发酵生产维生素B6 本发明涉及发酵生产维生素B6的方法。本申请中所用的“维生素B6”包括吡哆醇，吡哆醛和吡哆胺。
维生素B6是动物，植物和微生物营养所必需的。并用在医药和食品中。本发明的目的是提供高效的维生素B6发酵生产方法。
对维生素B6的生产已经有很多研究，而且已知糖酵母，毕赤氏酵母，克雷白氏杆菌，无色杆菌，芽孢杆菌和黄杆菌均产生维生素B6。但是还从未报道用属于根瘤菌属的微生物积累大量的维生素B6。
本发明使其以高产率生产维生素B6成为可能。已经发现属于根瘤菌属的微生物能够在培养液中积累大量的维生素B6，从该培养液中可以以令人满意的纯度回收维生素B6。
因此，本发明涉及生产维生素B6的方法，包括培养属于根瘤菌属并能够在有氧条件下在培养基中生产维生素B6的微生物，然后从发酵液中分离所得的维生素B6。
可以用卡尔斯伯糖酵母ATCC9080[The analysis of Nutrients inFoods，academic Press，London，224-227(1978)]检测发酵液中维生素B6的含量，而且还可以用高效液相色谱分别测量发酵液中维生素B6组分，如吡哆醇，吡哆醛和吡哆胺的含量[Vitain，63,349-369(1989)]。
为了完成本发明，在含有微生物生长所必需的可吸收碳源，可消化氮源，无机盐和其他营养成分地培养基中培养根瘤菌属的微生物。可以使用的碳源有，如葡萄糖，果糖，乳糖，半乳糖，蔗糖，麦芽糖，淀粉，糊精或甘油。可使用的氮源有如胨，大豆粉，玉米浆，肉提取物，硫酸铵，硝酸铵，脲或其混合物。此外可以使用的无机盐有，钙，镁，锌，锰，钴或铁的硫酸盐，盐酸盐或磷酸盐。而且如果需要，还可以补充常规营养因子或抗泡剂如动物油，植物油或矿物油。适宜的培养基pH为约5.0-约9.0，优选的是6.5-7.5。适宜的培养温度为约10-40℃，优选的是26-30℃。培养时间适宜为1-14天，优选2-7天。在培养过程中，通气和搅拌通常会得到有利的结果。丙酮酸盐，D-甘油醛，乙醇醛，甘氨酸，1-脱氧-D-苏-戊酮糖，4-羟基-L-苏氨酸或其适当的组合在培养基中的存在对维生素B6的滴定度更有利，因此其存在是优选的。作为维生素B6生产的补充，1-脱氧-D-苏-戊酮糖和4-羟基-L-苏氨酸的组合的特别有效的。还可以通过在有适当pH的缓冲液中培养从培养液中分离的根瘤菌属微生物来生产维生素B6，所述缓冲液含有适当组合的D-甘油醛，乙醇醛，甘氨酸，1-脱氧-D-苏-戊酮糖，4-羟基-L-苏氨酸。培养后，从培养液中分离生产的维生素B6，然后纯化。为了达到该目的，利用维生素B6的特性可以使用从培养液中分离维生素B6的常用方法。因此，如从培养液中除去细胞后，用离子交换树脂或相似的方法纯化在滤液中的所需物质。洗脱后，从醇中再结晶所需的物质。
根据本发明所用的微生物包括属于根瘤菌属的所有菌株，它们能够生产维生素B6并且被保藏在任何人要求后均可得到的公开的保藏机构(收集中心)，如Institute of Fermintation Osaka，Japan(IFO)，the Ministry ofagricuture，Forestry and Feshery，Japan(MAFF)或the Institute ofApplied Microbiology，the University of Tokyo，Japan(IAM)；所述保藏菌株的实例是苜蓿根瘤菌IFO14782，苜蓿根瘤菌MAFF303040，苜蓿根瘤菌MAFF303047，苜蓿根瘤菌MAFF303097，Rhizobium trropiciIFO15247，Rhizobium huakuii IFO 15243，豌豆根瘤菌IFO 14778，Rhizobium galegae IFO 14965，Rhizobium fredii IFO 14780，Rhizobiumloti IFO 14998，Rhizobium sp.IAM 13623和Rhizobium sp.IAM 13631。