不溶于水的交联聚碳酸组合物 【发明背景】
【发明领域】
本发明涉及用沉淀法从水介质中除去蛋白质。
现有技术
传统方法是使用试剂或通过加热从水介质中除去蛋白质的。某些溶剂(氯仿，尿素)使蛋白质变性并使其沉淀。类似地，通过加入盐将介质中电解质的量提高到较高的程度也能沉淀蛋白质。此外，加热不仅使蛋白质变性而且还通常使蛋白质凝结，从而将其从水介质中分离出来。
这些去除蛋白质的方法主要有三个缺点。首先，从介质中除去的物质不是纯的蛋白质。而当介质中含有复杂的化学类混合物，如当介质是细胞溶胞产物时，用这些方法除了去除蛋白质外还会去除其他物质。第二，用这些方法去除的蛋白质一般都是不可逆变性或只在诸如渗析地耗时操作中才具有可变性。第三，无论是蛋白质的分离或是纯化，传统方法都包括使用有毒溶剂(苯酚和/或氯仿)。
US.P.4421653中描述的聚合物材料试图解决这些问题。该材料是与二胺交联的聚乙烯马来酸酐衍生物，但是，为了将一体积的血清脱蛋白需要多达9体积的溶液。这种“脱蛋白剂”的大幅度过量使用表明其效率低下、过于昂贵、不适于工业生产。此外，此基料在碱范围内(即pH10)沉淀蛋白质，使所要的蛋白质在温和碱条件下非常难以从基料中解析出来。
发明概述
本发明提供了一组不溶于水的交联多羟基聚羧酸组合物，它通过式(I)聚合物
其中R是氢或1-4个碳原子的低级亚烷基或低级烷氧基，或苯基，
q是7-10000的整数，
与式(II)的α，Ω二氨基羟基烷烃交联：
H2N.[(H)p(CH)z.(OH)m].NH2 (11)
其中z是1-4的整数，
p是0或最大为z-1的整数，
m是1或最大为z的整数，
并水解未反应的酸酐基团而获得，其中，二氨基羟基烷的初始量与聚(亚烷基马来酸酐)的初始量的比例介于约1∶1和约200∶1mol/mol之间。
这些交联的多羟基聚羧酸组合物有至少两个链节，每个链节的链节构型如下式
其中每个链节中的至少一个链节内马来酰部分的一个羰基基团与式(IV)部分共价相连，
-HN.[(H)p(CH)z.(OH)m].NH-部分 (IV)
使其中存在有至少一个式(V)的链节内交联部分：
其中R是氢或1-4个碳原子的低级亚烷基或低级烷氧基，或苯基，
z是1-4的整数，
p是0或最大为z-1的整数，
m是1或最大为z的整数，
其中交联与聚(亚烷基碳酸)链节的比例介于约1∶2和约200∶2之间。
在式I聚合物与式II羟基二胺的反应产物中还存在有相应的、假定为式VI的“聚马来酯”：
其中y是最大为m的整数，其他的值如上所述。
本文公开的制备交联多羟基聚羧酸组合物的方法是，使式I的聚合物与式II的α、Ω二氨基羟基烷交联，并且用酸水解未反应的酸酐基团，得到式V和Ⅵ化合物的混合物。
用强碱作温和的处理，在室温下适当地稀释碱水几个小时，优选至少过夜，这样可以很容易地将该式(VI)的聚马来酯水解回原来的多元醇(V)。混合物的碱水解作用产生基本上纯的式V。
这两种交联多羟基聚羧酸组合物都提供了从含蛋白的水介质中沉淀蛋白质的方法，该方法包括向其中添加有效量的这种交联多羟基聚羧酸组合物，得到蛋白质/多羟基聚羧酸组合物基料。但是式V的化合物基本上比含有相应酯的混合物更有效。最好是，多羟基聚羧酸组合物的使用量(以重量计)至少等于含蛋白水介质中蛋白质的预计含量。此外，优选在水介质中使用多羟基聚羧酸组合物。已经发现在这个沉淀步骤中蛋白质和多羟基聚羧酸组合物在它们各自水介质中的重量浓度介于约3∶1至约1∶3之间时很有利，当蛋白质和交联多羟基聚羧酸组合物在它们各自水介质中的重量浓度基本相等时最合适。
