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1、(10)申请公布号 CN 102812903 A (43)申请公布日 2012.12.12 C N 1 0 2 8 1 2 9 0 3 A *CN102812903A* (21)申请号 201210237049.X (22)申请日 2012.07.10 A01H 4/00(2006.01) (71)申请人浙江省农业科学院 地址 310021 浙江省杭州市石桥路198号 (72)发明人王燕 徐刚 陈剑平 汪一婷 吕永平 牟豪杰 陈志 (74)专利代理机构杭州九洲专利事务所有限公 司 33101 代理人陈继亮 (54) 发明名称 一种通过茎尖细胞层重排对嵌合体彩叶植物 进行种质创新的方法 (57)。
2、 摘要 本发明提供了一种通过茎尖细胞层重排对嵌 合体彩叶植物进行种质创新的方法。本发明选取 具有嵌合性状的母本嵌合体植物的顶芽或腋芽为 外植体，对其进行表面消毒和冲洗后接种于初代 培养基上进行培养，建立母本嵌合体的腋芽或丛 生芽快繁体系。然后利用母本嵌合体的茎段或叶 片等组织进行不定芽的诱导，使产生不同于母本 嵌合体茎尖细胞层排布结构和性状的新类型嵌合 芽。筛选性状优良且稳定的新型嵌合体株系进行 生根诱导及炼苗，成活后移至田间再次进行筛选， 从而获得彩叶嵌合体新品种。本发明有益的效果： 本发明方法可操作性强，简单实用，育种周期短， 可以广泛应用于嵌合体彩叶植物的新品种选育。 (51)Int.C。
3、l. 权利要求书2页 说明书4页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 4 页 1/2页 2 1.一种通过茎尖细胞层重排对嵌合体彩叶植物进行种质创新的方法，其特征在于包括 如下步骤： （1）选取具有嵌合性状的嵌合体植株材料的顶芽或带有腋芽的茎段作为外植体，对外 植体进行表面消毒处理后在超净工作台上用无菌蒸馏水冲洗35遍； （2）将冲洗后的外植体于灭菌滤纸上吸去水分后接种到初代培养基上进行培养，培养 温度为252C、光照强度为080molm -2 s -1 、光照时间为812小时/天； （3）将获得的无菌母本嵌合体幼苗于增殖培养基上以腋芽或丛生芽。
4、方式进行扩繁； （4）切取母本嵌合体的茎段或叶片组织接种于诱导培养基上进行不定芽的诱导，使母 本嵌合体茎尖细胞层结构重新排布，进而产生不同于母本性状的新类型嵌合芽； （5）待新类型的嵌合芽转接到增殖培养基上进行腋芽或丛生芽方式扩繁，并观察其性 状的稳定性； （6）筛选出稳定的新嵌合体类型株系，并将其小植株转移至生根培养基上进行生根培 养； （7）将生根后的幼苗从培养基中取出，洗掉根部的培养基并将幼苗移栽至装有基质的 营养钵中，炼苗后将幼苗移栽至田间，待植株成活后进一步观察植株性状的稳定性，筛选获 得新类型的嵌合体品种。 2.根据权利要求1所述的通过茎尖细胞层重排对嵌合体彩叶植物进行种质创新的方。
5、 法，其特征在于：所述的通过茎尖细胞层重排进行种质创新的植物材料为嵌合体，是周缘嵌 合体、扇形嵌合体或混合嵌合体类型。 3.根据权利要求1所述的通过茎尖细胞层重排对嵌合体彩叶植物进行种质创新的方 法，其特征在于：在所述步骤（2）（3）（4）（5）中，所述的初代培养基、增殖培养基及诱导培 养基都是以MS为基本培养基，分别添加30g/L蔗糖、0.7%琼脂粉、0.15mg/L细胞分裂素和 0.050.5mg/L生长素，pH=5.8。 4.根据权利要求3所述的通过茎尖细胞层重排对嵌合体彩叶植物进行种质创新的方 法，其特征在于：对红网纹草进行茎尖细胞层重排所使用的初代培养基配方为：MS+3%蔗糖 +0.。