在根瘤菌属的这些菌株中特别优选的是苜蓿根瘤菌IFO14782和Rhizobiumtrropici IFO15247。苜蓿根瘤菌IFO14782和Rhizobium trropiciIFO15247还于1995年9月4日被保藏在德国的DSM(DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkultren GmbH)，保藏号分别为DSM 10226和10227。
通过下列实施例将更详细地说明本发明；但是应理解本发明不限于这些特定的实施例。
实施例1
将在含0.1％酵母提取物(Difco)，0.5％甘露醇，0.07％K2HPO4，0.01％KH2PO4，0.1％MgSO4·7H2O和1.5％琼脂(pH7.0)的琼脂培养基上生长的一菌环量苜蓿根瘤菌IFO14782(DSM No.10226)接种到含5ml种子培养基的试管中，所述种子培养基含1％葡萄糖，0.5％聚胨(Nippon Seiyaku Co.，Japan)，0.2％酵母提取物(Difco)，0.1％KH2PO4，0.05％MgSO4·7H2O，0.001％MnSO4·5H2O和0.001％FeSO4·7H2O，然后在28℃将试管在往复振荡器(285rpm)上振荡17小时。将4ml种子培养物接种到带2个隔板，含200ml培养基的500-ml烧瓶中，所述培养基含4％葡萄糖，4％聚胨S(Nippon SeiyakuCo.，Japan)，0.8％酵母提取物(Difco)，0.05％MgSO4·7H2O，0.05％MnSO4·5H2O，0.001％FeSO4·7H2O和一滴消泡剂CA-115(Nippon Seiyaku Co.，Japan)，然后在28℃旋转振荡(180rpm)培养烧瓶。培养168小时后，按如下所述，用卡尔斯伯糖酵母ATCC9080，通过浊度法检测培养上清液维生素B6的含量。用蒸馏水将所述上清液和吡哆醇(0-100mg/l)标准溶液系列稀释到1.731×10-4。依次将200μl稀释的溶液，1.5ml蒸馏水和40μ1.155NH2SO4加到试管中。于120℃高压灭菌20分钟后，将1.5ml含卡尔斯伯糖酵母ATCC9080的维生素B6的检测培养基(Nissri Co.，Japan)加到试管中，在28℃以30°角培养。培养17小时后，通过加入5ml 0.2N的盐酸使细胞停止生长，然后测量在660nm的吸收值。将样品的浊度与卡尔斯伯糖酵母ATCC 9080的标准生长曲线比较，从而确定样品中的维生素B6量。结果，168小时培养液的上清液每升含84mg维生素B6。此外，将100μl 4’-脱氧-吡哆醇(100mg/l)作为内物质加到168小时培养液的上清液中后，在Capcell pakC18 SG120柱(4.6×250mm，Shiseido Co.，Japan)上，用HPLC系统，在λ＝292nm，以1.0ml/分的流速用0.1M高氯酸钠，0.1M磷酸钾和2％乙腈(pH3.5)混合溶剂分析混合物，所述HPLC系统由Waters Model600E系统控制器，Waters Model 600F泵，Waters Model 99J光敏二极管箭头指示标记，Waters Model 700卫星WISP样品注射器和Waters5200打印机组成。结果发现所述上清液每升含有78.6mg吡哆醇。
实施例2