实际的沉淀操作多少依赖于pH值，但依赖的范围相当广。当R是氢时，含有交联多羟基聚羧酸组合物介质的pH值优选介于约3至约6.2之间，这样组分混合后得到的介质的pH值不超过约6.5。同样，当R是苯基时，含有交联多羟基聚羧酸组合物介质的pH值优选介于约5.5至约7.5，以使组分混合后得到的介质的pH值不超过约7.5。
发生沉淀反应后最好将反应混合物离心，以从中回收粒状的基料。
通过用pH值为约8.6-约9.5的缓冲液处理所述的基料，可以将蛋白质从基料中分离出来而不使所述的蛋白质变性。对每体积粒状基料来说，缓冲液的适宜使用量为约1-约5体积，pH值约8.6-约9.5。虽然本发明并不限于此，但当缓冲液是三羟甲基氨基甲烷缓冲液时已获得优异的效果。
这个方法还特别实用于从含有蛋白和核酸的液体中分离核酸。这时，核酸或其混合物的来源经常是一种悬浮在硫氰酸弧盐水溶液中的细胞溶胞产物。
另一种从待回收的基料中回收交联多羟基聚羧酸组合物的方法是可以通过十二烷基硫酸钠水溶液处理基料，然后最好将反应混合物离心，并且从剩余的颗粒中或者以剩余颗粒的形式回收交联多羟基聚羧酸组合物。
在这个方法中，蛋白质发生变性，对每体积基料剩余颗粒使用约1-约3体积浓度约0.5-约2％w/w的十二烷基硫酸钠。此后，最好包括进一步的洗涤步骤，洗涤已回收的多羟基聚羧酸残渣并将其再悬浮于缓冲液中，当R＝苯基，适宜使用pH值为7.1-7.5的磷酸缓冲盐水。或者，当R＝H时，使用pH值为4-4.5的乙酸缓冲液。
优选实施方案的说明
交联多羟基聚羧酸组合物
本发明包括由式I聚合物和式IIα、Ω二氨基羟基烷交联所得物质的组合物
H2N.[(H)p(CH)z.(OH)m].NH2 (II)
式I括号中所示的原子符号代表聚合物的重复单元，q代表与二氨基羟基烷交联之前聚合物中该单元的数目。q代表的单元数可以在7到10000之间变化。
R是氢或1-4碳原子的低级亚烷基或低级烷氧基，或苯基。
式I中符号R优选为氢。这时，其中q为120-约250的聚合物可以从美国密苏里州圣路易斯的Monsanto Chemical Co.得到。其名称为乙烯马来酸酐共聚物(EMA)。R为甲氧基的式I聚合物也是优选的。这时，其中q为约100-约600的聚合物可以名为Gantrez An从新泽西州韦恩的GAF Corp.化学部得到。另外R为次甲基、乙烯基、甲氧基或乙氧基的式I聚合物也是优选的。
在式II中，z是1-4的整数，p是0或最大为z-1的整数，m是1或最大为z的整数。应当理解，式II中每一个(CH)基团要么有一个要么没有羟基基团与其相连。交联链上的整个交联部分至少具有一个羟基，并且可以最多达到每个(CH)基团上有一个羟基，即在两个酰胺基团之间最多有z个羟基。
诸如式II的α、Ω二氨基羟基烷是可商购的，如1，3-二氨基-2-羟基-丙烷(威斯康星州密尔沃基市的Aldrich Chemical Co.)。
任何存留在不溶于水的交联多羟基聚羧酸中的酸酐基团均被水解。
在不溶于水的交联多羟基聚羧酸组合物中，二氨基羟基烷初始投料量与聚(亚烷基马来酸酐)初始投料量的比介于约1∶1和约200∶1 mol/mol之间。
在另一个实施方案中，不溶于水的交联多羟基聚羧酸有至少两个链节，每个链节的构型如式III：
其中，在每个链节中，至少一个马来酰部分的一个羰基基团共价联接至式IV的α、Ω二氨基羟基烷基上：
-HN.[(H)p(CH)z.(OH)m].NH-部分 (IV)