6、7%琼脂+0.2mg/L6-BA+0.05mg/LNAA；增殖培养基为：MS+3%蔗糖+0.7%琼脂+0.5mg/ L6-BA+0.1mg/LNAA；诱导培养基为：MS+3%蔗糖+0.7%琼脂+3.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA。 5.根据权利要求3所述的通过茎尖细胞层重排对嵌合体彩叶植物进行种质创新的 方法，其特征在于：对卧牛锦进行茎尖细胞层重排所使用的初代培养基配方为：MS+3%蔗 糖+0.7%琼脂+4.0mg/L6-BA+0.1mg/LIBA；增殖培养基为：MS+3%蔗糖+0.7%琼脂+1.0mg/ L6-BA+0.1mg/LNAA；诱导培养基为：MS+3%蔗糖+0.7%琼脂+。
7、0.5mg/L6-BA+0.1mg/LNAA。 6.根据权利要求1所述的茎尖细胞层重排对嵌合体彩叶植物进行种质创新的方法，其 特征在于：在所述步骤（4）中，所述的母本嵌合体茎尖细胞层结构的重排，是通过诱导其茎 段或叶片等组织产生嵌合不定芽而实现的。 7.根据权利要求1所述的通过茎尖细胞层重排对嵌合体彩叶植物进行种质创新的方 法，其特征在于：在所述步骤（5）（6）（7）中，所述新类型嵌合体品种的获得需经过对瓶内 培养及田间种植的植株进行植物性状观察并从中选择嵌合性状能稳定保持且能存活的嵌 合体株系。 8.根据权利要求1所述的茎尖细胞层重排对嵌合体彩叶植物进行种质创新的方法， 权 利 要 求 书C。
8、N 102812903 A 2/2页 3 其特征在于：在所述步骤（6）中，所述生根培养基的配方为1/2MS+3%蔗糖+0.8%琼脂 +0.050.5mg/L生长素。 9.根据权利要求1所述的通过茎尖细胞层重排对嵌合体彩叶植物进行种质创新的方 法，其特征在于：在所述步骤（7）中，所述基质为蛭石和珍珠岩，蛭石和珍珠岩的体积比为 2:1。 10.根据权利要求1所述的通过茎尖细胞层重排对嵌合体彩叶植物进行种质创新的方 法，其特征在于：在步骤（7）中进行炼苗时，先在幼苗上覆盖薄膜并遮荫，在炼苗612天 后逐渐揭开薄膜使幼苗适应外界环境。 权 利 要 求 书CN 102812903 A 1/4页 4 一种。
9、通过茎尖细胞层重排对嵌合体彩叶植物进行种质创新 的方法 技术领域 0001 本发明涉及茎尖细胞层的离体重排技术领域，尤其是一种通过茎尖细胞层重排对 嵌合体彩叶植物进行种质创新的方法。 背景技术 0002 彩叶植物是指叶片呈现除绿叶以外的各种颜色或包括绿色的多种颜色的植物。由 于彩叶植物具有色彩绚丽，观赏期长，易养护等特点，已成为园林绿化的新宠，市场需求大。 其中，嵌合体彩叶植物是彩叶植物是一个重要的类型群体（嵌合体植物即其顶端分生组织 包含两种或两种以上遗传型细胞并由这些细胞层共同形成器官并最终发育而成的完整植 株），例如常见的金心吊兰、“法兰西”玉簪、双色美人蕉等都属于嵌合体彩叶植物，观赏价。
10、值 极高。 0003 然而，现有的大多数嵌合体彩叶植物都是在自然条件下自发产生的，人为合成技 术的难度较大；此外，我国嵌合体彩叶观赏植物品种绝大多数是由国外引进的，自主创新的 广度和深度都非常有限。众所周知，优良品种是生产优质花卉植物和产业提升的关键。因 此，有效利用现有的嵌合体彩叶植物资源进行种质创新工作，对于增强我国花卉业国际竞 争力、快速拉近与国际育种水平的差距具有重要的意义。 0004 由于大多数被子植物的雌雄配子均来源于其茎尖分生组织的L2层，常规的有性 杂交育种会造成嵌合体彩叶植物独特性状的分离，极大地限制了嵌合体彩叶植物育种的发 展（参见Opportunities for syn。
