干燥粉碎的小麦秸秆；0041玉米秸秆组干燥粉碎的玉米秸秆；0042大豆秸秆组干燥粉碎的的大豆秸秆；0043石油烃降解菌载体材料组简称载体材料组实施例1制备的石油。
13、烃降解菌载体材料；0044空白对照组不加入任何材料。0045实验过程0046分别将载体材料组、小麦秸秆组、玉米秸秆组、大豆秸秆组，每组都按照质量为1、3、5的量加入到石油质量含量为15的土壤中，混匀，以未加入任何材料的相同污染土壤作为空白对照。分别将处理后的土壤装入直径5CM，高为15CM的玻璃管中，轻压使土壤容重为12G/CM3，并使土壤含水量为16，室温放置2D。采用滴水穿透时间法测定不同处理土壤的斥水力，具体方法为用标准滴管在15MM高度滴3滴蒸馏水约015ML于土柱中央，用秒表记录液滴从土壤表面消失的时间，结果见图1。0047实验证明，向石油质量含量为15的土壤中加入本发明的实施例1制。
14、备的载体材料，石油污染土壤斥水力大幅降低，并随着加入量的增加，降低幅度增大，当加入质量为5时，处理土壤斥水力与空白对照组相比下降了837。而小麦秸秆、玉米秸秆、大豆秸秆降低土壤斥水力的能力较差，当加入质量为5时，处理土壤斥水力与空白对照相比分别下降了279、357、333，土壤斥水性与土壤含水量及持水能力有关，降低土壤斥水力，提高了污染土壤持水、保水能力，为解烃菌降解石油创造了有利条件。0048经实验，实施例2和实施例3制备的石油烃降解菌载体材料，在石油质量含量为15的土壤中加入质量为5时处理土壤斥水力与空白对照组相比下降了827和816。0049实施例50050石油烃降解菌载体材料降低土壤表。
15、面张力实验0051实施例1制备简称载体材料1组，实施例2制备简称载体材料2组，实施例3制备简称载体材料3组0052空白对照组。0053向三份石油质量含量为15的土壤中，分别加入实施例1、2、3制备的石油烃降解菌载体材料使质量含量为5，混匀，土壤含水量保持在16，室温放置30D，以未加入说明书CN104152432A4/6页6任何材料的相同污染土壤作为空白对照，重复三次。每10D，取样，按照水土比251制成水土混合液，测定表面张力，结果见表1。与对照相比，加入载体材料后，土壤表面张力明显降低，降幅为10左右，达到了极显著水平P001。污染土壤表面张力降低后，石油污染物的生物可利用性会显著提高，降。
16、解速度加快。0054表1不同处理土壤表面张力00550056实施例60057含石油烃降解菌载体材料的石油污染土壤修复剂，是用下述方法制成00581将石油烃降解菌沙雷氏菌BF40菌株CGMCCNO5236接种到LB液体培养基中振荡培养36H；00592按照每千克05L的比例，将实施例1制备的石油烃降解菌载体材料与步骤1获得的液体混和，室温发酵48H，在无菌条件下，晾至含水量为27，即得。0060实施例70061含石油烃降解菌载体材料的石油污染土壤修复剂，是用下述方法制成00621将石油烃降解菌罗尔斯通氏菌XB菌株CGMCCNO3389接种到LB液体培养基中振荡培养42H；00632按照每千克05。
17、L的比例，将实施例2制备的石油烃降解菌载体材料与步骤1获得的液体混和，室温发酵36H，晾至含水量为25，即得。0064实施例80065含石油烃降解菌载体材料的石油污染土壤修复剂，是用下述方法制成00661将石油烃降解菌红球菌JH菌株CGMCCNO3388接种到LB液体培养基中振荡培养48H；00672按照每千克05L的比例，将实施例3制备的石油烃降解菌载体材料与步骤1获得的液体混和，室温发酵54H，晾至含水量为23，即得。0068实施例90069含石油烃降解菌载体材料的石油污染土壤修复剂保持降解菌活性的能力0070将含石油烃降解菌载体材料的石油污染土壤修复剂实施例6制备自然放置30D，不做补水。