这使得其中存在有至少一个式V的交联部分：
符号R、p、z和m的值分别与上述式I和II中的相同。式V中对聚(亚烷基碳酸)链节的交联率介于约1∶2至约200∶2之间(从1∶2至200∶2)。制备交联多羟基聚羧酸组合物的方法
在本发明的另一个实施方案中，制备不溶于水的交联多羟基聚羧酸组合物的方法包括使式I的聚合物与式II的α、Ω二氨基羟基烷交联，并且水解未反应的酸酐基团。向反应容器中加入一体积符合式I的聚(亚烷基马来酸酐)。反应容器中再加入一体积符合式II的α、Ω二氨基羟基烷。二氨基羟基烷初始投料量与聚(亚烷基马来酸酐)初始投料量的比为约1∶1至约200∶1mol/mol。
一般将式I聚合物与α、Ω二氨基羟基烷在水中或有机溶剂如丙酮中混合1-5小时，然后反应混合物在室温中放置0-24小时。该反应可以在室温或升高的温度下常压进行。通过交联反应二氨基羟基烷把式I聚合物中的酸酐基团转化为羧基和酰胺基团。同时，很大程度上取决于所用的反应条件，交联羟基二酰胺基链中的一些羟基与酸酐进一步反应酯化形成相应的“聚马来酯”(VI)。在这个反应进行当中的某些时候或之后，未反应的酸酐基团在水介质(如添加酸溶液以降低pH)中水解，转化成羧基。当含有酯化部分(VI)的混合物用于去除蛋白质时，最好通过在碱水溶液中消化水解这些酯部分，优选用稀碱，如0.05-0.5N的氢氧化钠溶液，适宜在室温下进行约12-约36小时，制得纯的多羟基化合物(V)。
反应完毕，可将水相加到混合物中，按常规方法如真空蒸发法将有机相除去，并在室温下干燥残留物，得到不溶于水的交联多羟基聚羧酸。用不溶于水的交联多羟基聚羧酸组合物除去蛋白质的方法
本发明的另一个实施方案是从含蛋白的水介质中沉淀蛋白质的方法，该方法包括向水介质中加入有效量的交联多羟基聚羧酸组合物，得到一个蛋白质/多羟基聚羧酸组合物基料。
水介质可以是稀释的或未经稀释的、含有需要除去的蛋白质的生物流体，包括例如全血、血浆、血清、淋巴、胆汁、尿液、体液、脊髓液唾液、汗等液体，以及粪便排泄物。还可以使用人或其他动物组织如骨骼肌、心脏、肾、肺、脑的液体制剂，包括细胞培养提取物或乳或微生物培养液或植物提取液。优选的生物流体是人的血液和细菌细胞溶胞产物。
不溶于水的交联多羟基聚羧酸组合物可以被添加到乳液、悬浮液、溶液或干粉形式的含蛋白水介质中。
添加到生物流体中的交联多羟基聚羧酸组合物比例可根据所需要的脱蛋白程度而定。但要根据蛋白质浓度、所需纯化物质的性质和浓度、温度、pH值和离子浓度等每种情况来优选决定最佳的比例。原则上温度和pH值并不关键。但是温度一般在0℃和100℃之间，优选4℃左右，但不超过60℃，因为高于这一温度蛋白质基本发生不可逆的变性。
注意到交联多羟基聚羧酸组合物沉淀蛋白质的效率在较高的温度下有所提高。换句话说，从同一试样溶液中除去90％蛋白质，在60℃下比在30℃下所需要的交联多羟基聚羧酸组合物要少。
在加入了不溶于水的交联多羟基聚羧酸后，含蛋白的水介质其pH值不超过约7.5，或优选约6.5。
蛋白质和多羟基聚羧酸在它们各自水介质中的重量浓度的比优选约3∶1-约1∶3。
交联多羟基聚羧酸组合物的使用量(以重量计)通常至少等于含蛋白水介质中预计的蛋白质的量。
在被加到含蛋白水介质中之前，不溶于水的交联多羟基聚羧酸组合物是悬浮于自己的水介质中，且R是H时，含有多羟基聚羧酸组合物的介质的pH值为约3-约5，这样可使介质的pH值在组分混合之后不超过约6.5。