11、thetic plant chimeral breeding:Past and future. Burge GK,Morgan ER,Seelye JF.Plant Cell Tiss Organ Cult,第70卷第1期,13-21 页,2002年)。因此，目前急需一套针对嵌合体植物的种质改良与创新方法，而茎尖细胞层 的离体重排技术能够从现有的嵌合体植物中筛选出有价值的嵌合体新类型。但在此之前还 没有关于通过茎尖细胞层重排对嵌合体彩叶植物进行种质创新的技术方法，更没有成功的 实例。 发明内容 0005 本发明的目的正是要解决上述技术存在的不足，而提供一种通过茎尖细胞层重排 对嵌合体彩叶植物进。
12、行种质创新的方法。 0006 本发明解决其技术问题采用的技术方案：这种通过茎尖细胞层重排对嵌合体彩叶 植物进行种质创新的方法，包括如下步骤： 0007 （1）选取具有嵌合性状的嵌合体植株材料的顶芽或带有腋芽的茎段作为外植体， 对外植体进行表面消毒处理后在超净工作台上用无菌蒸馏水冲洗35遍； 0008 （2）将冲洗后的外植体于灭菌滤纸上吸去水分后接种到初代培养基上进行培养， 培养温度为252C、光照强度为080molm -2 s -1 、光照时间为812小时/天； 0009 （3）将获得的无菌母本嵌合体幼苗于增殖培养基上以腋芽或丛生芽方式进行扩 说 明 书CN 102812903 A 2/4页 。
13、5 繁； 0010 （4）切取母本嵌合体的茎段或叶片组织接种于诱导培养基上进行不定芽的诱导， 使母本嵌合体茎尖细胞层结构重新排布，进而产生不同于母本性状的新类型嵌合芽； 0011 （5）待新类型的嵌合芽转接到增殖培养基上进行腋芽或丛生芽方式扩繁，并观察 其性状的稳定性； 0012 （6）筛选出稳定的新嵌合体类型株系，并将其小植株转移至生根培养基上进行生 根培养； 0013 （7）将生根后的幼苗从培养基中取出，洗掉根部的培养基并将幼苗移栽至装有基 质的营养钵中，经炼苗后将幼苗移栽至田间，待植株成活后进一步观察植株性状的稳定性， 筛选获得新类型的嵌合体品种。 0014 作为优选，所述的通过茎尖细胞。
14、层重排进行种质创新的植物材料为嵌合体，是周 缘嵌合体、扇形嵌合体或混合嵌合体类型。 0015 作为优选，在所述步骤（2）（3）（4）（5）中，所述的初代培养基、增殖培养基及诱 导培养基都是以MS为基本培养基，分别添加30g/L蔗糖、0.7%琼脂粉、0.15mg/L细胞分裂 素和0.050.5mg/L生长素，pH=5.8。 0016 作为优选，对红网纹草进行茎尖细胞层重排所使用的初代培养基配方为：MS+3% 蔗糖+0.7%琼脂+0.2mg/L6-BA+0.05mg/LNAA；增殖培养基为：MS+3%蔗糖+0.7%琼脂 +0.5mg/L6-BA+0.1mg/LNAA；诱导培养基为：MS+3%蔗糖+。
15、0.7%琼脂+3.0mg/L6-BA+0.2mg/L NAA。 0017 作为优选，对卧牛锦进行茎尖细胞层重排所使用的初代培养基配方为：MS+3%蔗 糖+0.7%琼脂+4.0mg/L6-BA+0.1mg/LIBA；增殖培养基为：MS+3%蔗糖+0.7%琼脂+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/LNAA；诱导培养基为：MS+3%蔗糖+0.7%琼脂+0.5mg/L6-BA+0.1mg/L NAA。 0018 作为优选，在所述步骤（4）中，所述的母本嵌合体茎尖细胞层结构的重排，是通过 诱导其茎段或叶片等组织产生嵌合不定芽而实现的。 0019 作为优选，在所述步骤（5）（6）（7）中，所述新类型嵌合。