用与实施例1中所述相似的方法，培养苜蓿根瘤菌MAFF303040，苜蓿根瘤菌MAFF303047，苜蓿根瘤菌303097，Rhizobium huakuii IFO15243，豌豆根瘤菌IFO14778，Rhizobium trropici IFO15247(DSMNo.10227)Rhizobium galegae IFO 14965，Rhizobium fredii IFO14780，Rhizobium loti IFO，Rhizobium sp.IAM 13623和Rhizobiumsp.IAM 13631。在每个菌株均培养168小时后，通过使用卡尔斯伯糖酵母ATCC 9080的浊度法，检测培养液上清液中维生素B6的含量。结果示于表1。
表1用根瘤菌菌株生产维生素B6根瘤菌菌株 维生素B6(mg/L)苜蓿根瘤菌MAFF 303040苜蓿根瘤菌MAFF 303047苜蓿根瘤菌MAFF 303097Rhizobium huakii IFO 15243Rhizobium leguminosarum IFO 14778Rhizobium tropici IFO 15247Rhizobium galegae IFO 14965Rhizobium fredii IFO 14780Rhizobium loti IFO 14998Rhizobium sp.LAM 13623Rhizobium sp.LAM 13631 10.8 30.5 11.6 19.7 9.85 9.00 7.81 4.02 10.3 6.70 5.11
实施例3
从与实施例1所述相同的条件下制备的苜蓿根瘤菌IFO14782(DSMNo.10226)的培养液中回收维生素B6。通过使用卡尔斯伯糖酵母ATCC9080的浊度法确定各纯化步骤中维生素B6的浓度。将1升168小时的培养液以8000rpm离心10分钟。用1N盐酸将所得上清液的pH调到3.1，然后将上清液加到装有350ml Amberlite CG120(H+形式，100-200目，Organo Co.Ltd)的柱(3.6×40cm)。用300ml去离子水洗涤该柱，然后用5％氢氧化铵洗脱。减压浓缩维生素B6组分。将由此所得的残留物溶解在10ml 0.01M甲酸铵(pH3.2)中。将该溶液加到装有180mlDowex 50wx8(铵形式，200-400目，Dow Chemical Co.Ltd U.S.A.)的柱(2.4×40cm)上。用200ml 0.01M甲酸铵(pH3.2)洗柱。然后用200ml 0.05M甲酸铵(pH4.25)的起始缓冲液，接着用200ml各0.05M和0.5M甲酸铵(pH7.0)缓冲液的线性梯度将柱展开。色谱得到有抗卡尔斯伯糖酵母ATCC 9080生长活性的一个主峰和2个小峰。将主峰的组分减压浓缩到小体积，用1N盐酸将溶液pH调到3.1，然后将溶液加到装有75mlAmberlite CG 120(H+形式，100-200目)的柱(1.8×40cm)上。用150ml去离子水洗涤该柱，然后用5％氢氧化铵洗脱。减压浓缩具有抗卡尔斯伯糖酵母ATCC 9080生长活性的组分。将固体残留物溶解在少量热乙醇中，将所述溶液在4℃过夜保持。通过过滤收集所得的沉淀，真空干燥以得到51mg的粗晶体。将这些从乙醇中再结晶以得到44mg熔点为160℃的白色晶体。产物的红外吸收值，UV吸收值和NMR谱与真正的吡哆醇的一致。另一方面，在实施例1中所述的分析条件下用HPLC分析与有抗卡尔斯伯糖酵母ATCC 9080生长活性的两个小峰，并且证明分别是吡哆胺和吡哆醛。
实施例4
在与实施例1相同的培养条件下制备Rhizobium trropici IFO15247(DSM No.10227)的种子培养物。将4ml种子培养物接种到两个含200ml培养基的500ml烧瓶中，所述培养基含有2％葡萄糖，1％聚胨，0.2％酵母提取物(Difco)，0.05％MgSO4·7H2O，0.05％MnSO4·5H2O和0.001％FeSO4·7H2O和一滴消泡剂CA-115。另外将4ml含1％1-脱氧-D-苏-戊酮糖(下文称为DTP)和1％4-羟基-L-苏氨酸(下文称为HT)的灭菌水加到一个烧瓶中，将4ml灭菌水加到另一烧瓶中。