或者，当R是苯基时，含交联多羟基聚羧酸组合物的介质的pH值为约5.5-约7.5，可使介质的pH值在组分混合之后不超过约7.5。
水介质的脱蛋白程度决定于交联多羟基聚羧酸组合物试剂中反应基团的个数。反应基团的个数对本发明的实施并不关键，只要有足够的量存在以保证足够数量的结合。
一般将交联多羟基聚羧酸组合物试剂加到生物流体中，并有一定时间(一般为5-15分钟)的充分接触(如，通过搅拌或倒置然后静置)。除去所得的不溶水相，该相中含有结合有蛋白质的交联多羟基聚羧酸组合物和蛋白质的基料。这一除去过程可以用任何传统的相分离方法(如，离心、过滤或沉降)完成。除去不溶水相可制得脱蛋白的上清液。
当通过离心来除去不溶水相时，离心可以在约5-100000g′s下进行0.2-10小时或设定在单位重力下进行。用超离心速度有利于该过程，因为所得的颗粒被紧紧包住，从而在倒出上层清液时不会有微滴流失。
本发明去除蛋白质的方法还可以用来提取这样的物质，它们能被交联多羟基聚羧酸组合物沉淀，或同时经过适当处理如使用特定缓冲溶液或其他诸如表面活性剂的提取试剂而沉淀。这种物质的去除可以是出于制造或分析的目的。如果用缓冲溶液从基料中分离蛋白质，需要搅拌、研磨并/搅拌所述基料与pH值为约8.6-约9.5的缓冲溶液10-60分钟。每体积基料粒使用约1-约5体积pH值为约8.6-约9.5的缓冲溶液。适宜的缓冲液可以是三羟甲基氨基甲烷缓冲液。当用表面活性提取剂处理基料时(优选十二烷基硫酸钠)，每体积基料残粒可以使用约1-约3体积约0.5-约2w/w浓度的十二烷基硫酸钠。
当进行上述步骤并从沉淀的基料中回收不溶于水的交联多羟基聚羧酸组合物时，可以洗涤多羟基聚羧酸组合物并将其再悬浮于pH值为7.1-7.5的磷酸缓冲溶液中。故沉淀蛋白质方法的又一个实施方案是多进行一步洗涤所述已回收的交联多羟基聚羧酸组合物，并将其再悬浮于pH值优选为7.1-7.5的磷酸缓冲液中。
当蛋白质和核酸或其混合物一起存在于水介质中时，沉淀蛋白质的方法特别有用。经常的情况是核酸或其混合物的来源是悬浮于硫氰酸胍盐水溶液的细胞溶胞产物。
可对脱蛋白后的上清液(脱蛋白之后剩下的脱蛋白流体)进行任何方式的再加工。出于制造目的(例如，提纯肽、糖蛋白、淄类化合物、酯质、核酸、酶、激素、维生素、病毒、多糖或生物碱)例如可以进行进一步的提纯步骤。具体地说，其中较适宜的是色谱法(如离子交换色谱、交联葡聚糖凝胶色谱、亲合色谱或吸附色谱)，过滤(如超滤)，电泳(如块状电泳、圆盘电泳或无载体电泳)，等电点聚焦和选择沉淀法。
申请人希望将其对本发明的理解，即通过交联多羟基聚羧酸组合物从水介质中除去蛋白的原理做一说明，但并不由此限制本发明的范围。在水介质中，沉淀性是溶解度的一个函数。溶解度本身又至少部分是蛋白疏水程度的函数。所有蛋白质中至少有一些是表面暴露于水介质中的疏水部分。申请人相信他的交联多羟基聚羧酸组合物令不同蛋白质分子的疏水部分彼此接近并聚集至一定的程度，使蛋白质最终沉淀下来。(看来这已被下面情况所证实，即在较高的温度下交联多羟基聚羧酸组合物从溶液中去除蛋白的效率较高。相反，如果蛋白沉淀是由其他的现象引起的，例如缔合/离解，可看到随着温度的升高蛋白的沉淀减少)。