16、体品种的获得需经过对瓶 内培养及田间种植的植株进行植物性状观察并从中选择嵌合性状能稳定保持且能存活的 嵌合体株系。 0020 作为优选，在所述步骤（6）中，所述生根培养基的配方为1/2MS+3%蔗糖+0.8%琼 脂+0.050.5mg/L生长素。 0021 作为优选，在所述步骤（7）中，所述基质为蛭石和珍珠岩，蛭石和珍珠岩的体积比 为2:1。 0022 作为优选，在步骤（7）中进行炼苗时，先在幼苗上覆盖薄膜并遮荫，在炼苗612 天后逐渐揭开薄膜使幼苗适应外界环境。 0023 本发明有益的效果是：本发明采用茎尖细胞层的离体重排对嵌合体彩叶植物进行 种质创新，克服了传统的育种方式的束缚；且不受季节。
17、气候等环境因素的影响，可周年进 行；育种周期短，获得稳定新类型嵌合体后可直接进行无性快繁后应用。该方法可操作性 强，简单实用，育种效率高，可以广泛应用于嵌合体彩叶植物的新品种选育，对于彩叶观赏 植物种质资源的利用和创新具有重要的意义。 说 明 书CN 102812903 A 3/4页 6 具体实施方式 0024 下面结合实施例对本发明作进一步说明： 0025 实施例1： 0026 材料：本实例以周缘嵌合体植物红网纹草（Fittonia verschaffeltii）为材料。 0027 步骤（1）：取材及消毒 0028 选取网纹草的茎段作为外植体材料，是为了保持母本嵌合体的观赏特性。将外植 体先。
18、用自来水冲洗，然后用75%的酒精消毒30秒，再用有效氯含量为1%的次氯酸钠溶液浸 泡7分钟，其间摇动几次以彻底消毒，最后在超净工作台上用无菌蒸馏水冲洗4遍。 0029 步骤（2）：接种 0030 将冲洗后的材料于灭菌滤纸上吸去水分后接种到初代培养基上进行培养，配方 为MS+3%蔗糖+0.7%琼脂+0.2mg/L6-BA+0.05mg/L NAA，pH=5.8。培养条件为252 C， 40mol m -2 s -1 ，光照时间为16小时/天。 0031 步骤（3）：增殖 0032 将获得的无菌母本网纹草转移至增殖培养基上以丛生芽方式进行扩繁，目的是 保持母本性状的前提下将群体扩大。增殖培养基配方。
19、为：MS+3%蔗糖+0.7%琼脂+0.5mg/ L6-BA+0.1mg/LNAA，pH=5.8。培养条件为252 C，40molm -2 s -1 ，光照时间为16小时/ 天。 0033 步骤（4）：茎尖细胞层结构的重排 0034 将母本网纹草的叶片和茎段分别切成0.5cm左右见方的小块和0.2cm左右的 小段后接种于诱导培养基上进行不定芽的诱导，使产生不同于母本网纹草茎尖细胞层排 布结构和性状的新类型嵌合芽。诱导培养基的配方为：MS+3%蔗糖+0.7%琼脂+3.0mg/ L6-BA+0.2mg/L NAA，pH=5.8。培养条件为252C，40mol m -2 s -1 ，光照时间为16小时。
20、/ 天。 0035 步骤（5）：嵌合芽的筛选 0036 将新类型的网纹草嵌合芽转移到增殖培养基上进行增殖，观察各类型嵌合性状的 稳定性，进而筛选出稳定的新嵌合体类型株系4个。增殖培养基配方为：MS+3%蔗糖+0.7% 琼脂+0.5mg/L6-BA+0.2mg/LNAA，pH=5.8。培养条件为252C，40mol m -2 s -1 ，光照时间 为16小时/天。 0037 步骤（6）：生根 0038 将筛选出的新类型网纹草嵌合体转移至生根培养基上进行生根培养基，配方 为1/2MS+3%蔗糖+0.7%琼脂+0.1mg/L-萘乙酸（NAA）。培养条件：温度为252 C， 80molm -2 s -。
