牛凝血酶的提取分离方法 本发明涉及生物工程技术领域，尤其为牛凝血酶的提取分离方法。
凝血酶是良好的局部止血药，其疗效已被国内外临床医师所认可。目前，国内商品凝血酶都是猪凝血酶，尚无作为药用的牛凝血酶。在国外，英、美等国药典虽早有牛凝血酶的记载，但工艺全过程未见系统发表。
本发明的目的在于提供一种在常温下，操作简便，成本低，比活力高，适用于工业化生产的牛凝血酶的提取分离方法，弥补国内在这方面的不足以及便于与国外同类制品的接轨。
本发明所公开的牛凝血酶的提取分离方法是把过量的枸椽酸钠加入牛血液中，在常规离心分离出的抗凝牛血浆中加入BaCl2溶液，用帆布过滤出沉淀物，经压干、硫酸铵洗脱、盐析，CM-Sephadex C-50柱层析分离制得牛凝血酶。
提取分离方法如下：
在牛血液中加0.1mol/L～0.17mol/L枸椽酸钠溶液，枸椽酸钠溶液与牛血液的体积比为1∶3～1∶5使之成为抗凝的牛血液。常规分离出抗凝牛血浆，加入0.5mol/L～2mol/L的BaCl2溶液，BaCl2溶液与抗凝牛血浆的体积比为1∶6～1∶25，BaCl2与抗凝牛血浆中枸椽酸钠生成枸椽酸钡进而选择性吸附牛凝血酶原，形成枸椽酸钡与凝血酶原沉淀。帆布过滤出沉淀物，压干，先用40％～45％饱和度的硫酸铵溶液洗脱沉淀中的凝血酶原，再补加硫酸铵使洗脱液中硫酸铵达65％～70％饱和度，盐析出凝血酶原，经透析去除硫酸铵后，用兔脑粉浸液和CaCl2溶液激活凝血酶原使之转化为具有凝血活性的凝血酶。激活后的牛凝血酶用CM-Sephadex C-50柱层析进一步分离纯化，得纯化的牛凝血酶，收率为28.9u～119.8u/毫升血浆，比活力为1000u/mg～2000u/mg蛋白。
本发明所提供地牛凝血酶的提取分离方法，避免了在低温状态下使用有机溶剂和高速连续离心分离，使操作简便，投资小，成本低，适用于工业生产。
实施例1.
采集牛血液20000ml，加0.1mol/L的枸椽酸钠溶液4000ml，常规离心分离。取离心上层抗凝牛血浆10000ml，加入0.5mol/LBaCl2溶液1600ml，搅拌15分钟，静置15分钟，帆布过滤沉淀物压干后加1000ml40％饱和度的硫酸铵溶液，搅拌15分钟，静置6小时，常规离心分离，取上层液加固体硫酸铵168g，搅拌使之溶解，静置10小时，离心分离，得沉淀物，用20ml蒸馏水溶解后装入透析袋，水透析10小时，用纳氏试剂检测内液不含硫酸铵，终止透析。在37℃下加入0.25mol/L CaCl2溶液3ml和兔脑粉浸液2ml，保持37℃激活1.5小时。
激活后的牛凝血酶经CM-SephadexC-50柱层析；用0.05mol/L醋酸钠缓冲液(含0.1mol/L NaCl pH5.0)洗脱至流出液测OD280值小于0.2后再用0.05mol/L醋酸钠缓冲液(含0.6mol/L NaCl pH5.0＋0.1)洗脱牛凝血酶。收集凝血酶峰层析液，得纯化后的牛凝血酶，收率30u/ml血浆，比活力2000u/mg蛋白。
实施例2.
原料与试剂：牛血液100000ml、0.13mol/L枸椽酸钠溶液25000ml，取抗凝牛血浆50000ml、1mol/L BaCl2溶液4000ml，40％饱和度的硫酸铵溶液5000ml，硫酸铵粉末840g，蒸馏水100ml，0.25mol/L CaCl2溶液15ml，兔脑粉浸液10ml。
提取分离步骤与操作方法同实施例1.收率109u/ml血浆，比活力1800u/mg蛋白。
实施例3.
原料与试剂：牛血液200000ml，0.17mol/L枸椽酸钠溶液66000ml，取抗凝牛血浆100000ml，2mol/L BaCl2溶液4000ml，45％饱和度的硫酸铵溶液10000ml，硫酸铵粉末2100g，蒸馏水200ml，0.25mol/L CaCl2溶液30ml，兔脑粉浸液20ml。
提取分离步骤与操作方法同实施例1.收率110u/ml血浆，比活力1600u/mg蛋白。