在这可能发生之前，交联多羟基聚羧酸组合物和一个或多个蛋白质分子通过非共价作用如电荷吸引相结合。(交联多羟基聚羧酸组合物有数个负电荷，可以与在全部蛋白质分子的某些点，如在精氨酸残基上存在的部分正电荷相互作用)。受表面疏水基团影响的水的局部秩序在热力上不良。当这些非极性的疏水基团互相作用并聚集时，束缚水会被释放出来。这样，当两个或两个以上和挠性交联多羟基聚羧酸组合物发生作用的蛋白质像一串珠子的时候，此后可以包含这个不同蛋白珠非极性部分的组合物串便会聚集起来。当聚集蛋白质分子的数目或大小足够大时，蛋白质-组合物的复合物就沉淀下来。
下面的实施例旨在解释本发明，而不是对本发明作任何限定。
实施例1制备不溶于水的沉淀剂(部分酯化物质(VI)和脱酯物质(V)的混合物)
100克(0.063摩尔)得自AtochemInc.，Malverm，PA的苯乙烯马来酸酐共聚物(SAMResin 1000A)溶于1L丙酮中。以5.0ml/min的速度向此溶液中添加另一含有17.5g(0.194摩尔)1，3-二氨基-2羟基丙烷(Aldrich Chemical Company，Milwaukee，Wisconsin)的1L丙酮溶液并持续搅拌3.5小时。
然后，反应混合物在室温下放置12小时。反应完全后，边搅拌边加入3L水，然后令聚合物在单位重力下沉降。滗析除去有机水相。交联的聚合物悬浮于1L H2O中并用Gifford Wood均质机研磨1分钟(介质沉降)。添加盐酸将悬浮液的pH值调至1.5。1小时后，用氢氧化钠将pH调至9.0，搅拌混合物30分钟。调节pH至7.0并排除上层清液。然后用0.01M pH7.2磷酸缓冲液洗涤聚合物并最终将其悬浮于此缓中液中得到5.0％w/v悬浮液。这样得到多羟基物质(V)和聚马来酯物质(VI)的混合物。
除了将苯乙烯马来酸酐聚合物分别替换为乙烯马来酸酐聚合物(例如，得自Monsanto Chemical Co.，St.Louis，Mo的“EMA-21”)、α-甲基-乙烯马来酸酐聚合物、或α-甲氧基-乙烯马来酸酐聚合物，按照上述步骤可以制备R＝H、1-4个碳原子低级亚烷基或低级烷氧基的多羟基聚羧酸组合物。
除了用二氨基羟基乙烷，如1，2-二氨基-1-羟基乙烷来代替1，3-二氨基-2-羟基丙烷，按上述步骤可以形成交联部分碳原子数为2的多羟基聚羧酸组合物。除了用1，2-二氨基-1，2-二羟基乙烷代替1，3二氨基-2-羟基丙烷，按上述步骤可以形成交联部分有多个羟基基团的多羟基聚羧酸组合物。
根据上述步骤可以形成交联部分的3个碳原子连有多个羟基基团的多羟基聚羧酸组合物，除了用1，3-二氨基-二-或1，3-二氨基-三-羟基丙烷，如1，3-二氨基-1，2-二羟基丙烷或1，3-二氨基-1，2，3-二羟基丙烷来代替1，3-二氨基-2-羟基丙烷。
根据上述步骤可以形成交联部分有4个碳原子的多羟基聚羧酸组合物，除了用α、Ω二氨基-羟基-正丁烷，如1，4-二氨基-3-羟基丁烷或1，4-二氨基-1-羟基丁烷代替1，3二氨基-2-羟基丙烷。根据上述步骤可以形成交联部分有不止一个羟基的多羟基聚羧酸组合物，除了α、Ω二氨基-羟基-正丁烷被替换成1，4-二氨基-二-1，4-二氨基-三-或1，4-二氨基-四-羟基丁烷，如1，4-二氨基-2，3-二羟基丁烷或1，4-二氨基-1-2-二羟基丁烷；1，4-二氨基-1，2，3-三羟基丁烷；和1，4-二氨基-1，2，3，4-四羟基丁烷。
实施例2水不溶性沉淀剂的脱脂作用(部分酯化物质(VI)和脱酯物质(V))