在28℃旋转振荡器(180rpm)上振荡这两个烧瓶。在28℃培养96小时后，按实施例1中所述，通过使用卡尔斯伯糖酵母ATCC 9080的浊度法检测培养液上清液中维生素B6的含量。正如表2中所总结的，在含用DTP和HT补充的培养基的烧瓶中每升生产45mg维生素B6，而在不含DTP和HT的培养基的烧瓶中每升只生产3.16mg维生素B6。此外，用实施例3中描述的方法，从1升用各0.02％的DTP和HT补充的96小时培养液中分离得到了19.3mg熔点为159.5℃白色晶体。所述产物的红外吸收值，UV吸收值和NMR与真正吡哆醇的一致。表2用Rhizobium trropici IFO15247(DSM No.10227)生产的维生素R6 培养基 维生素B6(mg/l)用DTP和HT补充的培养基 45.0不含DTP和HT的培养基 3.16DTP：1-脱氧-D-苏-戊酮糖，HT：4-羟基-L-苏氨酸
实施例5
在与实施例1所述相同的培养条件下培养苜蓿根瘤菌IFO 14782(DSM No.10226)。在28℃培养72小时后，以8000rpm离心10分钟收集细胞，用100ml灭菌的0.85％氯化钠溶液洗涤两次，然后悬浮在88ml灭菌蒸馏水中。于28℃在含10ml 0.1M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)的试管中往复振荡(285rpm)完成维生素B6的生产，所述缓冲液含有0.02％DTP，0，24％乙醇醛，0.24％甘氨酸和细胞悬浮液(在600nm的最后光密度＝20/ml)。在28℃振荡24小时后，在与实施例1所述相同的分析条件下用HPLC确定反应混合物上清液中的维生素B6。正如在表3中所总结的，从DTP，乙醇醛和甘氨酸生产出9.66mg/l吡哆醇。表3用苜蓿根瘤菌IFO14782(DSM No.10226)从DTP，乙醇醛和甘氨酸生产吡哆醇 底物 吡哆醇(mg/l)DTP＋乙醇醛＋甘氨酸 9.66无 0DTP：1-脱氧-D-苏-戊酮糖
实施例6
用与实施例5所述相同的方法制备苜蓿根瘤菌IFO 14782(DSM No.10226)的洗涤的细胞悬浮液。在28℃含10ml 0.1M Tris-HCl缓冲液(pH7.6)和洗涤的细胞悬浮液(在60nm的最后光密度＝20/ml)的试管中往复振荡(285rpm)完成维生素B6的生产，所述缓冲液由0.24％丙酮酸盐，0.24％D-甘油醛和0.02％HT组成。在28℃培养24小时后，按实施例1中描述的分析条件用HPLC得到反应混合物上清液中的维生素B6。正如表4中所总结的，从丙酮酸盐，D-甘油醛，和HT每升生产了9.66mg吡哆醇。表4用苜蓿根瘤菌IFO 14782(DSM No.10226)从丙酮酸盐，D-甘油醛，和HT生产吡哆醛 底物 吡哆醇(mg/l)丙酮酸＋D-甘油醛＋HT 10.1无 0
实施例7
用与实施例5所述相同的方法制备苜蓿根瘤菌IFO 14782(DSM No.10226)的洗涤的细胞悬浮液。在28℃含10ml 0.1M Tris-HCl缓冲液(pH7.6)和洗涤的细胞悬浮液(在600nm的最终光密度为20/ml)的试管中往复振荡(285rpm)完成维生素B6的生产，所述缓冲液由0.24％丙酮酸盐，0.24％D-甘油醛、0.24％乙醇醛和0.24％甘氨酸组成。在28℃培养24小时后，按实施例1中描述的分析条件用HPLC得到反应混合物上清液中的维生素B6。正如表5中所总结的，从丙酮酸盐，D-甘氨酸醛，乙醇醛和甘氨酸每升生产了9.66mg吡哆醇。表5用苜蓿根瘤菌IFO 14782(DSM No.10226)从丙酮酸盐，D-甘氨酸醛，乙醇醛和甘氨酸生产吡哆醛 底物 吡哆醇(mg/l)丙酮酸＋D-甘氨酸醛＋乙醇醛＋甘氨酸 9.66无 0