18、等处理，每5D取样一次，采用平板计数的方法重复三次测定降解菌BF40数量。0071灭菌粉碎的玉米、小麦秸秆、大豆秸秆采用相同方法进行处理，作为对照。结果见图2。0072自然放置中，前10D，四者间差异不大，10D后，载体材料表现出了保持降解菌活性的较强能力，降解菌BF40的数量较玉米、小麦、大豆秸秆大大提高，随着放置时间延长，这说明书CN104152432A5/6页7种差异愈明显，30D，载体材料中BF40数量分别为小麦秸秆、玉米秸秆、大豆秸秆的44、38、23倍。0073实施例7制备的含石油烃降解菌载体材料的石油污染土壤修复剂采用本实施例的方法进行测定，30D，载体材料中罗尔斯通氏菌XB菌株。
19、CGMCCNO3389数量分别为小麦秸秆、玉米秸秆、大豆秸秆的40、29、21倍。0074实施例8制备的含石油烃降解菌载体材料的石油污染土壤修复剂采用本实施例的方法进行测定，30D，载体材料中红球菌JH菌株CGMCCNO3388数量分别为小麦秸秆、玉米秸秆、大豆秸秆的46、32、27倍。0075实施例100076载体材料促进石油烃降解菌在石油污染土壤中的降解能力0077取5ML对数生长期降解菌保藏号为CGMCCNO5236的沙雷氏菌BF40SERRATIASP菌液，加入到100G石油质量含量为15的土壤中，混匀为对照组；分别取5MLBF40菌液，加入到1G、2G、3G、5G载体材料实施例1制备。
20、中，混匀后，再加入100G石油质量含量为15的土壤中，混匀。将不同处理土壤置于150ML三角瓶中，使土壤含水量为16，PARALM膜封口，每处理重复三次，室温培养60D后，取样分析不同处理石油降解差异。土壤中石油含量采用重量法进行测定，结果见图3。0078与对照组相比，本发明的载体材料实施例1显著提高了土壤中石油降解速率P005，加入25载体材料，土壤中石油降解率提高了15以上。其原因在于载体材料为微生物生存提供了养分及有利的环境，减少了土壤中污染物对其产生的危害，同时，载体材料还会和土壤组份及解烃菌互作，改善土壤性质，提高污染物生物可利用性。载体材料用量宜为污染土壤质量的23。0079在质量。
21、含量为15的石油污染土壤中，分别加入3实施例2和实施例3制得的载体材料，依照本实施例方法培养60D，较对照组石油降解率分别提高了16208、15706。0080实施例110081载体材料在石油污染土壤微生物修复中的应用0082在一石油污染农田中，05CM表层土壤石油含量为16，将沙雷氏菌BF40菌株CGMCCNO5236、罗尔斯通氏菌XB菌株CGMCCNO3389、红球菌JH菌株CGMCCNO3388分别接种至LB液体培养基中，振荡培养36H、42H、48H，按照150ML/M2用量，将培养液加入到污染土壤中，浅翻混匀，每一菌株修复面积为100M2。同时，在同一污染地块中，按照300G/M2将。
22、BF40修复剂实施例6、XB修复剂实施例7、JH修复剂实施例8施入石油污染农田中，浅翻混匀，每种修复剂修复面积为120M2。10D采样一次，共计修复60D，定期测定土壤中石油降解率，比较不同处理污染土壤修复效果。结果见表2。0083表2不同时间不同处理田间土壤石油降解率0084说明书CN104152432A6/6页80085利用载体材料进行石油污染土壤的微生物修复，操作方便。修复结果表明，前20天，石油污染土壤修复剂较对应单一降解菌株处理，修复效率提高了451620，整个60D修复期，石油污染土壤修复剂较对应单一降解菌株处理，修复效率提高了160197，效果非常显著。利用载体材料进行污染土壤微生物修复是一种简便、高效的方法。说明书CN104152432A1/2页9图1图2说明书附图CN104152432A2/2页10图3说明书附图CN104152432A10。