以5.0％重量/体积悬浮于缓冲液中的由实施例1制备的多羟基多羰基混合组合物在3000xg下离心10分钟，去掉悬浮缓冲液。然后将颗粒分散在去离子水中得到5.0％w/v悬浮液。边搅拌边将等体积的0.2N氢氧化钠水溶液缓慢加入聚合物悬浮液中。该碱性混合物在室温下静置24小时。重复离心并用去离子水洗涤从而去除游离的碱(在上层清液中)。然后用0.01M pH7.2的磷酸缓冲液平衡该聚合物得到5.0％w/v的聚合物悬浮液。由此得到不含聚马来酯物质(VI)的多羟基物质(V)。
根据上述步骤可以纯化与多羟基物质(V)混合的聚马来酯物质(VI)。这可由以下来源的物质进行。
可以根据上述步骤制备多羟基聚羧酸组合物，其中R＝H、1-4个碳原子低级亚烷基或低级烷氧基，除了苯乙烯马来酸酐聚合物被替换成乙烯马来酸酐聚合物(例如，“EMA-21”，得自Monsanto Chemical Co.，St.Louis，MO)α-甲基-乙烯马来酸酐聚合物、或α-甲氧基-乙烯马来酸酐聚合物。
根据上述步骤可以制备交联部分有一个碳原子的多羟基聚羧酸组合物，除了用二氨基羟基甲烷代替1，3-二氨基-2-羟基丙烷。
根据上述步骤可以制备交联部分有两个碳原子的多羟基聚羧酸组合物，除了1，3-二氨基-2-羟基丙烷被替换成二氨基羟基乙烷，如，1，2-二氨基-1-羟基乙烷。根据上述步骤可以制备交联部分有多个羟基基团的多羟基聚羧酸组合物，除了用1，2-二氨基-1，2-二羟基乙烷代替1，3-二氨基-2-羟基丙烷。
根据上述步骤可以制备交联部分三个碳原子连有多个羟基基团的多羟基聚羧酸组合物，除了将1，3-二氨基-2-羟基丙烷替换成1，3-二氨基-二-或1，3-二氨基-三-羟基丙烷，如1，3-二氨基-1，2-二羟基-丙烷或1，3-二氨基-1，2，3-二羟基丙烷。
根据上述步骤可以制备交联部分有4个碳原子的多羟基聚羧酸组合物，除了将1，3-二氨基-2-羟基丙烷替换成α、Ω-二氨基-一-羟基-正丁烷，如1，4-二氨基-3-羟基丁烷或1，4-二氨基-1-羟基丁烷。用上述步骤可以制备交联部分有不止一个羟基基团的多羟基聚羧酸组合物，除了将α、Ω-二氨基-一-羟基-正丁烷替换成1，4-二氨基-二，1，4-二氨基-三-或1，4-二氨基-四-羟基丁烷，如，1，4-二氨基-2，3-二羟基丁烷或1，4-二氨基-1-2-二羟基丁烷；1，4-二氨基-1，2，3-三羟基丁烷；和1，4-二氨基-1，2，3，4-四羟基丁烷。
实施例3
评定根据实施例1制备的多羟基聚羧酸组合物(V和VI)沉淀下面表1列出各种物质的能力。表1列出的全部物质(从人血清白蛋白到质粒DNA)均是从Sigma Chemical Company，St.Louis，Missouri得到的，呈粉末或颗粒状。
将人血清白蛋白(HSA)溶解于0.01M磷酸钠缓冲的0.9％盐水中，其pH为7.3-7.5，浓度为33mg/ml。(类似地将余下的从人γ球蛋白到质粒DNA化合物溶解在相同的磷酸缓冲的盐水中，浓度按表1所列的浓度。每种蛋白质的等电点(p1)以及碳水化合物的量(％Carb.)列于表1)。
再用磷酸钠缓冲的盐水将实施例1制备的多羟基聚羧酸组合物制成5％重量/体积溶液。
一体积的交联多羟基聚羧酸组合物溶液(“脱蛋白剂”)与1、2或4体积的试样溶液混合。每种混合溶液经倒置混合后在室温下静置5-15分钟。然后以2000xG离心每种溶液10分钟以便去除蛋白质-多羟基聚羧酸组合物基料。用紫外线吸收(280nm)或比色测定法(用得自PierceCompany，Rockville，IL的“BCA蛋白分析试剂”)测定每种剩余上清液中蛋白质除去率。表1列出了全部以3种体积混合的每种试样的蛋白质除去百分数(“％除去”)。