21、1 光照下培养，光照时间为12小时/天。 0039 步骤（7）：幼苗的移栽及新品种的获得 0040 当幼苗生根后将其从培养瓶中取出，轻轻冲洗掉根部的培养基，然后移栽至营养 钵中（营养钵中的基质为蛭石和珍珠岩，v/v=2:1），为防止幼苗失水萎蔫，提高移栽成活率， 可在幼苗上方覆盖薄膜并适当遮荫以保持湿度，2天后开始逐渐揭开薄膜使幼苗适应外界 环境。大约炼苗10天后移至田间，从而获得1个能够在田间条件下存活的网纹草嵌合体新 品种。 0041 实施例2： 说 明 书CN 102812903 A 4/4页 7 0042 材料：本实例以卧牛锦（Gasteriea armstrongii f.varie。
22、gata）为材料。 0043 步骤（1）：取材及消毒 0044 选取同时具有黄色和绿色的卧牛锦花葶作为外植体材料，原因同实施例1。将花 序上未开放的花蕾切下，先用自来水冲洗，然后用75%的酒精消毒45秒，再用有效氯含量为 1%的次氯酸钠溶液浸泡6分钟，其间摇动几次以彻底消毒，最后在超净工作台上用无菌蒸 馏水冲洗4遍。 0045 步骤（2）：接种 0046 将冲洗后的材料于灭菌滤纸上吸去水分后接种到初代培养基上进行培养，配方 为MS+3%蔗糖+0.7%琼脂+4.0mg/L6-BA+0.1mg/LIBA（吲哚丁酸），pH=5.8。培养条件为 252C，暗培养。 0047 步骤（3）：增殖及茎尖细胞。
23、层结构的重排 0048 待愈伤组织形成后将材料转移到光照条件下继续培养，随后将转绿分化的愈伤组 织转移至诱导培养基上进行不定芽的诱导，使产生不同茎尖细胞层排布结构和性状类型 的卧牛锦嵌合芽，从而完成茎尖细胞层排布结构的重排。诱导培养基配方为：MS+3%蔗糖 +0.7%琼脂+0.5mg/L6-BA+0.1mg/LNAA，pH=5.8。培养条件为252C，40mol m -2 s- 1 ，光 照时间为16小时/天。 0049 步骤（4）：嵌合芽的筛选 0050 将新类型的卧牛锦嵌合芽转移到增殖培养基上进行增殖，观察各类型嵌合性状的 稳定性，进而筛选出稳定的新嵌合体类型株系。增殖培养基配方为：MS+。
24、3%蔗糖+0.7%琼脂 +1.0mg/L6-BA+0.1mg/L NAA，pH=5.8。培养条件为252C，40mol m -2 s -1 ，光照时间为 16小时/天。 0051 步骤（5）：生根 0052 将筛选出的新类型卧牛锦嵌合体转移至生根培养基上进行生根培养基，配方 为1/2MS+3%蔗糖+0.7%琼脂+0.1mg/L-萘乙酸（NAA）。培养条件：温度为252 C， 80molm -2 s -1 光照下培养，光照时间为12小时/天。 0053 步骤（6）：幼苗的移栽及新品种的获得 0054 当幼苗生根后将其从培养瓶中取出，轻轻冲洗掉根部的培养基，于阴凉通风处放 置35天后移栽至营养钵中（基质为蛭石和珍珠岩，v/v=2:1），从而获得本发明的新类型的 嵌合体卧牛锦植株，移栽成活率可达100%。 0055 最后需要说明的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于 以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导 出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。 说 明 书CN 102812903 A 。