通过交联多羟基聚羧酸组合物，蛋白质人血清白蛋白、人γ球蛋白、血红蛋白、转铁蛋白和细胞色素C全都给除去了90％或更多。这些蛋白质结合的碳水化合物都很少。相反，A1酸糖蛋白，辣根过氧化物和胎球蛋白都分别具有大量的碳水化合物，因此“除去蛋白百分数”很低。最后，观察表1中的两个DNA试样，完全用交联多羟基聚羧酸组合物沉淀非蛋白物质非常困难。
表1
反应化合物
脱蛋白剂(VI)体积/试样体积
(％除去蛋白)
试样浓度 p1 ％碳水化合物 1/1 1/2 1/4
(mg/ml)人血清白蛋白 33 4.9 ＞99 99 90人γ球蛋白 25 5-7 2-3 ＞99 95 91血红蛋白 10 6.8 ＞99 99转铁蛋白 1 5.9 6 95 92细胞色素C 2 10.6 ＞99 99
未反应化合物a1酸糖蛋白 1 2.7 41 60 2辣根过氧化物 1 8.8 22 23 2胎球蛋白 1 3.5 22 55 1腓肠胸腺DNA A260＝2.0 ＜1 ＜1 ＜1质粒DNA A260＝0.5 ＜1 ＜1 ＜1
注：这些数值是用各自独立的体系得到的。对于多物质的体系，基于竞争的环境选择性将会提高。
实施例4
用根据实施例2制备的部分酯化聚合物(VI)和脱脂聚合物(V)的2.5％wt/vol浓度悬浮液重复实施例3的试验。
表2
反应化合物
脱蛋白剂体积/试样体积
(％除去蛋白)
部分酯化的(VI)+(V)只有脱脂的(V)
试样 浓度 1/1 1/2 1/4 1/1 1/2 1/4
(mg/ml) 人血清白蛋白 33 ＞99 85 60 ＞99 ＞99 96 人γ球蛋白 25 ＞95 88 50 ＞99 95 90 血红蛋白 10 ＞99 99 82 ＞99 ＞99 ＞99 转铁蛋白 1 95 92 58 ＞99 98 90 细胞色素C 2 ＞99 ＞99 90 ＞99 ＞99 ＞99
未反应化合物 A1酸糖蛋白 1 60 2 0.5 65 4 1 辣根过氧化物 1 20 2 0.5 24 2 1 胎球蛋白 1 45 1 0.5 51 1 1 腓肠胸腺DNA A260＝2.0 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 质粒DNA A260＝0.5 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1
实施例5
根据实施例3分别制备两份人血清白蛋白和人γ球蛋白溶液(即浓度分别为33和25mg/ml，在0.01M磷酸钠缓冲的0.9％盐水溶液中，pH7.3-7.5)。再按实施例1制备多羟基聚羧酸组合物的5％重量/体积溶液。
第一组人血清白蛋白和人γ球蛋白溶液保持在室温下(接近20℃)，第二组溶液加热到并保持在60℃。然后向四个蛋白质溶液中加入交联多羟基聚羧酸组合物溶液，“脱蛋白剂”体积与蛋白试样体积的比为1/4。
按实施例2那样测定蛋白质的去除效率，列于表3。
表3
试样 ％除去蛋白
人血清白蛋白-20℃ 90
人血清白蛋白-60℃ 大于99
人γ球蛋白-20℃ 91
人γ球蛋白-60℃ 99
实施例6
用实施例2制备的脱脂试剂(V)重复上述实施例5的试验，聚合物浓度为2.5％wt/vol。聚合物与试样的比为1/5。结果列于下表4。
表4
试样 ％除去蛋白
人血清白蛋白-20℃ 80
人血清白蛋白-30℃ 90
人血清白蛋白-60℃ 大于99
人γ球蛋白-20℃ 82
人γ球蛋白-30℃ 94
人γ球蛋白-60℃ 大于99